Medindo a atividade neural em uma fatia de cérebro de camundongo após incubação prolongada

Prenda uma fatia de cérebro de camundongo em uma câmara de gravação, perfundida com aCSF oxigenado após incubação prolongada.

As células da fatia são carregadas com um indicador de cálcio, facilitando as medições de cálcio intracelular.

Pegue uma pipeta de registro contendo um eletrodo em uma solução eletrolítica.

Identifique um neurônio alvo. Posicione a pipeta de registro com pressão positiva na membrana celular, criando uma covinha.

Aplique pressão negativa para criar uma vedação hermética.

Além disso, aplique pulsos de pressão negativa, rompendo a membrana e estabelecendo uma configuração de célula inteira.

Perfundir aCSF com alta concentração de potássio, que despolariza a membrana do neurônio.

A despolarização abre os canais de sódio, desencadeando um potencial de ação, que por sua vez ativa os canais de cálcio dependentes de voltagem e permite o influxo de cálcio.

Os íons de cálcio se ligam ao indicador, aumentando a fluorescência, que pode ser visualizada sob iluminação adequada.

O aumento da fluorescência intracelular, causado pelo influxo de cálcio após a aplicação de potássio, indica viabilidade neuronal após incubação prolongada.

Para registro, coloque o tecido em uma câmara de registro submersa sob um microscópio e perfunda-o com aCSF oxigenado a uma taxa de fluxo de 4 a 5 mililitros por minuto. Segure o tecido usando uma harpa feita sob medida. Em seguida, prepare algumas pipetas de gravação usando um extrator de micropipeta para obter uma resistência final de 5 a 6 mega ohms.

Encha a pipeta com 3 a 4 microlitros de solução interna e, em seguida, coloque a solução no gelo. Em seguida, visualize as células usando uma câmera CCD em IR-DIC. Posicione a pipeta na membrana celular usando um micromanipulador. Mantenha a pressão positiva através de uma porta de sucção no porta-pipetas. Quando a pipeta estiver na célula, aplique uma leve pressão negativa na pipeta para obter uma vedação de gigaohm.

Em seguida, rompa a membrana celular com breve pressão negativa. Posteriormente, inicie a corrente de célula inteira ou voltage clamp registro. Para um único comprimento de onda de excitação do fluxo 4, filtre a luz de excitação através de um filtro passa-banda de 460 a 490 nanômetros e a luz emitida através de um filtro passa-banda de 515 a 550 nanômetros.