Registro da Atividade Eletrofisiológica da Rede Neuronal em uma Co-cultura Neurônio-Astrócito

Comece com uma placa de matriz de vários eletrodos, ou MEA. Cada poço contém uma matriz de eletrodos posicionada centralmente.

A matriz é revestida com um substrato de cultura para facilitar a adesão celular.

Adicione uma suspensão de neurônios motores e astrócitos como uma gota sobre a matriz.

Incube para permitir a fixação celular e, em seguida, adicione um meio de co-cultura quente suplementado com uma pequena molécula que mantém a viabilidade celular.

Durante a incubação, os astrócitos secretam fatores que promovem a maturação neuronal e a formação de sinapses, resultando em uma rede neuronal.

Coloque o MEA em um dispositivo de registro em condições fisiológicas para monitorar a atividade neuronal.

Os neurônios transmitem sinais elétricos, chamados potenciais de ação, que viajam ao longo de seus axônios.

Ao atingir a sinapse, o sinal desencadeia a liberação do neurotransmissor, propagando o sinal para o próximo neurônio.

Eletrodos dentro de cada poço registram extracelularmente os sinais gerados por neurônios conectados sinapticamente.

A detecção de sinais elétricos rítmicos sincronizados confirma o estabelecimento de uma rede neuronal.

No dia do revestimento ou antes, comece a revestir as placas MEA de 24 poços diluindo primeiro o PLO em água ou PBS. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de PLO a cada poço, formando uma gota no centro do poço, cobrindo a área do eletrodo, garantindo não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta.

Adicione água aos poços circundantes dos compartimentos, garantindo umidade suficiente, e incube o PLO a 37 graus Celsius por 1 a 2 horas. Em seguida, usando uma ponta de micropipeta de plástico, aspire o máximo de PLO possível sem tocar nos eletrodos. Em seguida, lave o poço com 250 microlitros de água, três vezes.

Usando uma ponta de pipeta, remova o máximo de água possível e deixe a superfície secar com a tampa removida. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de laminina diluída para cobrir cada feixe de eletrodos. Depois de adicionar água aos compartimentos de umidade e recolocar a tampa, incube a 37 graus Celsius por no mínimo duas horas durante a noite.

No dia do plaqueamento, depois de enxaguar os neurônios motores e as culturas de astrócitos uma vez com PBS, adicione 0,05% de tripsina e incube a 37 graus Celsius por cerca de 5 minutos para levantar as células. Colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo inibidor de tripsina, e lave as placas com meio ou base para garantir que todas as células sejam coletadas.

Derrube as células por centrifugação e, em seguida, usando uma pipeta de 1.000 microlitros, ressuspenda os neurônios motores e astrócitos com um meio de co-cultura contendo 20 micromolares de inibidor de ROCK para gerar 1 mililitro de uma suspensão de célula única. Usando um hemocitômetro, conte os neurônios motores e astrócitos e, durante a contagem, tampe as suspensões celulares e coloque-as em um rack de isopor a 4 graus Celsius.

Centrifugue 1 mililitro de ambas as suspensões celulares a 300 vezes g por 5 minutos. Calcule o volume desejado e suspenda novamente os pellets. Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos em proporções iguais e misture delicadamente pipetando duas vezes para combinar bem.

Em seguida, remova a laminina de cada poço da placa e transfira 10 microlitros da suspensão final de células combinadas para cada poço, formando uma pequena gota cobrindo o feixe de eletrodos. Incube as placas com uma gotícula celular não perturbada a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para formar as ligações iniciais nas placas.

Em seguida, pipete 250 microlitros de meios de co-cultura quentes contendo inibidor de ROCK na parede de cada poço, e pipete o mesmo volume na parede oposta de cada poço, e incube a placa a 37 graus Celsius por 24 a 36 horas. No dia seguinte, examine as placas em busca de detritos ou células mortas e, se necessário, troque o meio por um novo meio de co-cultura contendo inibidor de ROCK.

Caso contrário, realizar trocas de meio meio duas vezes por semana usando um meio de cocultura sem inibidor de ROCK, começando no dia 2 de cocultura. Para realizar a gravação, comece o mais rápido possível após o dia 1 de cocultura, ajustando a temperatura para 37 graus Celsius e o dióxido de carbono para 5%. Em seguida, transfira as placas para a máquina de gravação e equilibre por pelo menos cinco minutos antes de gravar. Registre a atividade de linha de base em dias alternados ou semanalmente durante 1 a 15 minutos, dependendo do projeto experimental.