Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

O objetivo geral deste método derivado de peptídeos é transportar genes e proteínas através de barreiras celulares e organelares em plantas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave por meio da modificação de plantas por meio de conjugados peptídicos racionalmente projetados que fornecem vários genes e proteínas para mediar a expressão de genes específicos. A vantagem imediata dessa técnica é que ela emprega um procedimento simples de transfecção assistida por seringa de folhas de plantas que é baseado em peptídeos que podem transcender os limites celulares e organelares.

Desenvolvemos este método de transformação de plantas simples, eficaz e inovador porque os métodos convencionais são caros, não aplicáveis a alguns tipos de plantas e incapazes de atingir organelheiros intracelulares. Jo-Ann Church demonstrará o procedimento com Yoko Horii, uma técnica do meu laboratório. Prepare a formulação de DNA plasmático peptídico conforme descrito no protocolo de texto.

Quando o peptídeo é adicionado ao DNA plasmático, uma solução turva se forma. A mistura torna-se límpida após diluição com água ultrapura até o volume final especificado no protocolo de texto. Transfira 800 microlitros da solução diluída para uma cubeta para análise dinâmica de espalhamento de luz.

Determine o diâmetro hirodinâmico e o índice de polidispersidade dos complexos formados com um zetananosizador. Usando um laser de néon de hélio de 633 nanômetros a 25 graus Celsius com um ângulo de detecção de retroespalhamento de 173 graus. Após as medições de tamanho, transfira a solução para uma célula capilar dobrada para medições de potencial zeta nos parâmetros padrão da constante dielétrica, índice de refração e viscosidade da água a 25 graus Celsius.

Para observar a solução complexa por microscopia de força atômica, deposite 10 microlitros na superfície clivada recém-exposta de uma folha de mica e deixe a mica secar ao ar durante a noite em uma placa de Petri de plástico coberta. Adquira uma imagem dos complexos no ar a 25 graus Celsius usando um cantilever de silício com uma constante de mola de 1,3 newtons por metro no modo de derivação. Use Arabidopsis thaliana de três semanas cultivada sob um ciclo de 16 horas de luz, 8 horas de escuridão, a 22 graus Celsius.

Escolha pelo menos três folhas para transpecção para servir como triplicado para a quantificação da expressão gênica. Carregue uma seringa de plástico sem agulha de um mililitro com 100 microlitros de solução complexa para a transfecção de uma folha. Em seguida, posicione a ponta da seringa na superfície abaxial da folha.

Pressione ligeiramente a ponta da seringa contra a folha e pressione o êmbolo da seringa lentamente enquanto exerce uma contrapressão com o dedo indicador de uma mão enluvada de látex do lado oposto. A infiltração bem-sucedida pode ser observada como a propagação de uma área encharcada de água na folha. Rotule as folhas infiltradas para facilitar a identificação.

Incube a planta transfectada com DNA de plasma peptídico por 12 horas em uma câmara de crescimento. Para avaliar a eficiência da transfecção, primeiro excise toda a folha transfectada. Para experimentos de transfecção usando o vetor repórter Renilla Luciferase, determine a eficiência da transfecção quantitativamente usando um kit de ensaio Renilla Luciferase.

Primeiro, coloque cada folha excisada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Adicione 100 microlitros de 1X Lysis Buffer por tubo. Da mesma forma, preparar lisados de folhas de controle não transfectadas em triplicata.

Moer a folha usando um pilão de homogeneização e incubar o lisado resultante a 25 graus Celsius por seis a 10 horas. Após a incubação, centrifugar o lisado a 12 470 vezes g numa microcentrífuga durante um minuto. Transfira 20 microlitros do lisado limpo para um poço em uma microplaca de 96 poços.

Use o volume restante para quantificação da concentração de proteína total usando um kit de ensaio de proteína BCA de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, adicione 100 microlitros de substrato de ensaio Renilla Luciferase de uma vez no poço e misture por pipetagem lenta. Coloque a microplaca em um leitor de microplacas multimodo e inicie a medição.

Para experimentos de transfecção usando um vetor repórter de proteína fluorescente verde, observe a fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser. Primeiro, corte as bordas de uma folha inteira para ajudar na remoção dos espaços de ar. Em seguida, retire o êmbolo de uma seringa de 10 mililitros e coloque cada folha ou secção de folha excisada na seringa.

Substitua o êmbolo e empurre-o suavemente para o fundo da seringa sem esmagar a folha. Puxe água para a seringa até que esteja aproximadamente cheia até a metade. Aponte a seringa para cima e empurre o êmbolo para remover o ar da seringa pela ponta.

Em seguida, cubra a ponta da seringa e puxe o êmbolo para baixo lentamente para expelir o ar da folha. Repita esse processo várias vezes até que a folha pareça translúcida. Em seguida, cubra a superfície de uma lâmina de microscópio com fita adesiva.

Corte uma área quadrada na fita grande o suficiente para acomodar a amostra de folha usando uma lâmina e retire o pedaço quadrado de fita com uma pinça para criar uma câmara de amostra. A fita servirá como um espaçador entre o slide e a lamínula. Coloque a folha na câmara com a superfície abaxial voltada para cima e encha a área restante da câmara com água.

Sele a folha dentro da câmara com uma lamínula de vidro e prenda as bordas da lamínula com fita adesiva. Examine a amostra de folha usando um microscópio confocal de varredura a laser sob uma objetiva de 40x ou uma objetiva de imersão em água de 63x. A fluorescência GFP pode ser visualizada em um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros.

Uma preparação ideal da formulação de DNA plasmático peptídico em uma proporção peptídeo-DNA de 0,5 deve ter um diâmetro médio de aproximadamente 290 nanômetros e um baixo índice de polidispersidade de aproximadamente 0,3, o que indica uma distribuição de tamanho uniforme. Além disso, os complexos devem exibir um potencial zeta de aproximadamente 30 milivolts. Uma imagem representativa do microscópio de força atômica dos complexos de DNA do plasma do peptídeo é mostrada aqui.

Foram observados complexos globulares homogêneos. Usando a formulação de DNA plasmático peptídico, a entrega e a expressão de DNA plasmático direcionadas ao núcleo podem ser alcançadas em Arabidopsis thaliana com um valor estimado de Renilla Luciferase por miligrama de aproximadamente 100.000. A observação microscópica foi realizada em folhas tratadas com complexos preparados usando DNA plasmático, codificando o repórter GFP para avaliar a expressão gênica.

As imagens revelaram que em células transfectadas com complexos de DNA plasmático de peptídeos não-alvo, a fluorescência verde difusa correspondente à expressão de GFP foi claramente observada e localizada no citosol. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biotecnologia vegetal entregarem várias cargas à base de proteínas e ácidos nucléicos em plantas vivas. Depois de assistir a este vídeo e ler o protocolo de texto, você deve ter uma boa compreensão de como preparar, caracterizar e aplicar várias moléculas otimizadas para cada tipo de carga, que incluem o DNA plasmático, DNA ou RNA de fita dupla e proteína.