Ensaio de impedância baseado em matriz de três câmaras: uma técnica de análise em tempo real para avaliar o potencial invasivo de células cancerígenas medindo a impedância elétrica

As células estromais associadas ao câncer secretam fatores químicos que podem desencadear as células tumorais metastáticas que residem na membrana basal do tecido. Consequentemente, as células cancerígenas invadem a membrana basal e migram em direção ao espaço extracelular do tecido.

Para medir a capacidade invasiva das células cancerígenas in vitro, comece com uma placa multipoços com várias matrizes de três câmaras. Em cada matriz, a câmara inferior tem uma cultura aderente de células estromais. A câmara superior com microeletrodos de medição de impedância fundida - eletrodos em miniatura que medem a atividade elétrica de uma célula - é sobreposta por células cancerígenas, que aderem à membrana microporosa revestida de matriz extracelular presente acima dos eletrodos.

Durante a incubação em um analisador baseado em impedância, as células estromais liberam fatores quimiotáticos no meio, que se movem em direção às células cancerígenas. Esses fatores se movem através da membrana semipermeável presente na parte inferior da câmara intermediária.

Os fatores secretados por células estromais sinalizam às células cancerígenas aderentes para se transformarem em fenótipos invasivos. Em resposta, as células invasivas migram através da membrana microporosa atingindo os eletrodos interdigitados no lado oposto da membrana.

Com o tempo, à medida que mais células cancerígenas aderem aos eletrodos, elas causam impedância celular - impedimento ao fluxo de corrente pelas células. A medição da impedância celular é indicativa do potencial invasivo das células cancerígenas.

Coloque todas as três câmaras estéreis na capa de cultura de tecidos. Localize o botão no lado curto da câmara inferior e oriente a câmara inferior de modo que o botão fique voltado para o experimentador.

Adicione 30.000 a 50.000 células em 90 microlitros de meio a cada poço da câmara inferior sem formar bolhas. Use 5% de meio suplementado com soro fetal bovino em duas câmaras inferiores como controle positivo para a motilidade celular e use 0% de meio suplementado com soro como controle negativo.

Gire a câmara inferior em 90 graus depois de deixá-la descansar por 10 a 15 minutos no capô. Em seguida, coloque a câmara do meio em cima, de modo que o botão na câmara inferior deslize para dentro do entalhe na câmara do meio. Empurre a câmara verticalmente para baixo, até ouvir um clique de cada um dos lados longos do conjunto.

Adicione 160 microlitros de meio sem soro a todos os poços da câmara intermediária. Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula esteja visível após o enchimento dos poços e coloque a câmara superior, com os eletrodos voltados para baixo, na câmara do meio para alinhar os pontos azuis nas câmaras do meio e superior. Empurre a câmara verticalmente para baixo até ouvir um som de clique em cada um dos lados longos do conjunto.

Adicione 20 a 50 microlitros de meio sem soro à câmara superior. Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura de tecidos e aguarde 30 minutos antes de medir o fundo.

Abra o software analisador de células, selecione o berço a ser usado, seguido de um clique na guia 'Mensagem' e certifique-se de que diz 'Conexões OK' para garantir que a matriz esteja bem posicionada no berço e os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.

Clique na guia 'Notas do experimento' e preencha todas as informações possíveis sobre o experimento. Em seguida, clique na guia 'Layout' e preencha a descrição do layout da matriz. Em seguida, clique na guia 'Agendar' e adicione duas etapas no menu 'Etapas'; uma etapa em segundo plano com uma varredura e uma etapa de teste com 100 varreduras.

Uma vez que a matriz esteja na incubadora do analisador de células de dupla finalidade por 30 minutos, clique no botão 'Play' para iniciar a medição em segundo plano.

Após a medição de fundo, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura de células. Em seguida, adicione 30.000 a 50.000 células em 100 microlitros de meio sem soro a cada poço da câmara superior. Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana.

Deixe o conjunto repousar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de células de dupla finalidade para medição de impedância.

Coloque a matriz de volta no analisador de células de dupla finalidade e verifique a guia 'Mensagem' para a mensagem 'Conexões OK'. Clique no botão 'Play' para iniciar a medição da impedância e, em seguida, clique na guia 'Plot' para monitorar o progresso do sinal.

Se o endpoint for atingido antes de 25 horas, clique na etapa 'Abortar' no menu suspenso 'Executar'. Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha 'Copiar' no formato de lista e, em seguida, cole os dados em uma planilha.