Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling
9 de julho de 2011
Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.
O objetivo geral deste experimento é marcar fluorescentemente o vírus da dengue para estudos microscópicos. Prepare os tampões necessários e purifique o vírus da dengue com uma camada de sacarose; reconstitua o corante Amy React Alexa flow e o vírus da dengue no tampão de marcação. Marque o vírus da dengue com uma concentração de cem micromolar de Alexa flow.
Incubar por uma hora e interromper a reação de marcação com o reagente sub. Purificar o vírus da dengue marcado por meio de uma coluna de exclusão por tamanho. Retitar o vírus marcado por ensaio de placa e estimar o grau de marcação por ensaio de imunofluorescência.
Olá, sou Sam Jang dos Laboratórios Nacionais DSO, trabalhando no laboratório do Dr. Wee no programa de doenças infecciosas emergentes após a Escola de Medicina Graduada da NUS. Hoje vou mostrar como marcar fluorescentemente o vírus Denki com o corante Alexa Fluor reativo a aminas para estudos de imagem. Os corantes Alexa Fluor apresentam estabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que corantes comuns como a fluoresceína e a rodamina, tornando-os ideais para estudos sobre captação celular e transporte endossomal do vírus.
Um rótulo Alexa com defeito rotulado como vírus da dengue facilitará a compreensão da patogênese da dengue. Então, vamos começar. Antes da reação de marcação, prepare tampão de marcação fresco e reagente de parada de acordo com o protocolo escrito e purifique o vírus da dengue por meio de colchão de sacarose; adicione o volume apropriado do vírus da dengue purificado ao tampão de marcação em um tubo de microcentrífuga para atingir uma concentração de 300 milhões de unidades formadoras por mililitro.
Isso pode ser aumentado proporcionalmente. Para marcação em lote do vírus. Reconstitua o corante liofilizado Alexa floor até uma concentração de um milimolar no tampão de marcação logo antes da reação de marcação.
Minimize a exposição à luz a partir deste passo em diante. Para fins de demonstração, o corante Alexa floor será deixado sem proteção contra a luz. Adicione 800 microlitros da solução de corante Alexa flow de um milimolar ao vírus da dengue diluído, sob agitação suave com a ponteira de micropipeta.
Incube por uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, misturando com inversões suaves a cada 15 minutos. Após uma hora, centrifugue os tubos brevemente. Adicione 800 microlitros da sub-região, pipetando suavemente, e incube por mais uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, com mistura por inversões suaves a cada 15 minutos.
Enquanto isso, equilibre a coluna de purificação com 25 mililitros de tampão HNE. Após a incubação de uma hora, aplique o vírus marcado na coluna e comece a coletar o fluxo que passa. Preencha a coluna com tampão HNE.
Uma vez que todo o vírus marcado tenha entrado na matriz, descarte os primeiros 2,5 mililitros do fluxo e colete os próximos dois mililitros da fração de vírus marcado. Armazene o vírus marcado purificado a menos 80 graus Celsius. Determine o título do vírus marcado por ensaio de placa.
Em um experimento típico, deve-se observar uma queda inferior a dez vezes no título do vírus. Após a marcação, deve-se realizar um ensaio de imunofluorescência para avaliar o grau de marcação. Para isso, enumere as células virais utilizando um hemocitômetro e adicione o volume apropriado de células ao meio de crescimento para atingir uma densidade de 50.000 células por mililitro.
Adicione um mililitro de células virais por poço em uma placa de quatro poços contendo uma lamínula de vidro estéril. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Remova a placa do incubador e aspire o sobrenadante de cada poço; então, infecte as células com aproximadamente uma MOI do vírus marcado em um volume de cem microlitros durante 10 minutos a 37 graus Celsius.
Remova o inóculo e lave as células com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Aspire e repita este procedimento mais duas vezes. Fixe as células com 200 microlitros de paraformaldeído a 3% por poço à temperatura ambiente por 30 minutos.
Lave as células três vezes com 0,5 mililitros de tampão PBS por poço. Incube as células com a solução de fixação à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a lamínula do poço utilizando pinça fina.
Remova o excesso de fluido pressionando a borda da lamínula contra um papel branco. Posicione o lado das células da lamínula.
Incube 25 microlitros de anticorpo contra proteína E da dengue sobre um pedaço de lamínula. Incube por uma hora em câmara úmida à temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e adicione dois mililitros de tampão de lavagem por poço.
Aspire o sobrenadante. Repita essas etapas de lavagem mais duas vezes após a última lavagem. Remova a lamínula do poço usando pinça fina.
Remova o fluido em excesso mergulhando a borda da lamínula. Deslize contra uma toalha de papel. Coloque o lado da lamínula voltado para as células.
Incube 25 microlitros de Alexa com anticorpo secundário anti-rato em uma lamínula por oito oito. Incube por 45 minutos em câmara úmida, à temperatura ambiente e protegido da luz. Após a incubação, transfira a lamínula para uma placa de seis poços e lave as células três vezes com dois mililitros de tampão de lavagem para cada lavagem. Após a última lavagem, remova a lamínula do poço e enxágue uma vez com água ionizada.
Remova o excesso de fluido mergulhando contra um papel. Com uma pipeta, coloque a lamela sobre a luz do microscópio com oito microlitros de solução de montagem suave. Deixe a solução de montagem secar durante a noite no ar a quatro graus Celsius.
A amostra agora está pronta para ser visualizada com um microscópio fluorescente ou confocal. Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a superfície do lamínula e fixe o microscópio. Deslize para o estágio do microscópio.
Ajuste o estágio até que a objetiva do microscópio entre em contato com o óleo de imersão. Para uma imagem mais nítida, desligue as luzes ambiente usando o software Zes Zen. Clique na abertura ocular para observação direta da amostra através da ocular do microscópio.
Encontre um campo com células e ajuste o foco. Agora, mude para o modo de aquisição. Para minimizar a interferência entre os canais, selecione pistas separadas para Alexa Fluor 488 e Finite Four.
Use corantes e configure as aquisições para excitação e detecção sequenciais. Ajuste o ganho e o deslocamento da potência do laser para garantir que a imagem não fique superexposta ou subexposta. Capture a imagem e analise uma área de interesse utilizando a função de colocalização.
O coeficiente de sobreposição pode ser usado para estimar o grau de marcação do vírus da dengue pelo corante Alexa Fluor. Um ensaio simples de imunofluorescência foi realizado em células virais e o grau de marcação pode ser estimado a partir da colocalização do vírus marcado com coloração por anticorpo anti-proteína E. Os valores do coeficiente de sobreposição variaram de 0,65 a 0,8, sugerindo que aproximadamente 65 a 80% das partículas virais foram marcadas com o corante Alexa Fluor. Para que o procedimento de marcação seja bem-sucedido, é importante preparar o tampão de marcação recém-fabricado e reconstituir o Alexa Fluor imediatamente antes da marcação.
A concentração do corante a ser utilizada pode ser ainda otimizada para atender às suas necessidades. Este método de marcação de vírus da dengue pode potencialmente ser adaptado para rotular outros vírus. É isso.
Obrigado por assistir e boa sorte em seu experimento de marcação.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para marcação fluorescente do vírus da dengue utilizando Alexa Fluor para análise microscópica. A abordagem permite a visualização das interações iniciais entre o vírus e as células hospedeiras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Microscopia de Fluorescência
- Biologia Celular
Contexto
- O vírus da dengue é uma preocupação significativa para a saúde global.
- Compreender as interações entre vírus e células é fundamental para o desenvolvimento de estratégias antivirais.
- A marcação fluorescente melhora a visualização dessas interações.
- Os avanços nas tecnologias de imagem facilitam estudos detalhados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para marcar o vírus da dengue.
- Visualizar as interações entre o vírus da dengue e as células hospedeiras.
- Aprimorar a compreensão das fases iniciais da infecção viral.
Métodos Utilizados
- Preparação dos tampões necessários para marcação.
- Purificação do vírus da dengue utilizando colchão de sacarose.
- Reconstituição do corante Alexa Fluor no tampão de marcação.
- Marcação do vírus com uma concentração específica de corante.
Resultados Principais
- Marcação fluorescente bem-sucedida do vírus da dengue.
- Visualização das interações entre vírus e célula ao microscópio.
- Avaliação da eficiência de marcação por meio de ensaio de imunofluorescência.
- Retitulação do vírus marcado utilizando ensaio de placas.
Conclusões
- O método fornece uma maneira simples e eficaz de marcar o vírus da dengue.
- A marcação fluorescente auxilia no estudo das interações entre vírus e hospedeiro.
- Essa técnica pode ser aplicada a outros estudos virais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação fluorescente direta do vírus da dengue com Alexa Fluor permite a visualização precisa das interações entre vírus e célula, apoiando estudos mecanicistas em estágios iniciais na pesquisa de doenças infecciosas. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e orienta estratégias translacionais para o desenvolvimento de antivirais e vacinas. A compatibilidade do método com vírus vivo e com imagem quantitativa reforça seu valor em pontos críticos de descoberta e pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de entrada e tráfego viral em células hospedeiras.
- Auxilia na redução de riscos biológicos ao esclarecer eventos iniciais de infecção relevantes para a patogênese.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da visualização de interações de vírus marcados.
- Aprimora a confiança preditiva para testes hipotéticos de terapias subsequentes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece uma abordagem padronizada para o preparo de vírus marcados com fluoróforo para ensaios baseados em imagem.
- Garante reprodutibilidade e avaliação quantitativa da eficiência de marcação por meio de ensaios de imunofluorescência e de placas.
- Permite o escalonamento do marcação em lote, adequado para plataformas de triagem de alto conteúdo.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos antivirais na entrada e tráfego do vírus nas células.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos relevantes para doenças ao preservar a infectividade viral após a marcação.
- Permite a continuidade do descobrimento mecanicista até a validação pré-clínica de estratégias de intervenção.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer leituras quantitativas por imagem.
- Facilita o alinhamento de biomarcadores por meio da análise de colocalização de marcadores virais e celulares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de marcação integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando estudos orientados por hipóteses, desenvolvimento de ensaios e pesquisas translacionais sobre patogênese viral.
- Biologia da Descoberta: Avança a compreensão mecanicista das interações vírus-hospedeiro por meio da visualização direta e da colocalização quantitativa.
- Triagem: Fornece preparações de vírus marcados reprodutíveis para triagem baseada em imagem de candidatos antivirais.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, como coeficientes de sobreposição e títulos de infectividade, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Mantém o vírus funcional para uso em modelos celulares relevantes para doenças e estudos de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo amplamente adaptável para marcação de outros vírus envelopados em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em pesquisas virológicas de estágio inicial.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de marcação e imageamento viral para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/interromper e otimiza a alocação de recursos ao permitir uma validação robusta de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos a antivirais e vacinas com base em dados quantitativos de imageamento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em virologia, microscopia de fluorescência e análise quantitativa de imagens.
- Necessita de acesso a plataformas de imagemagem de alta qualidade e software analítico para estudos de colocalização.
- Exige preparação rigorosa de tampões e manipulação cuidadosa de corantes para garantir reprodutibilidade e minimizar a citotoxicidade.
- Adaptável a outros vírus envelopados mediante otimização do protocolo para sistemas virais específicos.
- Depende da manutenção da viabilidade viral e da eficiência de marcação para aplicações posteriores.
