Name: Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a visualizar DNA recombinante e complexos de proteínas usando microscopia de força atômica em condições fisiológicas. Este método permite analisar tamanho, quantidade e organização de biomoléculas em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant GM086822. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. de Washington Facility Usuário Nanotecnologia (NTUF)) e Andrea Slade (Bruker AXS) para a sua assistência técnica especializada. DNA AFM foi realizado na Univ. de Washington NTUF, membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura. O plasmídeo 2xGal4-2xGRE-luciferease foi gentilmente cedido pelo laboratório do Dr. Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco).

1. Preparação de amostras de DNA e proteínas a ser trabalhada livre de contaminantes <ol><li> Biomoléculas isolar a ser trabalhada e coloque em um tampão adequado aquosa. Proteínas a ser trabalhada pode ser purificado por cromatografia líquida de 6 de imunoadsorção seguida da remoção de anticorpos e pellet 1,2, ou purificação Profinity eXact e remoção tag 7 (Figura 2A). Isolar moléculas de DNA a ser trabalhada por miniprep purificação (Figura 2B). </li><li> Confirmar composição e pureza das amostras de proteína para ser fotografada usando SDS-PAGE e Western blotting. Para DNA, confirme seqüência e pureza, completando uma restrição digestão e eletroforese em gel de agarose. </li><li> Incubar as amostras em um tampão de adsorção AFM para promover a adesão da amostra a mica. Para amostras de proteínas, 10 mM tampão HEPES pode ser usado. Adicionais de sais de baixa força iônica ou co-fatores podem ser adicionados outros também. Para amostras de DNA, incluem um cátion bivalente (por exemplo, Mg 2 + ou Ni 2 +) para promover a adsorção ao substrato mica. A Mg 2 + adequada, contendo tampão de DNA é de 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Ni uma alternativa buffer de 2 + é de 10 mM HEPES, pH 6.8, 10 mM NiCl 2. </li><li> Diluir a amostra a uma concentração de 5 mg / ml em tampão de adsorção. Misturar suavemente. Loja no gelo, enquanto o microscópio está sendo preparada. </li></ol> 2. Montagem AFM sonda <ol><li> Coloque o suporte da sonda líquido da célula para a correspondente estação de acoplamento cantilever instalação. </li><li> Localize o cantilever, longos e grossos (referido como o cantilever 'B') da sonda de nitreto de alavanca afiada (SNL) a ser utilizado para geração de imagens. Cuidadosamente transferi-lo para o titular líquido celular sonda, assegurando que a ponta permanece em pé. Nota técnica: Extremo cuidado deve ser pago, enquanto a sonda está em trânsito, como deixá-la cair de qualquer altura pode danificar ou destruir o cantilever ou ponta. A microlever SNL sonda (MSNL) pode ser usado como uma alternativa à sonda SNL. </li><li> Remova o suporte da sonda da estação de ancoragem e examinar o cantilever sob um microscópio de luz para assegurar que ele está intacto e devidamente sentado no porta-líquido celular sonda. </li><li> Remova cuidadosamente a cabeça AFM do conjunto se encaixam instrumento, apertando o parafuso de fixação serrilhado cabeça. Nota técnica: Extremo cuidado deve ser paga enquanto manipulando a cabeça AFM, como deixá-la cair até mesmo a uma curta distância (por exemplo, se não estão encaixados corretamente na montagem se encaixam) pode causar danos substanciais. </li><li> Inverter a cabeça AFM e empurre o suporte da sonda líquido da célula para os quatro pinos na base da cabeça AFM. Voltar cuidadosamente a cabeça AFM no conjunto se encaixam instrumento. Solte o parafuso de fixação da cabeça serrilhada para prender a cabeça AFM no instrumento. </li></ol> 3. Localizando ponta cantilever, alinhando laser, e ajustando fotodetector <ol><li> Usando o software do aparelho AFM, localize a ponta cantilever movendo os botões do microscópio de luz a bordo. Ajustar a iluminação do microscópio, se necessário para melhorar a identificação ponta. Trazer o fim da ponta do cantilever em estreita proximidade da mira exibido no software do aparelho. </li><li> Traga a ponta cantilever em foco, ajustando as setas para cima e para baixo do controlador de ótica sobre o software. Use lento (S) ou velocidade média (M) enquanto ajusta o sistema ótico. </li><li> Alinhar o laser na ponta cantilever usando os botões de ajuste laser. Mova os botões de ajuste até o ponto de laser vermelho está dentro do local de iluminação branca. Traço ao longo do braço cantilever usando um padrão zig-zag até que o laser é posicionado na ponta cantilever. Quando devidamente alinhados, um ponto forte reflexo aparecerá na janela da frente da cabeça AFM. </li><li> Centro do fotodetector, ajustando os botões fotodetector na cabeça AFM. Isso irá alinhar o ponto de laser na mira do visor fotodetector do software do aparelho. A soma do sinal observado deve ser de aproximadamente 4-6. </li></ol> 4. Posicionamento da cabeça e AFM cantilever ajuste <ol><li> Coloque uma folha recém-clivada de mica ligado a um disco de metal espécime AFM no porta-amostras magnetizadas em cima do suporte da placa AFM. Esta configuração será usada para posicionar a cabeça antes de AFM imagem da amostra de DNA ou proteína preparada na Etapa 1. <ol><li> Nota técnica: O porta-amostras magnetizadas e suporte da sonda líquidos celulares são mais espessas do que outra amostra de fixação de mecanismos e os detentores da sonda. Se existe actualmente depuração insuficiente entre o conjunto do suporte de amostra-mica e cabeça AFM, mover a cabeça até AFM, selecionando o ícone retirar no software do aparelho várias vezes. </li></ol></li><li> Gire o suporte da placa AFM para o disco de amostra é posicionada para a imagem inicial. Garantir o substrato de mica está centrada sob a cabeça AFM. </li><li> Mova a cabeça para baixo em direção a AFMsuperfície do disco mica espécimes usando o controle de superfície foco do software do aparelho. Selecione a velocidade média (M) no motor Z, e continuar em direção à superfície até que a cabeça AFM é de aproximadamente 2 mm acima da mica. Neste momento, passar a usar o lento (S) Z velocidade do motor, a fim de evitar o contato brusco entre a sonda ea superfície (referido como bater a ponta). </li><li> Proceder para mover a sonda mais próxima à superfície do substrato de mica até características distintas na superfície mica ou o reflexo ponta estão em foco. Alternar entre a superfície e aviões ponta reflexão focal usando a "concentrar-se:" ícone do software do aparelho. </li><li> Selecionar o ícone de sintonia do software do aparelho e ajustar o cantilever. A frequência de ressonância do SNL recomendado e sondas cantilever MSNL é kHz 20-60. Selecione um pico de 5% offset. Nota técnica: tuning cantilever adequada é essencial para a imagem de amostra adequado. </li></ol> 5. Imagens da superfície da amostra mica <ol><li> Envolver a sonda sobre a superfície mica. Defina o tamanho da verificação inicial a 10 mm e taxa de varredura de 1 Hz. Ganho integral e ganho proporcional pode ser inicialmente definido como 0,2 e 0,4, respectivamente. Ajustar os ganhos, se necessário, a fim de ter traço e scans refazer cerca de sobreposição. Diminuindo a amplitude setpoint irá aumentar a interação entre a sonda ea mica e garantir engajamento. </li><li> Capturar imagens varredura completa do campo M 10. Diminuir o tamanho de digitalização a 5, 1 e 0,5 micron e capturar imagens completas de cada campo. Ajustar os ganhos e velocidade de varredura, se necessário. Captura de imagens da superfície de mica fornece uma base para comparação com o DNA e proteínas contendo amostras. </li><li> Desengatar a sonda com um único clique no ícone desengatar no software do aparelho. </li></ol> 6. Biomoléculas de interesse de imagem <ol><li> Delicadamente misturar o DNA ou proteínas da amostra preparada na Etapa 1 e se preparar para carregá-lo sobre a superfície de mica trabalhada. Mistura de 5 mL de amostra preparada com 45 mL de tampão de adsorção fresco (concentração da amostra final = 0,5 mg / ml). </li><li> Cuidadosamente adicione 50 ul do 0,5 mg / solução biomolécula contendo ml diretamente na superfície mica. Fazer isso sem mover a cabeça da sonda ou AFM, e assegurar a solução da amostra (mas não ponta da pipeta) faz contato com a sonda. </li><li> Pausa de 5 minutos para permitir que as biomoléculas na amostra para aderir à superfície mica. </li><li> Na conclusão de 5 minutos, uma pipeta mL 50-100 adicionais de tampão de adsorção no suporte líquido celular sonda tendo o cuidado de não tocar na sonda, AFM cabeça, ou mica com a ponta da pipeta. Isto irá formar um menisco e permitir a AFM tocando imagem em modo de fluido. Figura 3 mostra o arranjo final da célula de fluidos, cantilever, amostra, titular da amostra, e menisco. </li><li> Reajustar a célula fotoeléctrica e realinhar a laser para o cantilever se necessário. Nota técnica: ver a ponta da sonda e alinhamento a laser é complicado devido ao padrão de difração causada pela adição de tampão de amostra para o suporte da sonda. Manualmente sintonizar o cantilever, se necessário. </li><li> Voltar a envolver a sonda usando o software do aparelho. Ajuste de deflexão vertical, ganho integral e ganho proporcional, conforme necessário. Isto irá iniciar o processo de re-imaging a seção de mica digitalizados imediatamente antes da adição da amostra e capturar imagens. </li><li> Aumentar o tamanho do scan (500 nm-10 mm) para identificar regiões de interesse. Zoom-in e reduzir a taxa de varredura de 0,5 Hz para melhorar a resolução da imagem </li><li> Uma vez que imagens é completa, desengatar a sonda selecionando retirar ícone no software do aparelho várias vezes. Garantir espaço suficiente entre a cabeça eo disco AFM espécime antes da desmontagem da célula de líquido ou disco espécime. </li><li> Enxaguar o titular sonda líquido celular e disco de amostra com água destilada para evitar a formação de cristais de sal se evapora como tampão residual de adsorção. Seco com ar comprimido. </li></ol> 7. Resultados representativos: Exemplos de imagens AFM são apresentados na Figura 4. Mica substrato (A) fornece uma superfície plana sobre a qual molecularmente DNA e proteínas podem absorver. Mica de imagem antes de amostras biomolécula fornece um controle negativo e avaliação do ruído de imagem. Ele também oferece um nível de garantia de que o cantilever está devidamente afinada e de imagem de amostra subseqüente será bem sucedido. Double-stranded DNA plasmídeo (B, D), presuntivamente superenrolado, é facilmente identificado por sua aparência assimétrica e uniforme depositar sobre o substrato de mica anteriormente normal. Complexos de proteínas de tamanhos de partículas discretas (C, E) também são distinguíveis exclusivamente a partir do substrato mica. Diferenças de tamanho de partículas indicam heterogeneidade da amostra, e pode ser útil para aproximar estequiometria proteínas complexas ou atividade bioquímica. A forma geral diagonal e orientação consistente do propartículas de proteína observado no painel C é um artefato de imagem, como as proteínas se expectedly ser orientado sobre o substrato de mica de uma forma aleatória. Possíveis causas do artefato observado é uma anormalidade ou física ponta AFM imagens em rápida demais de uma taxa de varredura. Enquanto convolução ponta (ilustrada na Figura 1B) impede que os cálculos de medição absoluta comprimento em eixos x e y, medida da altura (eixo z) e x relativa e medições y pode ser, no entanto útil para estimar propriedades biofísicas das biomoléculas com imagens. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Apresentação esquemática do modo de tocar microscopia de força atômica (AFM). A, o microscópio. No final do cantilever é uma ponta afiada que oscila para cima e para baixo, uma vez que faz a varredura sobre a superfície de um substrato de mica a que adsorvem complexos biomolecular. Como o scanner se move nas direções x e y, um feixe de laser é refletida na parte de trás do cantilever em uma posição sensível detector fotodiodo para mapear a distância vertical (z) a ponta se move quando ele passa sobre os complexos biomolecular sentado no mica. B. Distorção da imagem nas direções x e y causada pela convolução da ponta. O raio nominal de uma ponta convencional nitreto de silício é maior do que as partículas a ser trabalhada, ea borda dos contatos ponta da amostra, uma vez que atravessa a superfície. Dica resultados convolução nas partículas com imagens que aparecem maiores na direções x e y, mas não a direção z. Este efeito pode ser minimizado através da utilização de pontas com um raio menor ponta nominal. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Ilustração de proteína imunoadsorvido e preparação de amostras de DNA. A Release, de GR imunoadsorvido • complexo de proteínas hsp70 do anticorpo monoclonal (mAb)-proteína A-Sepharose (PAS) da pelota. Incubando a immunopellet com um peptídeo contendo o epítopo mAb vai facilitar a liberação do GR • complexo de proteínas hsp70 do pellet, permitindo que o complexo para ser coletado do sobrenadante e visualizados por AFM. B, Preparação de DNA para AFM imagens requer o uso de um cátion divalente adsorção buffer. O cátion divalente aumenta a afinidade do DNA para o substrato de mica. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Disposição Final da cabeça AFM e suporte para sonda líquido celular, amostra, porta-espécime, e menisco buffer. A Care, devem ser tomados no momento do depósito de amostra e tampão adicionais sobre o substrato de mica para evitar o contato físico entre a ponta da pipeta e cabeça AFM, ligue para líquido, e substrato mica. B, Ampliação de A. O menisco tampão se estende a partir do disco de amostra para o titular líquido celular sonda. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Micrografias de força atômica do substrato de mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease DNA plasmídeo 8 (B, D) e GR • complexos de proteína hsp70 (C, E) em solução tampão. Mica serve como um controle de imagem para comparar com as visualizações de DNA e proteínas. GR • complexos de proteína hsp70 foram preparados por imunoadsorção de GR preparado com hsp70 e em seguida liberado a partir do pellet-anticorpo talão usando um anticorpo monoclonal concorrentes (ilustrada na Figura 2A). DNA foi preparado pela miniprep plasmídeo convencional. Painéis A, B e C são de uma ampliação equivalente (barra de escala = 200 nm), assim como os painéis D e E (barra de escala = 40 nm).

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

AFM fornece uma técnica única microscópicas capazes de imagem individuais revestidos biomoléculas em solução aquosa e quase fisiológica soluções tamponadas em tempo real. Isto permite a visualização de proteínas e moléculas de DNA, bem como complexos multiprotein e proteína DNA-complexos. Partículas macromolecular de imagem com AFM pode ser útil para avaliar a homogeneidade da amostra e identificar o arranjo físico dos componentes constituintes das partículas observadas. Esta abordagem de observar partículas macromolecular indivíduo pode ser um complemento útil ao convencional técnicas bioquímicas, tais como ensaios de imunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilamida e cromatografia tamanho da coluna de exclusão, que fornecem dados significativos sumativa representando o 10 3 -10 11 complexos biomolecular individuais de interesse presentes em uma amostra. Investigação em estequiometria multiprotein complexos, interações biomoleculares e requisitos cofactor podem ser investigadas utilizando AFM. O método aqui apresentado pode ser adaptado para acomodar questões específicas de interesse biofísico. Por exemplo, utilizando um suporte da sonda líquido celular capazes de trocar de buffer, é possível aos requisitos do ensaio cofator para a formação de proteínas complexas. DNA-proteína assembléias podem ser formadas e dissociado quase em tempo real e até mesmo ao ser fotografada. DNA podem ser gerados com seqüências específicas de interesse (por exemplo, elementos de resposta presuntivo ou seqüência romance binding protein), misturado com a proteína a hipótese de ligação, e fotografada para fornecer evidências diretas de interações intermoleculares. Tocando modo AFM é substancialmente menos complicado se as amostras secas são utilizadas em vez de amostras em soluções aquosas, e está DNA linear e plasmídeos fechado círculo de DNA têm sido fotografados tanto desta forma 3,9. O método aqui apresentado utiliza amostras em soluções tamponadas, a fim de proporcionar um ambiente de imagem mais fisiológica. Outros métodos de imagem notável de proteínas também devem ser considerados, incluindo perto de microscopia de campo infravermelho 10. A utilização complementar de imunoadsorção em consórcio com AFM fornece uma oportunidade para preparar uma miríade de complexos de proteínas, utilizando técnicas bem estabelecidas bioquímicos e, em seguida, visualizá-los após a libertação do immunoadsorbing anticorpos talão pellet. Por exemplo, GR imunoadsorvido foi ensaiada por sua associação com a proteína chaperone molecular hsp70 1, bem como a proteína dineína motor 2 usando essa abordagem, a fim de estimar o tamanho complexo e estequiometrias. Tamanho das partículas e características biofísicas (rigidez, por exemplo) têm sido úteis em determinar a identidade do biomoléculas observada em amostras de AFM imaged 11,12. Também é possível confirmar a identidade biomolécula pela adição de uma biomolécula interação (por exemplo, um ligante ou um anticorpo monoclonal), que se ligam ao seu alvo e causar um aumento de tamanho de partícula, se a biomolécula alvo está presente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Celular Fluid dimensão </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Alavanca de nitreto de Sharp (SNL) de nitreto de silício AFM sonda </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever afiada nitreto de alavanca (MSNL) de nitreto de silício AFM sonda </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> Nanoscope software instrumento AFM </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Espécime de metal discos AFM </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grade V1 Discos Mica, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualização do dna recombinante e complexos de proteínas usando microscopia de força atômica

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Microscopia de força atômica (AFM) permite a visualização de proteínas individuais, as moléculas de DNA, complexos proteína-proteína e DNA-proteína complexos. No final do cantilever do microscópio é uma sonda escala nanométrica, que atravessa áreas de imagem que variam de nanômetros a micrômetros, medir a elevação de macromoléculas descansando na superfície do substrato, em qualquer ponto. Forças eletrostáticas causa proteínas, lipídios e ácidos nucléicos para frouxamente anexar ao substrato em orientações aleatórias e permitir imagem. Os dados gerados se assemelham a um mapa topográfico, onde as macromoléculas como resolver tridimensional partículas de tamanhos distintos (Figura 1) 1,2. Tocando modo AFM envolve a oscilação repetida do cantilever, que permite imagens de biomateriais relativamente macio, tais como DNA e proteínas. Um dos benefícios notáveis ​​da AFM em relação a outras técnicas de microscopia em nanoescala é a sua adaptabilidade em relação ao visualizar proteínas individuais e complexos macromoleculares em buffers aquosa, incluindo o quase fisiológica tamponada condições, em tempo real, e sem coloração ou revestimento da amostra a ser trabalhada. O método aqui apresentado descreve a imagem de DNA e um fator de transcrição imunoadsorvido (isto é o receptor glicocorticóide, GR) em solução tampão (Figura 2). Imunoadsorvido proteínas e complexos de proteína pode ser separada da immunoadsorbing anticorpos talão de pelotas pela competição com o anticorpo epítopo e depois fotografada (Figura 2A). Isso permite a manipulação bioquímica do biomoléculas de interesse antes da imagem. Uma vez purificado, DNA e proteínas podem ser misturados e do complexo interagindo resultante pode ser trabalhada também. Ligação do DNA a mica requer um cátion divalente 3, tais como Ni 2 + ou Mg 2 +, que pode ser adicionado à amostra buffers ainda manter a atividade da proteína. Utilizando uma abordagem similar, AFM tem sido utilizado para visualizar diferentes enzimas, incluindo RNA polimerase 4 e uma enzima de reparo 5, ligado a cadeias de DNA individual. Esses experimentos fornecem uma visão significativa para a proteína-proteína e interações DNA-proteína biofísicos que ocorrem no nível molecular. Partículas macromolecular imagens individuais com AFM pode ser útil para determinar a homogeneidade de partículas e para a identificação do arranjo físico dos componentes constituintes das partículas com imagens. Enquanto o método foi desenvolvido para visualização dos complexos GR-chaperone da proteína 1,2 e DNA vertentes a que o GR pode ligar, ele pode ser aplicado de forma ampla para DNA de imagens e amostras de proteínas a partir de uma variedade de fontes.

Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

A microscopia de força atômica (AFM) permite a visualização de proteínas individuais, moléculas de DNA, complexos proteína-proteína e complexos DNA-proteína. Em ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de biomoléculas, como DNA e proteínas, em tampões aquosos em tempo real utilizando microscopia de força atômica. Isso é realizado primeiramente preparando as biomoléculas a serem visualizadas. Em seguida, configura-se o microscópio de força atômica e posiciona-se uma ponteira de cantiléver em modo FM.A superfície da amostra e as biomoléculas de interesse são então imagiadas e analisadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o tamanho geral, a quantidade e a organização de DNA, proteínas e complexos biomoleculares heterogêneos em condições tamponadas por meio de microscopia de força atômica. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo das chaperonas moleculares, como qual é a geometria STO do complexo entre chaperonas e co-chaperonas com um cliente.Proteína A demonstração visual deste método é benéfica, pois os passos de preparação da microscopia de força atômica (AFM) e da sonda Kent podem ser difíceis de aprender a partir de instruções impressas, principalmente devido às complexidades associadas à sua manipulação física. O procedimento será demonstrado por Morgan Shannon e John Gertz, dois alunos do meu laboratório. Para começar, isole as moléculas de proteína ou DNA a serem imagiadas e suspenda-as em um tampão aquoso. Após confirmar a pureza da amostra, incube-a em um tampão de absorção para AFM no gelo para promover a adesão da amostra à mica.Para amostras de proteínas, utilize um tampão heaps de 10 milimolares. E para DNA, um tampão contendo magnésio composto de tris 10 milimolares, pH 7,5, cloreto de sódio 10 milimolares, cloreto de magnésio 2 milimolares é adequado para montar a sonda de MF. Coloque o suporte da sonda da célula líquida na estação de acoplamento correspondente para instalação do canteiro. Localize a longa alavanca grossa da sonda de alavanca de nitreto afiada a ser utilizada para imageamento. Transfira-a cuidadosamente para o suporte da sonda da célula líquida, garantindo que a ponta permaneça voltada para cima. Em seguida, examine a alavanca sob um microscópio óptico para garantir que esteja intacta e corretamente acomodada no suporte da sonda da célula líquida.Em seguida, remova cuidadosamente a cabeça de FM do conjunto de encaixe do instrumento apertando o parafuso de fixação da cabeça neural. Inverta a cabeça de FM e empurre firmemente o suporte da sonda da célula líquida sobre os quatro pinos na base da cabeça de FM. Por fim, recoloque cuidadosamente a cabeça de FM no conjunto de encaixe do instrumento.Para preparar ainda mais o microscópio de força atômica (FM) antes da imagem de amostras, mova os botões do microscópio óptico embutido para localizar a ponta do cantiléver e ajuste as setas para cima e para baixo do controlador óptico no software para colocar a ponta do cantiléver em foco. Use os botões de ajuste do laser para alinhar o laser com a ponta do cantiléver. Este é um dos passos mais tecnicamente desafiadores do protocolo; o posicionamento é feito manualmente e exige ajustes precisos dos botões.O monitoramento cuidadoso do laser no ponto de reflexão e no ponto de iluminação aumenta a probabilidade de um alinhamento bem-sucedido. Em seguida, ajuste os botões do fotodetector na cabeça de FM para centralizar o fotodetector. Coloque uma lâmina recém-clivada de MICA, presa a um disco metálico de amostra de FM, no porta-amostras magnetizado localizado sobre a placa do suporte de FM.Gire a placa do suporte FM para que o disco de espécime fique posicionado para a imagem inicial. Use o controle de superfície de foco do software do instrumento para mover a cabeça FM em direção à superfície do disco de espécime MICA. Até que características distintas na superfície do MICA ou o reflexo da ponta estejam em foco, selecione o ícone de ajuste no software do instrumento e ajuste o cantiléver.A frequência de ressonância das sondas MSNL ou SNL recomendadas é de 20 a 60 quilohertz. Selecione uma compensação de pico de 5% para imagens da amostra de MICA. Primeiro, posicione a sonda sobre a superfície de MICA, defina o tamanho inicial de varredura para 10 micrômetros e a taxa de varredura para um hertz.Capture imagens completas da digitalização do campo de 10 micrômetros. Em seguida, reduza o tamanho da digitalização para cinco, um e 0,5 micrômetros e capture imagens completas de cada campo. Desengate a sonda clicando uma vez no ícone de desengate no software do instrumento.Para imaginar biomoléculas de interesse, misture cinco microlitros da amostra preparada com 45 microlitros de tampão de absorção fresco. Adicione cuidadosamente 50 microlitros da solução contendo 0,5 micrograma por mililitro da biomolécula diretamente sobre a superfície dos MICUs. Aguarde cinco minutos para permitir que as biomoléculas da amostra adiram à superfície de Micah.Em seguida, pipete de 50 a 100 microlitros adicionais de tampão de absorção no suporte da célula de líquido. Tendo o cuidado de não tocar a sonda, uma cabeça FM ou a MICA com a ponteira da pipeta, reajuste o detector de foto e realinhe o laser com o cantiléver conforme necessário. Em seguida, use o software do instrumento para reengajar a sonda.Aumente o tamanho da varredura para identificar regiões de interesse. Após a conclusão da imagem, selecione o ícone de retirada no software do instrumento várias vezes para desengatar a sonda. Por fim, use água destilada para enxaguar completamente o suporte da sonda da célula líquida e o disco da amostra.Em seguida, teste com ar comprimido. Um exemplo de uma imagem de FM-A é mostrado aqui. O substrato de mica fornece uma superfície molecularmente plana na qual o DNA e as proteínas podem absorver.A imagem do MICA antes das amostras de biomoléculas fornece um controle negativo e uma avaliação do ruído de imagem. Também oferece um nível de garantia de que o cantiléver está devidamente calibrado e que a imagem subsequente da amostra será bem-sucedida. O DNA plasmidial de dupla fita, presumivelmente superenrolado, é prontamente identificado por sua aparência assimétrica e deposição uniforme sobre o substrato de Micah previamente inócuo.Complexos proteicos de tamanhos de partículas discretos também são exclusivamente distinguíveis do substrato Micah. Diferenças no tamanho das partículas indicam heterogeneidade da amostra e podem ser úteis para estimar a estequiometria, geometria ou atividade bioquímica do complexo proteico. A forma diagonal geral e a orientação consistente das partículas proteicas observadas.Aqui é um artefato de imagem, já que as proteínas seriam orientadas no substrato Micah de maneira aleatória. As causas possíveis do artefato observado incluem uma anormalidade física na ponta ou uma imagem de FM com uma taxa de varredura muito rápida, enquanto a convolução da ponta impede cálculos precisos de medidas de comprimento nos eixos X e Y, ou medidas de altura no eixo Z; contudo, medidas relativas nos eixos X e Y podem ser úteis para estimar propriedades biofísicas das biomoléculas imagiadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de sintonizar com precisão o cantiléver e alinhar o detector fotônico, seguindo este procedimento básico de FM.Outras etapas, incluindo o uso de uma célula de fluido para troca de tampão, podem ser adicionadas para responder perguntas adicionais, como a capacidade de chaperonas moleculares de afetar a liberação de receptores de esteroides de seus elementos de resposta no DNA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como obter imagens de proteínas de DNA e complexos biomoleculares utilizando microscopia de força atômica em condições tamponadas.

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