Um ensaio in vitro para estudar a interação entre neutrófilos e biofilme

Um biofilme é uma comunidade de bactérias aderidas à superfície incorporadas dentro de uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares, EPS, de origem microbiana.

Para estudar as interações célula-biofilme imunológico in vitro, pegue uma lâmina com um canal contendo um biofilme de Staphylococcus aureus - um patógeno oportunista. As bactérias modificadas expressam uma proteína fluorescente para detecção microscópica. O canal se conecta a reservatórios cheios de meios para fornecer nutrientes às bactérias.

Adicione uma suspensão de neutrófilos marcados com um corante fluorescente de rastreamento de células. O meio também contém um homodímero de etídio, que mancha o DNA das células mortas. Incubar em condições fisiológicas.

Os receptores de reconhecimento de padrões nos neutrófilos se ligam aos padrões moleculares associados ao patógeno nas bactérias. A ligação induz os neutrófilos a fagocitar as bactérias e produzir espécies reativas extracelulares de oxigênio ou ROS, matando as bactérias.

Para evitar a resposta imune, as bactérias liberam enzimas desintoxicantes que diminuem as EROs e a toxina leucocidina que causa a morte celular. A leucocidina monomérica se liga a receptores específicos nos neutrófilos e sofre multimerização para formar um poro, interrompendo a integridade da membrana e matando as células.

O homodímero de etídio entra através da membrana celular danificada, corando as células mortas.

Sob um microscópio de fluorescência de campo amplo, um subconjunto de células bacterianas e neutrófilos parece morto, indicando interação neutrófilo-biofilme.

Use uma cepa fluorescente de S. aureus, como USA300 expressando GFP, para facilitar a imagem de microscopia. Incube neutrófilos com 100 micromolares BCD por 30 minutos em um balancim a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono atmosférico. Certifique-se de que as amostras sejam incubadas no escuro e limite a exposição à luz.

Para lavar o excesso de BCD, centrifugue neutrófilos a 270 RCF por cinco minutos e aspire o sobrenadante. Ressuspenda os neutrófilos em HBSS fresco. Em seguida, adicione homodímero de etídio-1 aos neutrófilos corados com BCD a uma concentração final de 4 micromolares para monitorar a morte de neutrófilos e bactérias.

Lave o biofilme com HBSS e adicione 150 microlitros de neutrófilos ao biofilme de S. aureus que foi cultivado em microlâminas. Incube as microlâminas em uma câmara umidificada por 30 minutos. O número de células bacterianas será baseado nas contagens de células obtidas do biofilme de 18 horas.

Imagem da interação do biofilme de neutrófilos usando canais fluorescentes correspondentes a corantes fluorescentes ou comprimentos de onda de excitação e emissão de proteínas.