Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Coloque um tecido retiniano isolado de um camundongo transgênico com células ganglionares da retina marcadas com fluorescência, ou RGCs, em uma câmara de registro.

A informação visual é retransmitida para os RGCs, cujos axônios a transmitem ao cérebro através do nervo óptico.

Os subtipos RGC são distinguidos pelos padrões de ramificação de seus dendritos, que se estratificam em subcamadas dentro da camada interna da retina.

Achate o tecido da retina e prenda-o usando uma âncora de tecido.

Transfira a câmara para um estágio de microscópio e perfunda uma solução oxigenada para manter a viabilidade do RGC.

Usando iluminação infravermelha, identifique os RGCs fluorescentes.

Posicione uma pipeta contendo um traçador fluorescente em um RGC.

Aplique pressão positiva para evitar entupimento.

Mude para pressão negativa, puxando a membrana para dentro da pipeta para formar uma vedação.

Aplique sucção para romper a membrana, estabelecendo uma configuração de célula inteira que facilita a difusão do traçador nos dendritos.

Observe a morfologia dendrítica e a estratificação para identificar os subtipos de RGC.

Lave a retina na solução extracelular oxigenada e transfira-a para uma câmara de gravação com fundo de vidro com uma pipeta de transferência de plástico. Depois disso, use uma pinça para achatar cuidadosamente o tecido com a camada fotorreceptora voltada para baixo. Remova o excesso de líquido usando uma pipeta. E ancore o tecido usando um anel de platina com malha de nylon. Em seguida, encha a câmara com a solução extracelular oxigenada e monte-a em um estágio de microscópio. Perfundir o tecido com a solução extracelular oxigenada a 2 a 4 mililitros por minuto.

Para se preparar para este procedimento, puxe algumas micropipetas de vidro para registros eletrofisiológicos usando um extrator de micropipetas. Observe a camada de células ganglionares usando a óptica IR-DIC. Em seguida, identifique as células ganglionares GFP mais usando epifluorescência em cerca de 480 nanômetros. Em seguida, localize a pipeta cheia de solução intracelular em DIC. Aplique uma leve pressão positiva e zere qualquer voltage deslocamentos no amplificador.

Em seguida, abaixe a micropipeta de vidro em uma célula positiva para GFP e aplique as etapas de comando de tensão de teste para monitorar a resistência da vedação. A pressão negativa deve formar uma vedação Giga ohm entre a pipeta e a membrana celular. Depois de formar uma vedação estável, rompa a membrana aplicando breves pulsos de pressão negativa para obter acesso a toda a célula. Aguarde um a dois minutos para que os dendritos da célula se encham com o traçador fluorescente.