Medindo a atividade do proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares do cérebro de ratos

Comece com frações nucleares e sinápticas subcelulares coletadas da amígdala lateral dos cérebros de ratos de controle e condicionados ao medo.

Cada fração subcelular contém concentrações variadas de proteassomas 20S, o núcleo catalítico do complexo proteassoma responsável pela degradação de proteínas celulares indesejadas.

Adicione um tampão de ensaio contendo ATP e um substrato de peptídeo fluorogênico às amostras e incuba.

Na presença de ATP, o proteassoma cliva o peptídeo fluorogênico, liberando moléculas fluorogênicas livres.

Usando um leitor de placas, meça a intensidade da fluorescência em intervalos regulares.

Quantifique a fluorescência comparando-a com as concentrações padrão conhecidas da molécula fluorogênica.

A intensidade de fluorescência é proporcional à atividade do proteassoma na amostra.

O aumento da atividade do proteassoma na fração nuclear de ratos condicionados ao medo sugere mudanças na expressão gênica relacionada à memória, enquanto a diminuição da atividade na fração sináptica indica mudanças na expressão da proteína sináptica necessárias para a manutenção da memória de longo prazo.

Para configurar o ensaio, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius e segure durante a corrida. Defina a excitação para 360 nanômetros e a emissão para 460 nanômetros. Se a placa de 96 poços usada estiver livre, defina a posição óptica para baixo. Se uma placa escura de 96 poços for usada, defina a posição da óptica para cima. Programe uma corrida cinética com o tempo de 2 horas, digitalizando a cada 30 minutos.

Reconstitua o tampão de ensaio 20s 10x fornecido no kit com 13,5 mililitros de água ultrapura. Adicione 14 microlitros de ATP 100 milimolar ao tampão agora 1x. Isso aumenta significativamente a atividade do proteassoma nas amostras e melhora a confiabilidade do ensaio. Reconstitua o padrão AMC fornecido no kit com 100 microlitros de DMSO. Execute as etapas usando o padrão AMC no escuro ou em condições de pouca luz, pois o padrão é sensível à luz.

Crie uma curva padrão de AMC a partir de uma série de concentrações de AMC altas a baixas. Esta curva será utilizada para calibração do leitor de placas e análise da atividade do proteassoma nas amostras homogeneizadas. Reconstitua o substrato de proteassoma fornecido no kit com 65 microlitros de DMSO. Execute também esta etapa no escuro ou em condições de pouca luz, pois o substrato é sensível à luz.

Em seguida, crie uma diluição de 1 para 20 do substrato de proteassoma em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, usando tampão de ensaio 20 S. Adicione uma quantidade normalizada das amostras desejadas a uma placa de 96 poços. Execute cada exemplo em duplicata. A quantidade de amostra necessária varia de acordo com a preparação do tecido. Geralmente, 10 a 20 microgramas são suficientes para qualquer fração subcelular.

Traga o volume do poço de amostra para 80 microlitros com água ultrapura. A quantidade adicionada depende do volume de amostra adicionada. Em dois poços separados, adicione 80 microlitros de água sozinho. Estes serão os ensaios em branco. Adicione 10 microlitros de tampão de ensaio 20 S a cada poço, incluindo os espaços em branco do ensaio. Use um repetidor ou pipeta automatizada para garantir um volume de ensaio consistente nos poços.

Apague as luzes ou entre em um quarto escuro. Adicione todos os 100 microlitros de padrões AMC diluídos a um novo poço, usando um único poço para cada padrão. No escuro, use um repetidor ou pipeta automatizada para adicionar 10 microlitros de substrato de proteassoma diluído a poços contendo amostras e ensaios em branco, mas não o padrão AMC. Coloque a placa no leitor de placas e inicie a corrida cinética.