Variações na negativa mancham métodos de microscopia eletrônica: ferramentas para enfrentar o desafio sistemas

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar várias variações diferentes nas técnicas de preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa. A coloração negativa é a melhor maneira de avaliar rapidamente a qualidade de uma amostra EM. É importante reconhecer que diferentes técnicas de preparação de grade funcionam melhor para algumas amostras.

A técnica que funciona melhor para qualquer amostra deve ser determinada por tentativa e erro. Para começar, prepare as grades EM usando o método da folha de carbono e prepare os reagentes de coloração negativa conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Coloque uma grade EM revestida com folha de carbono voltada para cima em uma lâmina de microscópio.

Coloque o slide em uma unidade de descarga incandescente e trate a grade por no mínimo 30 segundos a 10 miliamperes para tornar a grade hidrofílica. Quando terminar, remova a amostra da unidade de descarga. Em seguida, use uma pinça de pressão negativa para segurar a borda da grade.

Para corar usando o método de mancha lateral, primeiro aplique de três a cinco microlitros da amostra na superfície de suporte. Deixe a amostra adsorver na superfície da grade por 10 segundos a um minuto, depois toque a borda da grade em uma folha de papel de filtro e deixe a ação capilar retirar o líquido. Em seguida, coloque gotas de 50 microlitros de água ultrapura ou uma solução tampão volátil apropriada em uma folha de filme de laboratório.

Toque suavemente a superfície de carbono da grade na gota e levante uma pequena gota na superfície da grade. Em seguida, toque a borda da grade em uma folha de papel de filtro e permita que a ação capilar retire o líquido. Em seguida, coloque duas gotas de 50 microlitros de reagente de coloração em uma folha de filme de laboratório.

Toque suavemente a superfície de carbono da grade na gota e levante uma pequena gota na superfície superior da grade. Se a mancha migrar para a parte de trás da grade, o filme de carbono foi quebrado e deve ser descartado. Após 10 a 15 segundos, toque a borda da grade em uma folha de papel de filtro e deixe a ação capilar retirar o líquido.

Repita esta etapa de coloração mais uma vez e deixe a grade secar ao ar. Para manchar a amostra usando o método de flicking, segure a borda da grade com uma pinça de pressão negativa e aplique de três a cinco microlitros de amostra na superfície de suporte. Segurando a pinça em uma mão, incline a grade de modo que fique a aproximadamente 45 graus voltada para longe e mova rapidamente o pulso para retirar a maior parte da gota que está no topo da grade.

Em seguida, use uma pipeta de vidro Pasteur para aplicar uma gota de solução de lavagem na superfície de suporte. Retire a gota e repita algumas vezes para lavar a amostra. Em seguida, aplique uma gota de reagente de coloração na superfície de suporte e retire novamente a gota.

Repita esta etapa de coloração uma a três vezes, dependendo da profundidade da mancha necessária para a visualização da amostra. Remova o excesso de manchas tocando a borda rasgada de um pedaço de papel de filtro na borda da grade e deixe a grade secar ao ar. Para corar a amostra usando o método de lavagem rápida, primeiro coloque 30 a 70 microlitros de mancha na ponta de uma pipeta de 200 microlitros.

Gire o botão de volume para aspirar cinco microlitros de ar e, em seguida, aspire de cinco a 30 microlitros do reagente de lavagem, seguido por outro pequeno espaço de ar, antes de outros cinco microlitros de amostra. Segure a borda de uma grade com uma pinça de pressão negativa e incline a grade aproximadamente 45 graus voltada para longe. Em um movimento rápido, ejete todo o conteúdo da ponta da pipeta na face da grade EM revestida de carbono.

Remova o excesso de manchas tocando a borda rasgada de um pedaço de papel de filtro na borda da grade e deixe a grade secar ao ar. A escolha ideal para uma mancha negativa é altamente dependente da amostra. A coloração mais comumente usada é o acetato de uranila, mas também podem ser usadas manchas de lantanídeos.

Para amostras profundamente incorporadas, as colorações à base de lantanídeos, acetato de túlio e acetato de érbio, produziram coloração negativa de qualidade equivalente ao acetato de uranila, conforme julgado pelo aparente contraste e nitidez das partículas coradas, com o acetato de túlio produzindo imagens mais claras e nítidas do que o acetato de érbio. O grande tamanho de grão do acetato de túlio torna-se aparente em alta ampliação, mostrado aqui quando uma amostra de partículas fibrosas do mosaico do tabaco foi corada com acetato de túlio a 1%. Usando acetato de túlio, a repetição de 23 angstrom da partícula fibrosa do mosaico do tabaco é claramente visível a olho nu.

Nenhuma das outras colorações de lantanídeos testadas foi capaz de resolver essa característica. Outra amostra difícil de visualizar é a proteína C derivada do músculo. Esta amostra produz imagens significativamente diferentes, dependendo do método de coloração.

Quando corado com um método de mancha lateral, aparece como uma estrutura globular em forma de asa colapsada. Quando as grades são preparadas pelo método de flicking, a proteína C é observada como uma série de domínios que se assemelham a contas em uma corda. Isso representa melhor a estrutura real da proteína C.

Uma vez dominado, leva apenas cerca de um minuto para preparar uma amostra com coloração negativa. É importante lembrar que cada amostra responde de maneira diferente a cada técnica de coloração. Para novas amostras, a melhor abordagem deve ser determinada experimentalmente.

Não se esqueça de que os reagentes de coloração de uranila são tóxicos e ligeiramente radioativos. Certifique-se de que eles sejam descartados em um fluxo de resíduos adequado.