Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

O objetivo geral deste experimento é marcar fluorescentemente o vírus da dengue para estudos microscópicos. Prepare os tampões necessários e purifique o vírus da dengue com almofada de sacarose reconstitua o corante de fluxo Amy React Alexa e o vírus da dengue no tampão de rotulagem. Rotule o vírus da dengue com cem micromolares de fluxo Alexa.

Morra por uma hora e pare a reação de marcação com o sub-reagente. Purifique o rótulo vírus da dengue por meio de uma coluna de exclusão de tamanho. Retitule o vírus marcado por ensaio de placa e estime o grau de marcação por ensaio de imunofluorescência.

Olá, sou Sam Jang, do DSO National Laboratories, trabalhando no laboratório do Dr.Wee no programa de doenças infecciosas emergentes após a pós-graduação em medicina da NUS. Hoje vou mostrar como marcar fluorescentemente o vírus Denki com o corante de gripe Amy Reactive Alexa para estudos de imagem. Alexa, a gripe morre, tem superior estabilidade e é menos sensível ao pH do que a dieta comum, como fluoresceína e rumina, tornando-os ideais para estudos sobre captação celular e transporte endossômico do vírus.

A falha Alexa rotulada com o vírus da dengue facilitará a compreensão da patogênese da dengue. Então vamos começar. Antes da reação de rotulagem, prepare o tampão de rotulagem fresco e pare o reagente de acordo com o protocolo escrito e purifique o vírus da dengue com almofada de sacarose, adicione o volume apropriado do vírus da dengue purificado ao tampão de rotulagem em um tubo de microcentrífuga para atingir uma concentração de 300 milhões de unidades formadoras por mililitro.

Isso pode ser ampliado proporcionalmente. Para rotulagem em lote de vírus. Reconstitua o corante de piso Alexa liofilizado a um milimolar no tampão de rotulagem imediatamente antes da reação de rotulagem.

Minimize a exposição à luz a partir desta etapa. Para fins de demonstração, o corante de piso Alexa será deixado desprotegido da luz 800 microlitros de um milimolar. Alexa flui para o vírus da dengue diluído enquanto mexe suavemente com a ponta micro Pipet.

Incubar por uma hora em temperatura ambiente protegida da luz misturada por inversões suaves a cada 15 minutos após uma hora, centrifugar os tubos brevemente. Um microlitro de 800 microlitros da sub-região enquanto olha suavemente com a micropipeta incuba por mais uma hora em temperatura ambiente. Protegido da luz faz por inversões suaves a cada 15 minutos.

Nesse ínterim, ele iguala a coluna de purificação com 25 mililitros de tampão HNE. Após a incubação de uma hora, aplique o vírus marcado na coluna e comece a coletar o fluxo. Preencha a coluna com buffer HNE.

Uma vez que todo o vírus marcado tenha entrado na matriz, descarte os primeiros 2,5 mililitros de fluxo e colete os próximos dois mililitros da fração de vírus marcada. Ecor e viu o vírus purificado marcado a menos 80 graus Celsius. Determine o título do vírus marcado por ensaio de placa.

Em um experimento típico, uma queda de menos de dez vezes no título do vírus deve ser observada. Após a marcação, um ensaio de imunofluorescência deve ser realizado para avaliar o grau de marcação. Para fazer isso, enumere as células virais usando um hemocitômetro e o volume apropriado de células para o meio de crescimento para atingir uma densidade de 50.000 células por mililitro.

Veja um mililitro de células virais por poço em uma placa de quatro poços contendo uma tampa de vidro estéril. Dormir. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Retire a placa da incubadora e aspire o supinador de bem, de fato, as células com aproximadamente um MOI do vírus marcado em um volume de cem microlitros por 10 minutos a 37 graus Celsius.

Remova o inóculo e lave as células com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Spirit dis e repita este procedimento mais duas vezes. Fixe as células com 200 microlitros de 3% por altura múltipla por poço em temperatura ambiente por 30 minutos.

Lave as células três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Alize as células com solução de ização em temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a tampa do sono do poço usando uma pinça fina.

Drene o excesso de fluido fazendo DP na borda da tampa. Deslize contra um papel branco. Coloque o lado da célula da tampa.

Durma com 25 microlitros de anticorpo de proteína e dengue em um pedaço de parfum. Incubar durante uma hora numa câmara húmida à temperatura ambiente e protegida da luz. Em seguida, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e adicione dois mililitros de tampão de lavagem por óleo.

Aspire o supinado. Repita essas etapas de lavagem mais duas vezes após a última lavagem. Remova a lamínula do poço usando fp fino.

Drene o excesso de fluido mergulhando a borda da tampa. Deslize contra um lenço de papel. Coloque o lado da célula da tampa.

Durma em 25 microlitros de piso Alexa para oito anticorpos secundários anti-camundongo em um pedaço de perfume. Incubar por 45 minutos em uma câmara úmida em temperatura ambiente protegida da luz após a conclusão da incubação, transferir a tampa dormir para uma placa de seis poços e lavar as células três vezes com dois mililitros de tampão de lavagem para cada lavagem após a última lavagem. Remova a lamínula do poço e enxágue uma vez na água ionizada.

Drene o excesso de fluido mergulhando contra um papel. Limpe a montagem da lamínula em uma luz de microscópio com oito microlitros de solução de montagem suave. Deixe a solução de montagem definir o ar durante a noite em quatro graus Celsius.

A amostra agora está pronta para ser visualizada com um microscópio fluorescente ou confocal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão na superfície da tampa do sono e aperte o microscópio. Deslize para o estágio do microscópio.

Ajuste a platina até que a objetiva do microscópio entre em contato com o óleo de imersão. Para uma imagem claral, desligue as luzes ambiente usando o software Zes Zen. Clique na torneira ocular para observação direta da amostra através da ocular do microscópio.

Encontre um preenchimento com células e ajuste o foco. Agora mude para o modo de aquisição. Para minimizar a diafonia entre as quedas florais, selecione faixas separadas para Alexa floor 4 8 8 e finite four.

Corantes e aquisições de conjuntos para excitação e detecção sequenciais. Ajuste o ganho de potência e o deslocamento do laser para garantir que a imagem não fique superexposta ou subexposta. Capture a imagem e analise uma área de interesse usando a função de colocalização.

O coeficiente de sobreposição pode ser usado para estimar o grau de marcação do vírus da dengue pelo corante Alexa Flo. Um ensaio de imunofluorescência simples foi feito em células virais e o grau de marcação pode ser estimado a partir da colocalização do vírus marcado Com a proteína anti e, a coeficiência de sobreposição de coloração anticorpo varia de 0,65 a 0,8, sugerindo que aproximadamente 65 a 80% das variações foram marcadas com o corante de piso Alexa. Para que o procedimento de rotulagem seja bem-sucedido, é importante preparar o tampão de rotulagem e começar a se enfurecer e reconstituir o resumo do piso Alexa antes da rotulagem.

A concentração de corante a ser usada pode ser otimizada ainda mais para atender às suas necessidades. Este método de marcação do vírus da dengue no horizonte pode ser adaptado para rotular outros vírus. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte para o seu experimento de rotulagem.