Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling
9 de julho de 2011
Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.
O objetivo geral deste experimento é marcar fluorescentemente o vírus da dengue para estudos microscópicos. Prepare os tampões necessários e purifique o vírus da dengue com almofada de sacarose reconstitua o corante de fluxo Amy React Alexa e o vírus da dengue no tampão de rotulagem. Rotule o vírus da dengue com cem micromolares de fluxo Alexa.
Morra por uma hora e pare a reação de marcação com o sub-reagente. Purifique o rótulo vírus da dengue por meio de uma coluna de exclusão de tamanho. Retitule o vírus marcado por ensaio de placa e estime o grau de marcação por ensaio de imunofluorescência.
Olá, sou Sam Jang, do DSO National Laboratories, trabalhando no laboratório do Dr.Wee no programa de doenças infecciosas emergentes após a pós-graduação em medicina da NUS. Hoje vou mostrar como marcar fluorescentemente o vírus Denki com o corante de gripe Amy Reactive Alexa para estudos de imagem. Alexa, a gripe morre, tem superior estabilidade e é menos sensível ao pH do que a dieta comum, como fluoresceína e rumina, tornando-os ideais para estudos sobre captação celular e transporte endossômico do vírus.
A falha Alexa rotulada com o vírus da dengue facilitará a compreensão da patogênese da dengue. Então vamos começar. Antes da reação de rotulagem, prepare o tampão de rotulagem fresco e pare o reagente de acordo com o protocolo escrito e purifique o vírus da dengue com almofada de sacarose, adicione o volume apropriado do vírus da dengue purificado ao tampão de rotulagem em um tubo de microcentrífuga para atingir uma concentração de 300 milhões de unidades formadoras por mililitro.
Isso pode ser ampliado proporcionalmente. Para rotulagem em lote de vírus. Reconstitua o corante de piso Alexa liofilizado a um milimolar no tampão de rotulagem imediatamente antes da reação de rotulagem.
Minimize a exposição à luz a partir desta etapa. Para fins de demonstração, o corante de piso Alexa será deixado desprotegido da luz 800 microlitros de um milimolar. Alexa flui para o vírus da dengue diluído enquanto mexe suavemente com a ponta micro Pipet.
Incubar por uma hora em temperatura ambiente protegida da luz misturada por inversões suaves a cada 15 minutos após uma hora, centrifugar os tubos brevemente. Um microlitro de 800 microlitros da sub-região enquanto olha suavemente com a micropipeta incuba por mais uma hora em temperatura ambiente. Protegido da luz faz por inversões suaves a cada 15 minutos.
Nesse ínterim, ele iguala a coluna de purificação com 25 mililitros de tampão HNE. Após a incubação de uma hora, aplique o vírus marcado na coluna e comece a coletar o fluxo. Preencha a coluna com buffer HNE.
Uma vez que todo o vírus marcado tenha entrado na matriz, descarte os primeiros 2,5 mililitros de fluxo e colete os próximos dois mililitros da fração de vírus marcada. Ecor e viu o vírus purificado marcado a menos 80 graus Celsius. Determine o título do vírus marcado por ensaio de placa.
Em um experimento típico, uma queda de menos de dez vezes no título do vírus deve ser observada. Após a marcação, um ensaio de imunofluorescência deve ser realizado para avaliar o grau de marcação. Para fazer isso, enumere as células virais usando um hemocitômetro e o volume apropriado de células para o meio de crescimento para atingir uma densidade de 50.000 células por mililitro.
Veja um mililitro de células virais por poço em uma placa de quatro poços contendo uma tampa de vidro estéril. Dormir. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Retire a placa da incubadora e aspire o supinador de bem, de fato, as células com aproximadamente um MOI do vírus marcado em um volume de cem microlitros por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Remova o inóculo e lave as células com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Spirit dis e repita este procedimento mais duas vezes. Fixe as células com 200 microlitros de 3% por altura múltipla por poço em temperatura ambiente por 30 minutos.
Lave as células três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Alize as células com solução de ização em temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a tampa do sono do poço usando uma pinça fina.
Drene o excesso de fluido fazendo DP na borda da tampa. Deslize contra um papel branco. Coloque o lado da célula da tampa.
Durma com 25 microlitros de anticorpo de proteína e dengue em um pedaço de parfum. Incubar durante uma hora numa câmara húmida à temperatura ambiente e protegida da luz. Em seguida, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e adicione dois mililitros de tampão de lavagem por óleo.
Aspire o supinado. Repita essas etapas de lavagem mais duas vezes após a última lavagem. Remova a lamínula do poço usando fp fino.
Drene o excesso de fluido mergulhando a borda da tampa. Deslize contra um lenço de papel. Coloque o lado da célula da tampa.
Durma em 25 microlitros de piso Alexa para oito anticorpos secundários anti-camundongo em um pedaço de perfume. Incubar por 45 minutos em uma câmara úmida em temperatura ambiente protegida da luz após a conclusão da incubação, transferir a tampa dormir para uma placa de seis poços e lavar as células três vezes com dois mililitros de tampão de lavagem para cada lavagem após a última lavagem. Remova a lamínula do poço e enxágue uma vez na água ionizada.
Drene o excesso de fluido mergulhando contra um papel. Limpe a montagem da lamínula em uma luz de microscópio com oito microlitros de solução de montagem suave. Deixe a solução de montagem definir o ar durante a noite em quatro graus Celsius.
A amostra agora está pronta para ser visualizada com um microscópio fluorescente ou confocal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão na superfície da tampa do sono e aperte o microscópio. Deslize para o estágio do microscópio.
Ajuste a platina até que a objetiva do microscópio entre em contato com o óleo de imersão. Para uma imagem claral, desligue as luzes ambiente usando o software Zes Zen. Clique na torneira ocular para observação direta da amostra através da ocular do microscópio.
Encontre um preenchimento com células e ajuste o foco. Agora mude para o modo de aquisição. Para minimizar a diafonia entre as quedas florais, selecione faixas separadas para Alexa floor 4 8 8 e finite four.
Corantes e aquisições de conjuntos para excitação e detecção sequenciais. Ajuste o ganho de potência e o deslocamento do laser para garantir que a imagem não fique superexposta ou subexposta. Capture a imagem e analise uma área de interesse usando a função de colocalização.
O coeficiente de sobreposição pode ser usado para estimar o grau de marcação do vírus da dengue pelo corante Alexa Flo. Um ensaio de imunofluorescência simples foi feito em células virais e o grau de marcação pode ser estimado a partir da colocalização do vírus marcado Com a proteína anti e, a coeficiência de sobreposição de coloração anticorpo varia de 0,65 a 0,8, sugerindo que aproximadamente 65 a 80% das variações foram marcadas com o corante de piso Alexa. Para que o procedimento de rotulagem seja bem-sucedido, é importante preparar o tampão de rotulagem e começar a se enfurecer e reconstituir o resumo do piso Alexa antes da rotulagem.
A concentração de corante a ser usada pode ser otimizada ainda mais para atender às suas necessidades. Este método de marcação do vírus da dengue no horizonte pode ser adaptado para rotular outros vírus. Então é isso.
Obrigado por assistir e boa sorte para o seu experimento de rotulagem.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para rotulagem fluorescente do vírus da dengue usando Alexa Fluor para análise microscópica. A abordagem permite a visualização das interações iniciais entre o vírus e as células hospedeiras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Microscopia de Fluorescência
- Biologia Celular
Fundo
- O vírus da dengue é uma preocupação significativa de saúde global.
- Entender as interações vírus-célula é crucial para desenvolver estratégias antivirais.
- A rotulagem fluorescente melhora a visualização dessas interações.
- Avanços em tecnologias de imagem facilitam estudos detalhados.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método confiável para rotular o vírus da dengue.
- Visualizar as interações entre o vírus da dengue e as células hospedeiras.
- Melhorar a compreensão dos estágios iniciais da infecção viral.
Métodos Usados
- Preparação de tampões necessários para rotulagem.
- Purificação do vírus da dengue usando almofada de sacarose.
- Reconstituição do corante Alexa Fluor no tampão de rotulagem.
- Rotulagem do vírus com uma concentração específica de corante.
Principais Resultados
- Rotulagem fluorescente bem-sucedida do vírus da dengue.
- Visualização das interações vírus-célula sob um microscópio.
- Avaliação da eficiência de rotulagem através de ensaio de imunofluorescência.
- Retitragem do vírus rotulado usando ensaio de placa.
Conclusões
- O método fornece uma maneira simples e eficaz de rotular o vírus da dengue.
- A rotulagem fluorescente auxilia no estudo das interações vírus-hospedeiro.
- Esta técnica pode ser aplicada a outros estudos virais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
