Tecnologia de interferometria de biocamada para detectar interações entre ligante e analito

Para detectar interações ligante-analito usando interferometria de biocamada, BLI, comece com um biossensor de fibra óptica hidratado fixado em um suporte de instrumento BLI, definido para o programa desejado.

A ponta do biossensor é revestida com uma camada biocompatível imobilizada com grupos ácido nitrilotriacético níquel, Ni-NTA. Mergulhe a ponta do biossensor no tampão.

O instrumento emite luz branca em direção ao biossensor, que é refletida de duas interfaces: a referência interna ou camada óptica e a camada biocompatível. Os feixes refletidos interferem construtiva ou destrutivamente em diferentes comprimentos de onda de luz. Um fotodetector detecta o padrão de interferência resultante.

Após a medição da resposta interferométrica da linha de base, adicione uma solução de ligante marcada com histidina. As etiquetas de histidina se ligam a cátions de níquel no biossensor, imobilizando ligantes na ponta.

Após a associação, a luz branca emitida é refletida da camada óptica e a camada biocompatível imobilizada com ligantes com espessura óptica aumentada na ponta. Isso aumenta a distância entre as camadas reflexivas, causando mudança de padrão de interferência e uma mudança de comprimento de onda.

Lave a ponta, removendo os ligantes não ligados. Incubar com solução de analito alvo. O analito se liga ao ligante, aumentando ainda mais a espessura óptica na ponta, causando um aumento do deslocamento do comprimento de onda.

Posicione a ponta do biossensor no tampão. Registre a mudança de comprimento de onda durante a dissociação do analito do ligante imobilizado na ponta.

O monitoramento da mudança no comprimento de onda ao longo do tempo facilita o estudo das interações moleculares entre ligantes e analitos.

Ligue a máquina BLItz. Certifique-se de que a máquina esteja conectada ao computador por meio de uma porta de saída de dados USB na parte traseira da máquina.

No computador, abra o software associado e clique em "Cinética Avançada" no lado esquerdo da tela. No software, digite todas as informações apropriadas sobre o experimento em cada título respectivo. Clique em "Tipo de biossensor" e escolha "Ni-NTA" no menu suspenso. A duração de cada etapa pode ser alterada de Padrão conforme necessário. Para obter os melhores resultados, use um mínimo de 30 segundos para a linha de base inicial e a linha de base e 120 segundos para associação e dissociação.

Remova o biossensor de níquel-NTA hidratado do tubo de PCR e fixe-o no suporte do biossensor na máquina, deslizando a parte larga do biossensor no suporte.

Coloque um tubo de microcentrífuga preto de 0,5 mililitro no suporte do tubo da máquina e pipete 400 microlitros de tampão BLI nele. Feche a tampa da máquina de forma que a ponta do biossensor fique submersa no tampão do tubo da microcentrífuga. Clique em "Avançar" no software para começar a gravar a linha de base inicial.

Depois que a etapa inicial da linha de base terminar de gravar, abra a tampa da máquina. Mova o controle deslizante para a direita. Pipetar 4 microlitros de um ligante dialisado marcado com His no suporte de gotas e fechar a tampa da máquina, que começará automaticamente a registar o passo de carregamento.

Depois que a etapa de carregamento terminar de gravar, abra a tampa da máquina. Mova o controle deslizante para a esquerda, de modo que o suporte do tubo fique novamente situado na frente da seta preta. Feche a tampa da máquina e certifique-se de que a ponta do biossensor esteja submersa no buffer BLI do tubo no suporte do tubo. A máquina e o software começarão automaticamente a registrar a etapa da linha de base.

Depois que a etapa de linha de base terminar de gravar, abra a tampa da máquina. Remova o porta-gotas e limpe-o pipetando qualquer proteína e enxaguando-o com água duplamente deionizada por um total de cinco vezes. Use um lenço de papel para limpar a superfície do porta-gotas após a última lavagem. Recoloque o suporte de queda de volta na máquina. Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de modo que o suporte de queda fique novamente situado na frente da seta preta.

Pipetar 4 microlitros de uma substância a analisar dialisada para o suporte de gotas e fechar a tampa da máquina, que iniciará automaticamente o registo da etapa de associação. Depois que a etapa de associação terminar de gravar, abra a tampa da máquina. Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de modo que o suporte do tubo fique novamente situado na frente da seta preta e feche a tampa da máquina, que começará automaticamente a registrar a etapa de dissociação.