Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

O objetivo geral deste método derivado de peptídeos é transportar genes e proteínas através de barreiras celulares e organoides em plantas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais por meio da modificação de plantas via conjugados peptídicos racionalmente projetados, que entregam diversos genes e proteínas para mediar a expressão de genes específicos. A vantagem imediata desta técnica é que ela emprega um procedimento simples de transfeção assistida por seringa em folhas de plantas, baseado em peptídeos que podem atravessar fronteiras celulares e organoides.

Desenvolvemos este método simples, eficaz e novo de transformação vegetal porque os métodos convencionais são onerosos, não aplicáveis a alguns tipos de plantas e incapazes de direcionar organelas intracelulares. Jo-Ann Church demonstrará o procedimento com Yoko Horii, uma técnica do meu laboratório. Prepare a formulação de DNA de plasma peptídico conforme descrito no protocolo textual.

Quando o peptídeo é adicionado ao DNA plasmático, formará uma solução turva. A mistura torna-se clara após diluição com água ultrapura até o volume final especificado no protocolo do texto. Transfira 800 microlitros da solução diluída para uma cubeta para análise de espalhamento dinâmico da luz.

Determine o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersidade dos complexos formados com um zetananosizer. Utilize um laser de hélio-neônio de 633 nanômetros a 25 graus Celsius com um ângulo de detecção de retroespalhamento de 173 graus. Após as medições de tamanho, transfira a solução para uma cubeta capilar dobrada para medições de potencial zeta nos parâmetros padrão de constante dielétrica, índice de refração e viscosidade da água a 25 graus Celsius.

Para observar a solução complexa por microscopia de força atômica, deposite 10 microlitros sobre a superfície recém-clivada e exposta de uma lâmina de micaxisto e deixe a micaxisto secar ao ar durante a noite em um recipiente plástico de Petri tampado. Adquira uma imagem dos complexos no ar a 25 graus celsius utilizando um cantiléver de silício com uma constante de mola de 1,3 newtons por metro em modo de batida. Utilize plantas de Arabidopsis thaliana com três semanas de idade, cultivadas em ciclo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a 22 graus celsius.

Escolha pelo menos três folhas para a transfecção, servindo como triplicata para a quantificação da expressão gênica. Carregue uma seringa plástica de um mililitro sem agulha com 100 microlitros da solução complexa para a transfeção de uma folha. Em seguida, posicione a ponta da seringa na superfície abaxial da folha.

Pressione levemente a ponta da seringa contra a folha e empurre lentamente o êmbolo da seringa, exercendo ao mesmo tempo uma pressão contrária com o dedo indicador de uma mão usando luva de látex do lado oposto. A infiltração bem-sucedida pode ser observada pela propagação de uma área encharcada na folha. Identifique as folhas infiltradas para facilitar o reconhecimento.

Incube a planta transfectada com DNA plasmídico de peptídeo por 12 horas em uma câmara de crescimento. Para avaliar a eficiência de transfeção, primeiro excise toda a folha transfectada. Para experimentos de transfeção utilizando o vetor repórter de Luciferase de Renilla, determine quantitativamente a eficiência de transfeção utilizando um kit de ensaio de Luciferase de Renilla.

Primeiro, coloque cada folha excisada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de Tampão de Lise 1X por tubo. Da mesma forma, prepare lisados de folhas controle não transfectadas em triplicata.

Triture a folha usando um pistilo de homogeneização e incube o lisado resultante a 25 graus Celsius por seis a 10 horas. Após a incubação, centrifugue o lisado a 12.470 × g em uma microcentrífuga por um minuto. Transfira 20 microlitros do lisado clarificado para um poço em uma microplaca de 96 poços.

Utilize o volume restante para a quantificação da concentração total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA, de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, adicione 100 microlitros de substrato de ensaio de Renilla Luciferase na concentração de uma vez ao poço e misture por pipetagem lenta. Coloque a microplaca em um leitor multifuncional de microplacas e inicie a medição.

Para experimentos de transfeção utilizando um vetor repórter de proteína verde fluorescente, observe a fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser. Primeiro, corte as bordas de uma folha inteira para auxiliar na remoção dos espaços aéreos. Em seguida, remova o êmbolo de uma seringa de 10 mililitros e coloque cada folha ou seção foliar excisada dentro da seringa.

Substitua o êmbolo e empurre-o suavemente até o fundo da seringa sem esmagar a folha. Aspire água para dentro da seringa até que ela esteja aproximadamente pela metade. Posicione a seringa com a ponta voltada para cima e pressione o êmbolo para remover o ar da seringa através da ponta.

Em seguida, cubra a ponta da seringa e puxe lentamente o êmbolo para expelir o ar da folha. Repita este processo várias vezes até que a folha pareça translúcida. A seguir, cubra a superfície de uma lâmina de microscópio com fita adesiva.

Corte uma área quadrada na fita com tamanho suficiente para acomodar a amostra da folha usando uma lâmina e remova o pedaço quadrado da fita com pinça para criar uma câmara de espécime. A fita funcionará como espaçador entre a lâmina e a lamínula. Coloque a folha na câmara com a superfície abaxial voltada para cima e preencha a área restante da câmara com água.

Sobreponha a lâmina foliar com uma lamínula de vidro e fixe as bordas da lamínula com fita adesiva. Examine a amostra foliar utilizando um microscópio confocal de varredura a laser com objetiva de 40x ou objetiva de imersão em água de 63x. A fluorescência de GFP pode ser visualizada com comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros.

Uma preparação ideal da formulação de DNA plasmidial com peptídeo na razão peptídeo-DNA de 0,5 deve apresentar um diâmetro médio de aproximadamente 290 nanômetros e um baixo índice de polidispersidade de cerca de 0,3, o que indica uma distribuição uniforme de tamanhos. Além disso, os complexos devem exibir um potencial zeta de aproximadamente 30 milivolts. Uma imagem representativa de microscopia de força atômica dos complexos de peptídeo com DNA plasmidial é mostrada aqui.

Foram observados complexos globulares homogêneos. Utilizando a formulação de DNA plasmidial com peptídeo, pode-se alcançar a entrega e expressão direcionadas ao núcleo do DNA plasmidial em Arabidopsis thaliana, com um valor estimado de Renilla Luciferase por miligrama de aproximadamente 100.000. A observação microscópica foi realizada em folhas tratadas com complexos preparados com DNA plasmidial, codificando o repórter GFP, para avaliar a expressão gênica.

As imagens revelaram que, em células transfectadas com complexos de DNA plasmidial e peptídeo não direcionados, uma fluorescência verde difusa correspondente à expressão de GFP foi claramente observada e localizada no citosol. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biotecnologia vegetal entregarem diversas cargas baseadas em proteínas e ácidos nucleicos em plantas vivas. Após assistir a este vídeo e ler o protocolo textual, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, caracterizar e aplicar várias formulações otimizadas para cada tipo de carga, que incluem DNA plasmidial, DNA de fita dupla ou RNA e proteína.