Medindo a atividade do proteassoma em diferentes compartimentos subcelulares do cérebro de ratos

Comece com frações nucleares e sinápticas subcelulares coletadas da amígdala lateral dos cérebros de ratos de controle e condicionados ao medo.

Cada fração subcelular contém concentrações variadas de proteassomas 20S, o núcleo catalítico do complexo proteassoma responsável pela degradação de proteínas celulares indesejadas.

Adicione um tampão de ensaio contendo ATP e um substrato de peptídeo fluorogênico às amostras e incuba.

Na presença de ATP, o proteassoma cliva o peptídeo fluorogênico, liberando moléculas fluorogênicas livres.

Usando um leitor de placas, meça a intensidade da fluorescência em intervalos regulares.

Quantifique a fluorescência comparando-a com as concentrações padrão conhecidas da molécula fluorogênica.

A intensidade de fluorescência é proporcional à atividade do proteassoma na amostra.

O aumento da atividade do proteassoma na fração nuclear de ratos condicionados ao medo sugere mudanças na expressão gênica relacionada à memória, enquanto a diminuição da atividade na fração sináptica indica mudanças na expressão da proteína sináptica necessárias para a manutenção da memória de longo prazo.

Para configurar o ensaio, pré-aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius