Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

O objetivo geral deste procedimento é isolar células individuais marcadas com fluorescência de retinas vivas de montagem inteira. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência. Por exemplo, quantos subtipos de uma determinada classe neuronal existem e quais são os marcadores genéticos para cada subtipo?

A principal vantagem dessa técnica é que renunciamos à necessidade de dissociação do tecido retiniano, permitindo que as células sobrevivam em um ambiente mais saudável antes do isolamento. As implicações dessa técnica se estendem a qualquer população de células marcadas com fluorescência e, portanto, podem ser aplicadas a outros sistemas para entender a diversidade e a função celular na saúde e na doença. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades, porque essa técnica depende da capacidade do pesquisador de prender uma célula sem comprometer a viabilidade da célula.

A demonstração futura deste método é crítica, pois as etapas de isolamento de RNA podem ser difíceis de aprender, porque a pequena quantidade de RNA pode se degradar facilmente se não for manuseada de maneira adequada e rápida. Para iniciar este procedimento, cutuque a córnea com uma agulha e corte-a na borda da córnea e da esclera. Em seguida, remova a lente usando uma pinça.

Faça suavemente um rasgo na esclera e corte o nervo óptico onde a retina e a esclera se encontram. Termine cuidadosamente de remover a esclera da retina. Em seguida, remova o vítreo transparente.

Corte as retinas ao meio e armazene-as na solução extracelular oxigenada em temperatura ambiente até o uso. Quando estiver pronto para montar o tecido na câmara de registro, transfira um pedaço de retina para a solução enzimática, diluído em 500 microlitros de solução extracelular oxigenada em uma placa de Petri, e incube-o por dois minutos em temperatura ambiente em um agitador. Em seguida, lave a retina na solução extracelular oxigenada e transfira-a para uma câmara de gravação com fundo de vidro com uma pipeta de transferência de plástico.

Depois disso, use uma pinça para achatar cuidadosamente o tecido com a camada fotorreceptora voltada para baixo. Remova o excesso de líquido usando uma pipeta e ancore o tecido usando um anel de platina com tela de náilon. Em seguida, encha a câmara com a solução extracelular oxigenada e monte-a em um estágio de microscópio.

Perfundir o tecido com a solução extracelular oxigenada a dois a quatro mililitros por minuto. Para se preparar para este procedimento, pulse algumas micropipetas de vidro para registros eletrofisiológicos usando um extrator de micropipetas. Observe a camada de células ganglionares usando a óptica IR-DIC.

Em seguida, identifique as células ganglionares GFP mais usando epifluorescência em cerca de 480 nanômetros. Em seguida, localize a pipeta cheia de solução intracelular em DIC. Aplique uma leve pressão positiva e zere qualquer voltage deslocamentos no amplificador.

Em seguida, abaixe a micropipeta de vidro em uma célula positiva GFP e aplique as etapas de comando de tensão de teste para monitorar a resistência da vedação. A pressão negativa deve formar uma vedação de gigaohm entre a pipeta e a membrana celular. Depois de formar uma vedação estável, rompa a membrana aplicando breves pulsos de pressão negativa para obter acesso a toda a célula.

Aguarde um a dois minutos para que os dendritos da célula se encham com o traçador fluorescente. Nesta etapa, extraia cuidadosamente o conteúdo citoplasmático da célula para a pipeta aplicando pressão negativa com uma seringa de dez mililitros. Enquanto isso, monitore a extração em DIC visualizando o corpo celular diminuindo de tamanho.

Depois de extrair o conteúdo citoplasmático, levante a pipeta cuidadosamente do tecido e remova rapidamente a pipeta da solução. Em seguida, remova rapidamente a pipeta do suporte do cabeçote e enxágue brevemente a ponta da pipeta com H2O tratado com DEPC. Em seguida, conecte a pipeta a uma seringa de um mililitro através do tubo apertado.

Expulse imediatamente as células em dez microlitros de tampão de lise, um nos tubos de PCR de 0,2 mililitro. Centrifugue brevemente os tubos em uma minicentrífuga de mesa a 2000 vezes g por dez segundos. Em seguida, congele imediatamente as amostras em gelo seco por cinco minutos.

Após o congelamento, armazene-os a 80 graus Celsius negativos por até duas semanas para obter melhores resultados. Para se preparar para este procedimento, configure um dispositivo separador magnético colando a parte superior de um suporte de ponta P20 ou P200 invertido no suporte magnético de 96 poços. Em seguida, prepare etanol fresco a 70% em aproximadamente um mililitro por amostra.

Remova as esferas magnéticas de RNA do armazenamento a 4 graus C e descongele-as à temperatura ambiente. Quando as esferas de RNA estiverem em temperatura ambiente, agite-as por 30 segundos para garantir que a solução esteja bem misturada. Depois disso, descongele as células em temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, adicione cinco microlitros de H2O livre de Rnase a cada amostra e pipete para cima e para baixo. Depois, adicione 22 microlitros de grânulos de RNA a cada tubo e misture bem. Incube as amostras em temperatura ambiente por cinco minutos para permitir que o RNA interaja e se ligue às esferas magnéticas.

Em seguida, coloque os tubos em um separador magnético por oito minutos. Antes de prosseguir, certifique-se de que o sobrenadante esteja limpo. Observe as contas de uma paleta e certifique-se de não separá-las da lateral do tubo durante a pipetagem.

Remova o sobrenadante das amostras e adicione 150 microlitros de etanol a 70%. Em seguida, retire o etanol e repita a lavagem mais duas vezes. Deixe as amostras secarem ao ar por seis minutos.

Verifique intermitentemente se mais etanol foi coletado no fundo do tubo e remova-o de acordo. Lembre-se de que é fundamental secar as contas adequadamente. Se os grânulos não estiverem secos o suficiente, o etanol pode ser transportado com o eluente e diminuirá o rendimento total, enquanto os grânulos secos demais podem resultar na perda de RNA.

Enquanto as amostras estão secando, prepare 10x tampão de reação combinando 19 microlitros de tampão de lise dois e um microlitro de inibidor de Rnase. Gire brevemente e mantenha-o no gelo. Quando as amostras estiverem secas e os grânulos não parecerem mais brilhantes, remova os tubos do separador magnético e adicione 9,5 microlitros de H2O livre de Rnase para reidratar as amostras.

Em seguida, coloque as amostras no gelo e adicione um microlitro de tampão de reação 10x a cada amostra. Esta imagem mostra a camada de células ganglionares da retina, visualizada usando IR-DIC em toda a preparação da retina de montagem. A mesma preparação foi visualizada em epifluorescência a cerca de 480 nanômetros para identificar as células ganglionares positivas para GFP.

Esta imagem mostra uma célula positiva para GFP que foi direcionada para gravação de patch-clamp e preenchida com um traçador fluorescente. A imagem confocal de dendritos ipRGC fotografada na sublâmina ligada e desligada da camada plexiforme interna permite a classificação desses tipos de células Esta saída do bioanalisador mostra os exemplos de bibliotecas que sofreram transcrição reversa, amplificação e purificação. As pistas um a três mostram esfregaços de DNA ideais, enquanto a pista quatro representa uma amostra mal processada.

A faixa de controle deve conter dois picos limpos nos tamanhos de marcador de 35 pb e 10380 pb. Aqui está um rastreamento detalhado de uma biblioteca preparada com sucesso com alta intensidade em torno de 2 kb. Este traço também demonstra uma preparação bem-sucedida, mas com o esfregaço centrado em torno de 500 pb.

Esta imagem mostra a saída do bioanalisador após a marcação, amplificação e purificação das amostras. O traço detalhado de uma amostra marcada com sucesso pode ser visto aqui, correspondendo à amostra na pista um. A marcação incompleta resultará em um traço como o visto aqui, garantindo a remarcação com uma nova diluição.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o RNA dos tipos de células marcadas com fluorescência na retina intacta. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o RNA é muito sensível à degradação e que ter células retinianas saudáveis é a chave. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente.

Após esse procedimento, outros métodos como qPCR, hibridização NC2 ou imuno-histoquímica podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se os genes identificados são específicos de um determinado subtipo celular. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência, tentando entender a heterogeneidade dos neurônios em várias regiões do cérebro. Compreender essa heterogeneidade permitirá estudos futuros da função celular e conectividade em populações identificadas molecularmente.