Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é uma doença do sistema nervoso central. Os autoanticorpos têm como alvo a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina, MOG, na bainha de mielina dos neurônios, causando destruição da mielina e degeneração nervosa.

A indução de EAE em camundongos requer a injeção de uma emulsão adjuvante de antígeno do autoantígeno MOG misturado com um adjuvante - contendo um antígeno bacteriano - para aumentar a resposta imune.

Para preparar a emulsão, tome uma suspensão aquosa de MOG em um tubo homogeneizador. Coloque o tubo no gelo, evitando a degradação do antígeno.

Adicione o adjuvante - bactérias patogênicas inativadas dispersas em uma fase oleosa. Coloque o tubo dentro de um homogeneizador agitador. O tremor causa turbulência no fluido, gerando uma emulsão.

Sob um microscópio, a emulsão mostra gotículas aquosas uniformemente dispersas, de tamanho micro - contendo MOG - dentro de uma fase oleosa contínua. A homogeneidade da emulsão garante maior reprodutibilidade da indução da doença.

Para injetar a emulsão em uma cepa suscetível de camundongos, coloque uma seringa na frente do tubo e transfira a emulsão para ele. Pegue um camundongo anestesiado e injete a emulsão por via subcutânea.

Após a injeção, o óleo na emulsão garante a liberação lenta e sustentada do antígeno, aumentando a duração da resposta imune.

O patógeno inativado na emulsão causa uma resposta inflamatória localizada, recrutando células imunes para o local da injeção. As células imunes recrutadas reconhecem o antígeno MOG liberado e estimulam a produção de anticorpos, levando à indução de EAE.

Coloque o tubo com tampa de rosca em reagentes para serem usados no gelo. Em seguida, adicione os componentes de emulsão. Primeiro, PBS, depois, o peptídeo, a pasta CFA e, finalmente, IFA. Feche o tubo com a tampa firmemente, apertando-o e afrouxando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente por 5 a 10 segundos com a mão para pré-misturar os reagentes.

Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 segundos. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por 3 minutos e repita a corrida mais 1 ou 2 vezes com as mesmas configurações. Centrifugue o tubo a 300 x g por 1 minuto para remover o ar preso e compactar a emulsão. Remova a tampa do tubo, insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão. Remova o invólucro de encaixe na parte inferior do tubo girando-o.

Em seguida, remova o êmbolo de todas as seringas de injeção e adicione uma agulha às seringas de injeção. Em seguida, conecte a extremidade traseira da seringa de injeção à trava dedicada na parte inferior do tubo e trave-a com um pequeno giro. Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injecção, empurrando suavemente o êmbolo.

Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 mililitro da seringa de injeção. Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo com cuidado, tomando cuidado para que nenhum ar entre na seringa. Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha e repita o processo para o resto da emulsão presente no tubo.

Para analisar o tamanho das partículas de água em óleo, adicione uma pequena gota da emulsão a uma lâmina de microscópio, esfregue-a com uma lamínula e, em seguida, empurre com força em movimentos circulares para achatar a emulsão.

Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão. Certifique-se de que partículas pequenas e uniformes de cinza ou branco sejam visíveis.