Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de biomoléculas, como DNA e proteínas, em tampões aquosos em tempo real usando microscopia de força atômica. Isso é feito preparando primeiro as biomoléculas a serem fotografadas. Em seguida, o microscópio de força atômica é configurado e a sonda cantilever FM é posicionada.

A superfície da amostra e as biomoléculas de interesse são então fotografadas e analisadas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram tamanho, quantidade e organização geral de DNA e proteínas e complexos biomoleculares heterogêneos em condições tamponadas por meio de microscopia de força atômica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da chaperona molecular, como qual é a geometria STO de chaperonas e complexo de chaperonas cos para um cliente.

Proteína A demonstração visual deste método é benéfica, pois as etapas de preparação da sonda de alavanca A FM e Kent podem ser difíceis de aprender com as instruções impressas, em grande parte devido às complexidades associadas à sua manipulação física. Demonstrando o procedimento estarão Morgan Shannon e John Gertz, dois alunos do meu laboratório Para começar isolar as moléculas de proteína ou DNA a serem visualizadas e suspendê-las em um tampão aquoso. Depois de confirmar a pureza da amostra, incube-a em um tampão de absorção FM em gelo para promover a aderência da amostra à mica.

Para amostras de proteína, use um tampão heaps de 10 milimolares. E para DNAA magnésio contendo tampão composto de 10 milimolares tris, pH 7,5 10 milimolares cloreto de sódio, dois milimolares cloreto de magnésio é adequado para montar a sonda A FM. Coloque o suporte da sonda de célula líquida na estação de acoplamento de instalação do cantilever correspondente.

Localize o cantilever longo e espesso da sonda de alavanca de nitreto afiada a ser usada para geração de imagens. Transfira-o cuidadosamente para o suporte da sonda de célula líquida, garantindo que a ponta permaneça na posição vertical. Em seguida, examine o cantilever sob um microscópio de luz para garantir que esteja intacto e encaixado corretamente no suporte da sonda de célula líquida.

Em seguida, remova cuidadosamente a cabeça FM do conjunto de cauda de andorinha do instrumento, apertando o parafuso da braçadeira da cabeça neural. Inverta o cabeçote de FM e empurre firmemente o suporte da sonda de célula de líquido nos quatro pinos na base do cabeçote de FM. Finalmente, retorne cuidadosamente a cabeça FM para o instrumento de montagem da cauda.

Para preparar ainda mais o FM antes de obter imagens de amostras, mova os botões do microscópio óptico integrado para localizar a ponta do cantilever, ajuste as setas para cima e para baixo do controlador óptico no software para colocar a ponta do cantilever em foco. Use os botões de ajuste do laser para alinhar o laser à ponta do cantilever. Esta é uma das etapas tecnicamente mais desafiadoras do protocolo: o posicionamento é feito manualmente e requer um ajuste preciso do botão.

O monitoramento cuidadoso do laser no ponto de reflexão e no ponto de iluminação aumenta a probabilidade de alinhamento bem-sucedido. Em seguida, ajuste os botões do detector de fotos na cabeça de um FM para centralizar o detector de fotos. Coloque uma folha recém-clivada de MICA presa a um disco de amostra FM de metal no suporte de amostra magnetizado em cima da placa de suporte A FM.

Gire a placa de suporte FM para que o disco de amostra seja posicionado para a imagem inicial. Use o controle da superfície de foco do software do instrumento para mover a cabeça FM para baixo em direção à superfície do disco de amostra MICA. Até que recursos distintos na superfície MICA ou no reflexo da ponta estejam em foco, selecione o ícone de afinação no software do instrumento e ajuste o cantilever.

A frequência de ressonância das sondas MSNL ou SNL recomendadas é de 20 a 60 kilohertz. Selecione um deslocamento de pico de 5% para criar a imagem da amostra MICA. Primeiro, encaixe a sonda na superfície MICA, defina o tamanho da varredura inicial para 10 micrômetros e a taxa de varredura para um hertz.

Capture imagens de varredura completas do campo de 10 micrômetros. Em seguida, diminua o tamanho da varredura para cinco, um e 0,5 micrômetros e capture imagens completas de cada campo. Desengate a sonda clicando uma vez no ícone de desengate no software do instrumento.

Para obter imagens de biomoléculas de interesse, misture cinco microlitros da amostra preparada com 45 microlitros de tampão de absorção fresco. Adicione cuidadosamente 50 microlitros da solução contendo a biomolécula de 0,5 micrograma por mililitro diretamente na superfície das MICUs. Faça uma pausa de cinco minutos para permitir que as biomoléculas da amostra adiram à superfície de Miquéias.

Em seguida, pipete mais 50 a 100 microlitros de tampão de absorção no suporte da sonda de célula líquida. Tomando cuidado para não tocar na sonda, em um cabeçote FM ou MICA com a ponta da pipeta, reajuste o fotodetector e realinhe o laser ao cantilever conforme necessário. Em seguida, use o software do instrumento para reengatar a sonda.

Aumente o tamanho da varredura para identificar regiões de interesse. Quando a imagem estiver concluída, selecione o ícone de retirada no software do instrumento várias vezes para desengatar a sonda. Finalmente, use água destilada para enxaguar completamente o suporte da sonda de célula líquida e o disco de amostra.

Em seguida, experimente com ar comprimido. Um exemplo de uma imagem A FM é mostrado aqui. O substrato de mica fornece uma superfície molecularmente plana na qual o DNA e a proteína podem ser absorvidos.

A imagem de MICA antes das amostras de biomoléculas fornece um controle negativo e uma avaliação do ruído de imagem. Ele também fornece um nível de garantia de que o cantilever está devidamente ajustado e a imagem de amostra subsequente será bem-sucedida. O DNA de plasma de fita dupla, presumivelmente super enrolado, é prontamente identificado por sua aparência assimétrica e depósito uniforme no substrato de Micah anteriormente normal.

Complexos de proteínas de tamanhos de partículas discretas também são distinguíveis exclusivamente do substrato de Micah. As diferenças de tamanho de partícula indicam heterogeneidade da amostra e podem ser úteis para aproximar proteínas, geometria estóica complexa ou atividade bioquímica. A forma diagonal geral e a orientação consistente das partículas de proteína observadas.

Aqui está um artefato de imagem, pois as proteínas seriam orientadas no substrato de Miquéias de maneira aleatória. Possíveis causas do artefato observado ou uma anormalidade física da ponta ou uma imagem FM em duas velocidades rápidas de uma taxa de varredura enquanto a convolução da ponta impede cálculos de medição de comprimento absoluto no eixo x e Y, medição de altura ou eixo Z e medições relativas de X e Y podem ser, no entanto, úteis para estimar as propriedades biofísicas das biomoléculas imageadas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ajustar com precisão o cantilever e alinhar o fotodetector Seguindo este procedimento básico de FM.

Outras etapas, incluindo o uso de uma célula de fluido de troca tampão, podem ser adicionadas para responder a perguntas adicionais, como a capacidade das chaperonas moleculares de afetar a liberação de receptores de esteróides de seus elementos de resposta ao DNA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como obter imagens de proteínas de DNA e complexos biomoleculares usando microscopia de força atômica em condições tamponadas.