Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Os vírus alfa são vírus de RNA transmitidos por mosquitos que infectam persistentemente células de mosquitos suscetíveis com citopatologia mínima. Este protocolo mostra a utilidade dos sistemas de transdução do vírus alfa infeccioso que expressam repórteres fluorescentes para detecção de infecção por vetor e transmissão de vírus. Primeiro alimente os mosquitos fêmeas com uma refeição de sangue contendo o vírus alfa de interesse, depois determine a eficiência da infecção do mosquito e selecione apenas os mosquitos que expressam o gene marcador.

Em seguida, colha saliva dos mosquitos infectados e demonstre a transmissibilidade infectando células de mosquito cultivadas com saliva coletada. Resultados obtidos por microscopia epifluorescente. Visualize um relatório de proteína como GFP e, assim, rastreie a infecção por vetores e a transmissão de vírus por espécies de mosquitos dos anos oitenta ou QE.

Os sistemas de expressão do vírus alfa ou ATSs podem ser usados para avaliar rapidamente a expressão gênica e os mosquitos vetores tanto para estudos de arbovírus quanto antes de fazer manipulações mais difíceis de mosquitos, como a transgênese do mosquito. Demonstrando esses procedimentos estarão a Dra. Irma Sanchez Vargas, o Dr. Eric Mossel e Aaron Phillips do laboratório do Dr. Ken Olson. Para produzir um vírus TS em células Bhk 21, use um vírus recombinante symbis que expresse o repórter GFP após a transcrição in vitro, eletrorate o RNA do sistema de transdução do vírus alfa genômico em células bhk 21.

Em seguida, resgate e amplifice o vírus antes da infecção. Prepare os mosquitos para uma alimentação eficiente de sangue de um alimentador artificial por privação de alimentos. Retire o açúcar 24 horas e regue 12 horas antes da alimentação.

Sangue animal desfibrilado ou citrado obtido comercialmente misturado com a cultura de células preparada derivou uma suspensão do vírus TS para infecção eficiente do intestino médio dos mosquitos. Formule 10 às sete unidades formadoras de placas por mililitro de título de vírus para a refeição de sangue para estimular os mosquitos a ingurgitar. Adicione um TP a uma concentração final de 0,02 molar.

Coloque uma membrana intestinal de sinal de poro sobre a boca do alimentador de vidro com camisa de água. Em seguida, configure os comedouros com água circulante a 37 graus Celsius. Em seguida, pipete a farinha para a câmara e coloque os comedouros com segurança na caixa.

Depois de alimentar os mosquitos por 10 a 30 minutos, separe os mosquitos anestesiados a frio para as amostras ingurgitadas de sangue para permitir a replicação e disseminação de um vírus TS nos mosquitos selecionados. Incube-os a 28 graus Celsius e 75% de umidade relativa por oito a 10 dias. Para imobilizar os mosquitos.

Coloque a caixa de papel a quatro graus Celsius por aproximadamente 15 minutos. Agora, transfira de cinco a 10 mosquitos para uma mesa fria adaptada para uso em um microscópio fluorescente. Examine e classifique os mosquitos com base na presença ou ausência de fluorescência.

Retorne os mosquitos selecionados para a caixa de papel para uso conforme desejado. Neste ponto, determine a eficiência da infecção usando a intensidade fluorescente como proxy. Finalmente, disseque tecidos como intestinos médios, glândulas SIV e corpos adiposos e monitore a fluorescência.

Esses órgãos e tecidos podem ser dissecados em momentos anteriores, se desejado. Prive os mosquitos da fonte de açúcar por 24 horas antes da alimentação. Prepare um tubo capilar de 50 microlitros que foi aquecido, puxado e cortado com três a cinco microlitros de Cargill.

Óleo de imersão tipo B para garantir que os mosquitos não escapem. Remova suas pernas e asas. Agora insira os probos no tubo.

Monitore cuidadosamente as gotículas de saliva que exalam dos probos para o óleo de imersão. Se necessário, coloque uma gota de pilocarpina a 1% no tórax do mosquito para aumentar a salivação após 60 a 90 minutos, remova os mosquitos e armazene-os para futuro isolamento do vírus. Agora, para colher a solução do tubo capilar, expulse a mistura de óleo de saliva em um tubo contendo 500 microlitros de 20% de gordura estéril.

Filtre o inóculo através de um filtro de seringa de 0,2 mícron e, em seguida, use esse inóculo para infectar células cultivadas em células de mosquito. A eficácia da infecção com cinco principais vírus DS MRE 16 GFP é avaliada pela expressão de GFP. Com o tempo, essas células foram infectadas com vírus em 0,01 de multiplicidade de infecção.

Um microscópio de epifluorescência permite a visualização de todo o corpo da GFP no mosquito infectado, bem como nas diferentes partes do corpo aqui 10 dias após a infecção. A expressão seletiva de GFP por órgãos é indicativa de uma infecção disseminada. Os intestinos médios geralmente têm infecções de focos distintos logo após a ingestão de uma refeição de sangue contendo vírus que se espalha por todo o intestino médio posterior em momentos posteriores após a infecção.

Esses eventos são sinalizados pelos repórteres do GFP e do DS RED. O ensaio de transmissão indica que cinco vírus DS MRE 16 GFP prime expressam de forma estável GFP durante todo o período de incubação extrínseco. No mosquito aqui, a GFP e a saliva do mosquito são detectadas oito dias após a infecção.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como infectar oralmente um vírus A TS em um mosquito, como avaliar visualmente a infecção por vírus em um mosquito e como avaliar a transmissão do vírus do mosquito.