Imagem de segunda geração harmônica em um modelo de rato para estudar defeitos de tubulina

Comece com uma fatia de tecido cerebral de rato montada em uma lâmina de vidro e imersa em um tampão.

O rato sofre de tubulinopatia, uma condição causada por defeitos na tubulina, os blocos de construção dos microtúbulos, levando ao seu acúmulo e ruptura anormais.

Isso também afeta a produção de mielina no sistema nervoso central.

Coloque a fatia sob um microscópio de excitação de dois fótons coberto para obter imagens detalhadas.

Hidrate regularmente a fatia para manter sua integridade.

Defina o microscópio para um modo de imagem não digitalizado, uma técnica sem rótulo para detectar sinais fracos.

Exponha o tecido a um laser infravermelho pulsado.

Os microtúbulos emitem luz como sinais detectáveis conhecidos como geração de segundo harmônico ou sinais SHG.

Áreas com acúmulo anormal de microtúbulos amplificam esses sinais, aumentando sua detectabilidade.

Aplique filtros ópticos para refinar esses sinais.

A imagem capturada revela densidade e anormalidades dos microtúbulos, em que a alta intensidade e agrupamento de SHG indicam defeitos de tubulina e redução da produção de mielina.

Colocar a amostra ao microscópio e posicioná-la adequadamente sob a objetiva por observação direta através das oculares com luz transmitida. Remova o excesso de HBSS para que uma fina película líquida cubra toda a amostra. Verifique visualmente o filme líquido a cada poucos minutos para evitar evaporação excessiva e secagem da amostra.

Prepare a platina do microscópio para imagens não digitalizadas, o que inclui fechar todas as portas da câmara de incubação escura ou cobrir a câmara de incubação com um tecido revestido de poliuretano de nylon preto. Selecione o modo de imagem não digitalizado ao longo do caminho de transmissão. Desta forma, a captura do sinal SH fraco da tubulina será otimizada.

Em seguida, selecione o objetivo. Em seguida, defina uma potência de laser com um tempo de permanência de pixel de 12,6 microssegundos. Tire imagens de no tamanho 512 por 512 pixels, com velocidade 5 e média de 2 para um tempo médio de aquisição de 15 segundos. Capture imagens primeiro usando um filtro passa-curta de 485 nanômetros. E em uma segunda etapa, adicione um filtro passa-banda afiado de 405 nanômetros.