Name: Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a rotular o vírus da dengue com Alexa Fluor para estudos microscópicos. Este método permite visualizar as interações iniciais entre o vírus e as células hospedeiras, auxiliando na compreensão da patogênese viral.

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Este trabalho foi financiado pela National Medical Research Council, de Cingapura.

1. Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue <ol><li> Antes da reação de rotulagem, purificar o vírus da dengue com almofada de sacarose e preparar os reagentes e equipamentos necessários, conforme indicado no protocolo. </li><li> Prepare tampão de bicarbonato de sódio 0,2 M fresca, pH 8,5 (tampão de marcação), e 1,5 M tampão hidroxilamina, pH 8.3 (parar de reagente), pouco antes de rotulagem e filtro de esterilizar com filtros de seringa 0,2 Hm. </li><li> Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades formadoras de placa (UFP) de vírus da dengue purificada em 1ml de rotulagem de buffer em um tubo de 2 ml. Isto pode ser ampliado proporcionalmente para a rotulagem lote de vírus. </li><li> Reconstituir o liofilizado Alexa Fluor 594 (AF594) ésteres succinimidyl 1mm de rotulagem tampão imediatamente antes da reação rotulagem. Fluorocromos outra do Alexa Fluor corante série pode ser usado de acordo com nossas necessidades. Minimizar a exposição à luz a partir desta etapa. </li><li> Adicionar 100μl do AF594 1mM corante ao vírus diluído agitando suavemente com a ponta da pipeta. </li><li> Incubar a mistura de reacção rotulagem em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. Misture por inversão suave a cada 15mins. </li><li> Girar o tubo brevemente em uma centrífuga de mesa e adicionar 100μl do reagente de parada para a mistura de reacção, agitando suavemente com a ponta da pipeta. </li><li> Incubar a temperatura ambiente por uma hora adicional no escuro. Misture por inversão suave a cada 15mins. </li></ol> 2. Purificando Alexa Fluor rotulados vírus da dengue <ol><li> Nesse meio tempo, equilibrar a coluna de purificação com tampão de escolha. Neste experimento, uma coluna PD-10 é equilibrada com 25ml de tampão HNE (Hepes 5mM, 150mm NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, antes de usar. </li><li> Aplicar o vírus rotulados para o topo da coluna e começar a recolher o fluxo através uma vez que o vírus entra no rotulados matriz. Preencher a coluna com tampão HNE uma vez todos os vírus rotulados entrou na matriz. Descartar o primeiro de 2,5 ml de fluxo e recolher o 2ml próxima da fração vírus rotulados. </li><li> Alíquotas e armazenar purificada AF594 vírus da dengue rotulados de -80 ° C, longe da fonte de luz. </li></ol><ol><li> Descongelar uma alíquota e determinar o título do vírus marcado pelo ensaio de placa antes de usar o lote de vírus rotulados. </li><li> Semente de 5x10 4 por bem de células Vero, cultivadas em M-199 meio de crescimento, em uma placa de quatro poços com uma lamela na parte inferior do bem um dia antes da infecção. </li><li> Retire o sobrenadante da cultura em bem e infectar as células com multiplicidade de infecção de um vírus da rotulados em volume 100μl (diluído em M-199 meio de manutenção, conforme necessário) para 10min a 37 ° C. </li><li> Remover o inóculo e lavar as lamelas duas vezes em 1xPBS. </li><li> Fixar as células em paraformalydehyde 3% para 30 minutos. </li><li> Lavar as lamelas 3 vezes em 1xPBS. </li><li> Permeabilizar as células com uma solução de permeabilização contendo saponina 0,1% e BSA 5% em 1xPBS para 30 minutos. </li><li> Incubar as células com puro-centrifugação sobrenadante clarificado da cultura hibridoma anticorpo monoclonal 3H5 para 1h em câmara úmida, protegido da luz. </li><li> Lavar as lamelas 3 vezes em tampão de lavagem (1xPBS contendo 1mM de cloreto de cálcio, cloreto de magnésio 1 mM e 0,1% saponina). </li><li> Incubar as células com anticorpos IgG AF488 anti-mouse, diluída em solução 1:100 permeabilização, por 45mins em câmara úmida, protegido da luz. </li><li> Lavar as lamelas 3 vezes em tampão de lavagem e enxágüe de vez em água deionizada. </li><li> Dab a borda da lamínula contra uma toalha de papel para drenar o excesso de água e monte sobre a lâmina de vidro com 8μl Mowiol 4-88 Dabco contendo 2,5%. </li><li> Permitir que a solução de montagem para definir durante a noite a 4 ° C antes de visualizar usando um microscópio confocal Zeiss. Aquisições seqüenciais devem ser realizadas fluoróforo uma emocionante ao mesmo tempo e alternar entre os detectores concomitantemente. </li><li> As imagens são então analisados ​​para co-localização da coloração de anticorpos E proteínas com o vírus rotulados usando o software LSM Zeiss Zen para estimar o grau de rotulagem. </li></ol> 3. Resultados representante Um exemplo da produção de vírus da dengue marcado com corante AF594 é mostrado na Figura 2. Normalmente, menos de 10 vezes caem do título inicial deve ser observado após a rotulagem de sucesso. No entanto, deve-se notar que todos os buffers tem que estar preparado para a nova rotulagem para ser bem sucedido e os ésteres Alexa Fluor succinimidyl deve ser utilizado imediatamente após a reconstituição como eles hidrolisar em nonreactive ácidos livres em soluções aquosas 8. Em seguida, o vírus rotulados tem que ser verificada para fluorescência suficiente antes do uso em experimentos. Um simples teste de imunofluorescência foi feito em células Vero e do grau de rotulagem pode ser estimada a partir da co-localização do vírus marcados com anti-E coloração do anticorpo da proteína. Cortaral células foram examinadas e uma imagem típica confocal é mostrado na Figura 3. Co-localização análise das imagens utilizando o software LSM Zen demonstraram sobreposição coeficientes que variam de 0,65-0,8, sugerindo que cerca de 65 a 80% do virions foram marcados com o corante. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura esquema 1.Overall retratando o Alexa Fluor rotulagem tintura de dengue procedimento vírus. Primeiro, os buffers relevantes e vírus da dengue purificada estão preparados. O Alexa Fluor corante é reconstituído e adicionado ao vírus da dengue diluído em rotulagem buffer. A reação é então interrompida uma hora depois, com a adição do reagente de parar. Posteriormente, o vírus rotulados é purificado através de uma coluna de exclusão de tamanho para remover tinta livre. Finalmente, o vírus é rotulado re-titulada por ensaio de placa e testado para fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. O número médio de virions viáveis ​​(UFP / ml), conforme determinado em um ensaio de placa antes e depois da AF594 rotulagem. Uma alíquota do AF594 vírus da dengue é rotulado descongeladas e re-titulada por ensaio de placa e ele mostra tipicamente menos de 10 vezes queda de o título de partida. Barras de erro indicam o desvio padrão de duplicatas. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Co-localização de AF594 etiquetas com proteínas do vírus da dengue E em células Vero. Células cultivadas em lamínulas no dia anterior estavam infectadas com dengue AF594 rotulada a MOI de 1 por 10 minutos a 37 ° C. As células foram fixadas e marcadas com anti-E de anticorpos, e examinadas para co-localização da proteína E (verde) e AF594 rotulagem (vermelho). Sinais fluorescentes foram visualizados sob a ampliação 63X usando Zeiss LSM 710 microscópio confocal. Barra de escala é 10μm. Amarelas indicam áreas de co-localização, como mostrado no encarte.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
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<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
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<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

Embora AF594 corante foi usado neste relatório, uma ampla gama de fluoróforos na succinimidyl Alexa Fluor ésteres série está disponível com a química rotulagem similar. Isso poderia estender a aplicação rotulagem além de imagens. Citometria de fluxo pode ser usado como uma alternativa para microscopia confocal para estimar o grau de rotulagem para os fluoróforos que pode ser animado e detectado pela máquina FACS. Corantes Alexa Fluor são pequenas moléculas que reagem com grupos amino livres,...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hidroxilamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 ésteres succinimidyl </td><td> Sondas moleculares, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 coluna </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 bem-placa </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmina de microscópio </td><td> Vela Marca </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hibridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> 1 Base de Dados </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Para preparar M-199 meio de crescimento, adicionar 50ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril. Para preparar M-199 meio de manutenção, adicionar 15ml de FBS, 5 ml de piruvato de sódio e 5 ml de não-aminoácidos essenciais para 500ml de M-199, filtro estéril.

visualizando vírus da dengue por meio alexa fluor labeling

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Os eventos iniciais na interação entre vírus e células podem ter profunda influência sobre o resultado da infecção. Determinar os fatores que influenciam essa interação pode levar a uma melhor compreensão da patogênese da doença e assim influenciar a vacina ou o projeto terapêutico. Assim, o desenvolvimento de métodos para investigar essa interação seria útil. Os recentes avanços na fluoróforos desenvolvimento 1-3 e tecnologia de imagem 4 pode ser explorada para melhorar o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da dengue e assim pavimentar o caminho para reduzir os milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente. O vírus da dengue envolvido tem um andaime externo composto de 90 glicoproteína do envelope (E) dímeros que protejam o reservatório nucleocapsídeo, que contém uma fita única de RNA positivo genoma 5. As subunidades idênticas de proteína na superfície do vírus pode assim ser rotulados com um corante reativo de amina e visualizados através de microscopia de imunofluorescência. Aqui, apresentamos um método simples de rotulagem do vírus da dengue com Alexa Fluor succinimidyl éster corante dissolvido diretamente em um buffer de bicarbonato de sódio que rendeu vírus altamente viável após rotulagem. Não existe um procedimento padronizado para a rotulagem de vírus vivo e protocolo do fabricante existente para a rotulagem de proteínas geralmente requer a reconstituição do corante em dimetilsulfóxido. A presença de dimetilsulfóxido, mesmo em quantidades mínimas, podem bloquear a infecção produtiva de vírus e também induzir citotoxicidade de 6 células. A exclusão do uso de dimetil sulfóxido neste protocolo, assim, reduzida essa possibilidade. Corantes Alexa Fluor têm fotoestabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que as tinturas comuns, como a fluoresceína e rodamina 2, tornando-as ideais para estudos sobre a absorção celular e transporte endossomal do vírus. A conjugação de Alexa Fluor tintura não afeta o reconhecimento do vírus da dengue rotulado por vírus específicos de anticorpos e seus supostos receptores em células hospedeiras 7. Esse método pode ter aplicações úteis em estudos virológicos.

Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

Os eventos iniciais na interação entre o vírus e a célula podem ter uma influência profunda no desfecho da infeção. Determinar os fatores que...

O objetivo geral deste experimento é marcar fluorescentemente o vírus da dengue para estudos microscópicos. Prepare os tampões necessários e purifique o vírus da dengue com uma camada de sacarose; reconstitua o corante Amy React Alexa flow e o vírus da dengue no tampão de marcação. Marque o vírus da dengue com uma concentração de cem micromolar de Alexa flow.Incubar por uma hora e interromper a reação de marcação com o reagente sub. Purificar o vírus da dengue marcado por meio de uma coluna de exclusão por tamanho. Retitar o vírus marcado por ensaio de placa e estimar o grau de marcação por ensaio de imunofluorescência.Olá, sou Sam Jang dos Laboratórios Nacionais DSO, trabalhando no laboratório do Dr. Wee no programa de doenças infecciosas emergentes após a Escola de Medicina Graduada da NUS. Hoje vou mostrar como marcar fluorescentemente o vírus Denki com o corante Alexa Fluor reativo a aminas para estudos de imagem. Os corantes Alexa Fluor apresentam estabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que corantes comuns como a fluoresceína e a rodamina, tornando-os ideais para estudos sobre captação celular e transporte endossomal do vírus.Um rótulo Alexa com defeito rotulado como vírus da dengue facilitará a compreensão da patogênese da dengue. Então, vamos começar. Antes da reação de marcação, prepare tampão de marcação fresco e reagente de parada de acordo com o protocolo escrito e purifique o vírus da dengue por meio de colchão de sacarose; adicione o volume apropriado do vírus da dengue purificado ao tampão de marcação em um tubo de microcentrífuga para atingir uma concentração de 300 milhões de unidades formadoras por mililitro.Isso pode ser aumentado proporcionalmente. Para marcação em lote do vírus. Reconstitua o corante liofilizado Alexa floor até uma concentração de um milimolar no tampão de marcação logo antes da reação de marcação.Minimize a exposição à luz a partir deste passo em diante. Para fins de demonstração, o corante Alexa floor será deixado sem proteção contra a luz. Adicione 800 microlitros da solução de corante Alexa flow de um milimolar ao vírus da dengue diluído, sob agitação suave com a ponteira de micropipeta.Incube por uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, misturando com inversões suaves a cada 15 minutos. Após uma hora, centrifugue os tubos brevemente. Adicione 800 microlitros da sub-região, pipetando suavemente, e incube por mais uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, com mistura por inversões suaves a cada 15 minutos.Enquanto isso, equilibre a coluna de purificação com 25 mililitros de tampão HNE. Após a incubação de uma hora, aplique o vírus marcado na coluna e comece a coletar o fluxo que passa. Preencha a coluna com tampão HNE.Uma vez que todo o vírus marcado tenha entrado na matriz, descarte os primeiros 2,5 mililitros do fluxo e colete os próximos dois mililitros da fração de vírus marcado. Armazene o vírus marcado purificado a menos 80 graus Celsius. Determine o título do vírus marcado por ensaio de placa.Em um experimento típico, deve-se observar uma queda inferior a dez vezes no título do vírus. Após a marcação, deve-se realizar um ensaio de imunofluorescência para avaliar o grau de marcação. Para isso, enumere as células virais utilizando um hemocitômetro e adicione o volume apropriado de células ao meio de crescimento para atingir uma densidade de 50.000 células por mililitro.Adicione um mililitro de células virais por poço em uma placa de quatro poços contendo uma lamínula de vidro estéril. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Remova a placa do incubador e aspire o sobrenadante de cada poço; então, infecte as células com aproximadamente uma MOI do vírus marcado em um volume de cem microlitros durante 10 minutos a 37 graus Celsius.Remova o inóculo e lave as células com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Aspire e repita este procedimento mais duas vezes. Fixe as células com 200 microlitros de paraformaldeído a 3% por poço à temperatura ambiente por 30 minutos.Lave as células três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Incube as células com a solução de fixação à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a lamínula do poço utilizando pinça fina.Remova o excesso de fluido pressionando a borda da lamínula contra um papel branco. Posicione o lado das células da lamínula.Incube 25 microlitros de anticorpo contra proteína E da dengue sobre um pedaço de lamínula. Incube por uma hora em câmara úmida à temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e adicione dois mililitros de tampão de lavagem por poço.Aspire o sobrenadante. Repita essas etapas de lavagem mais duas vezes após a última lavagem. Remova a lamínula do poço usando pinça fina.Remova o fluido em excesso mergulhando a borda da lamínula. Deslize contra uma toalha de papel. Coloque o lado da lamínula voltado para as células.Incube 25 microlitros de Alexa com anticorpo secundário anti-rato em uma lamínula por oito oito. Incube por 45 minutos em câmara úmida, à temperatura ambiente e protegido da luz. Após a incubação, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e lave as células três vezes com dois mililitros de tampão de lavagem para cada lavagem. Após a última lavagem, remova a lamínula do poço e enxágue uma vez com água ionizada.Remova o excesso de fluido mergulhando contra um papel. Com uma pipeta, coloque a lamela sobre a luz do microscópio com oito microlitros de solução de montagem suave. Deixe a solução de montagem secar durante a noite no ar a quatro graus Celsius.A amostra agora está pronta para ser visualizada com um microscópio fluorescente ou confocal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a superfície do lamínula e fixe o microscópio. Deslize para o estágio do microscópio.Ajuste o estágio até que a objetiva do microscópio entre em contato com o óleo de imersão. Para uma imagem mais nítida, desligue as luzes ambiente usando o software Zes Zen. Clique na abertura ocular para observação direta da amostra através da ocular do microscópio.Encontre um campo com células e ajuste o foco. Agora, mude para o modo de aquisição. Para minimizar a interferência entre os canais, selecione pistas separadas para Alexa Fluor 488 e Finite Four.Use corantes e configure as aquisições para excitação e detecção sequenciais. Ajuste o ganho e o deslocamento da potência do laser para garantir que a imagem não fique superexposta ou subexposta. Capture a imagem e analise uma área de interesse utilizando a função de colocalização.O coeficiente de sobreposição pode ser usado para estimar o grau de marcação do vírus da dengue pelo corante Alexa Fluor. Um ensaio simples de imunofluorescência foi realizado em células virais e o grau de marcação pode ser estimado a partir da colocalização do vírus marcado com coloração por anticorpo anti-proteína E. Os valores do coeficiente de sobreposição variaram de 0,65 a 0,8, sugerindo que aproximadamente 65 a 80% das partículas virais foram marcadas com o corante Alexa Fluor. Para que o procedimento de marcação seja bem-sucedido, é importante preparar o tampão de marcação recém-fabricado e reconstituir o Alexa Fluor imediatamente antes da marcação.A concentração do corante a ser utilizada pode ser ainda otimizada para atender às suas necessidades. Este método de marcação de vírus da dengue pode potencialmente ser adaptado para rotular outros vírus. É isso.Obrigado por assistir e boa sorte em seu experimento de marcação.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

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Visualização tridimensional de uma infecção pelo vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos

A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

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Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Aqui nós apresentamos um método sensível, rápido, e discriminando da mancha do borne-gel aos RNAs da imagem etiquetados com os aptâmeros do RNA Mango mim, II, III, ou IV, usando géis nativos ou desnaturando do gel da electroforese do poliacrilamida (página). Depois de executar géis de página padrão, o RNA com a tag Mango pode ser facilmente manchado com TO1-biotina e depois analisado usando leitores de fluorescência comumente disponíveis.

Visualização fluorescente da Mango-Tagged RNA em géis de poliacrilamida através de um método de pós-coloração

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

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Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Aprenda a rotular o vírus da dengue com Alexa Fluor para estudos microscópicos. Este método permite visualizar as interações iniciais entre o vírus e as células hospedeiras, auxiliando na compreensão da patogênese viral.

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

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