Microscopia eletrônica de transmissão para quantificar a distribuição de glicogênio em músculos esqueléticos humanos

O glicogênio, um polímero de glicose ramificado, é uma reserva de energia nos compartimentos intermiofibrilares, intramiofibrilares e subsarcolemais subcelulares dentro do músculo esquelético humano.

Para quantificar a distribuição de glicogênio subcelular usando microscopia eletrônica de transmissão, TEM, obtenha tecido muscular esquelético humano isolado. Fixe com glutaraldeído para preservar a estrutura do tecido. Fixe o tecido em uma solução de tetróxido de ósmio e ferrocianeto de potássio.

O complexo ósmio-ferrocianeto reduzido liga-se aos grupos hidroxila no glicogênio, melhorando o contraste das partículas de glicogênio no músculo. Além disso, as membranas e o retículo sarcoplasmático - uma organela ligada à membrana - são corados.

Desidratar o tecido em concentrações crescentes de etanol. Incorpore em resina, formando um bloco sólido. Obter cortes ultrafinos com fibras musculares orientadas longitudinalmente; transferir para grades TEM.

Mergulhe as grades em acetato de uranila, solução de metal pesado. Os íons de uranila se ligam a lipídios e proteínas carregados negativamente, tornando-os densos em elétrons. Manchar com solução de citrato de chumbo.

Os íons de chumbo se ligam às regiões coradas de ósmio, incluindo as partículas de glicogênio, aumentando o contraste. Eles também se ligam a regiões reagidas com acetato de uranila, intensificando a opacidade dos elétrons.

Durante a imagem TEM, à medida que os feixes de elétrons passam pelo tecido, as regiões densas em elétrons coradas, incluindo o glicogênio, espalham mais elétrons, enquanto as regiões não coradas transmitem elétrons.

Na imagem MET de alto contraste produzida, as partículas de glicogênio parecem distintas e escuras; as regiões não coradas parecem mais claras, facilitando a visualização e quantificação da distribuição de glicogênio subcelular no músculo.

Isole uma pequena amostra da biópsia muscular ou de todo o músculo, que tem um diâmetro máximo de 1 milímetro em qualquer direção e é mais longo longitudinalmente do que transversalmente.

Coloque a amostra no tubo que contém a solução de fixação primária fria. Armazene-o a 5 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, lave a amostra 4 vezes em tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar. Usando pipetas de transferência, remova o tampão usado do tubo, deixando a amostra intocada, e adicione o tampão novo. Pós-fixar a amostra com tetróxido de ósmio a 1% e ferrocianeto de potássio a 1,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por 120 minutos a 4 graus Celsius.

Enxágue a amostra duas vezes em água bidestilada à temperatura ambiente. Desidratar submergindo em uma série graduada de etanol à temperatura ambiente. Infiltrar a amostra com óxido de propileno e misturas graduadas em resina epossídica à temperatura ambiente usando as proporções de volume mencionadas.

No dia seguinte, embutir amostras em resina epossídica 100% fresca em moldes e polimerizar a 60 graus Celsius por 48 horas.

Monte o bloco de uma amostra no suporte do ultramicrótomo. Apare o bloco na superfície com uma lâmina de barbear para atingir o nível do tecido. Monte uma faca de diamante na frente da amostra e alinhe a superfície da amostra paralela à faca.

Produza uma seção semifina de 1 micrômetro de espessura com a faca de diamante para verificar a orientação da amostra. Manchar a seção semifina com azul de toluidina para observação com microscopia de luz. Em seguida, apare ainda mais o bloco para reduzir a área de interesse para obter seções ultrafinas adequadas.

Corte seções ultrafinas de 60 a 70 nanômetros de espessura com uma segunda faca de diamante. Colete de 1 a 2 seções em grades de cobre de um furo usando um Perfect Loop. Para contrastar as seções, mergulhe as grades em solução de acetato de uranila por 20 minutos e lave as grades em água bidestilada e, em seguida, mergulhe as grades em citrato de chumbo por 15 minutos e lave novamente as grades em água bidestilada

Ligue o microscópio eletrônico de transmissão, o computador e o software de gravação de imagens. Grave imagens digitais com uma câmera CCD digital de varredura lenta e o software de imagem associado. Depois de inserir a grade com várias seções no estágio do microscópio, rastreie a grade inicialmente em baixa ampliação para escolher as seções de melhor qualidade e determine a direção das fibras musculares.

Em seguida, focalize a imagem com ampliação acima de 30.000, com o feixe centralizado em uma fibra periférica na seção, e grave imagens com 1 segundo de tempo de exposição na ampliação desejada. Certifique-se de que as imagens sejam distribuídas por todo o comprimento e largura da fibra em uma ordem aleatória, mas sistemática, para obter resultados imparciais e repita a imagem até que 6 a 10 fibras sejam visualizadas.

Importe imagens para imageJ clicando em Arquivo, seguido de Abrir. Defina a escala global para corresponder ao tamanho original da imagem clicando em Analisar e, em seguida, em Definir escala. Para aumentar o zoom em 100%, clique em Imagem, vá para Zoom e clique em Entrar.

Meça a espessura de um disco Z por imagem do espaço miofibrilar, usando a ferramenta Linha Reta no menu Ferramentas, e calcule a espessura média do disco Z de cada uma das 6 a 10 fibras. Use a ferramenta Linha segmentada para medir o comprimento da miofibrila mais externa, visível logo abaixo da região subsarcolemal.

Para inserir uma grade, clique em Analisar, selecione Ferramentas e, em seguida, selecione Grade. Agora defina a área por ponto em 32.400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos dentro do comprimento disponível, nas 12 imagens subsarcolemais em que uma cruz atinge o glicogênio subsarcolemal.

Insira uma grade clicando em Analisar, selecione Ferramentas, seguido por Grade e defina Área por ponto em 160.000 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares, onde uma cruz atinge o espaço intramiofibrilar.

Então, novamente, para inserir uma grade, clique em Analisar, selecione Ferramentas e, em seguida, selecione Grade. Agora, defina a área por ponto em 3.600 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares em que uma cruz atinge o glicogênio intramiofibrilar.

Insira uma grade clicando em Analisar, selecione Ferramentas, seguido de Grade e defina a Área por ponto em 32.400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos nas 12 imagens miofibrilares em que uma cruz atinge o glicogênio intermiofibrilar.

Usando a grade de 32.400 nanômetros quadrados para escolher aleatoriamente as partículas de glicogênio, comece com o quadrado superior esquerdo e mova para a esquerda, se necessário. Usando a ferramenta Linha reta, meça o diâmetro de 5 partículas de glicogênio escolhidas aleatoriamente de cada poça para cada uma das 12 imagens para obter uma média de 60 partículas por poça por fibra.