Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Os alfavírus são vírus de RNA transmitidos por mosquitos que infectam persistentemente células de mosquitos suscetíveis com mínima citopatologia. Este protocolo demonstra a utilidade de sistemas transdutores infecciosos de alfavírus que expressam marcadores fluorescentes para detecção da infecção do vetor e da transmissão viral. Primeiramente, ofereça às fêmeas de mosquito uma refeição sanguínea contendo o alfavírus de interesse, depois determine a eficiência de infecção dos mosquitos e selecione apenas os mosquitos que expressam o gene marcador.

Em seguida, colete a saliva dos mosquitos infectados e demonstre a transmissibilidade infectando células de mosquito cultivadas com a saliva coletada. Resultados obtidos por microscopia epifluorescente. Visualize um relato de proteína semelhante à GFP e, assim, acompanhe a infecção do vetor e a transmissão do vírus por espécies do gênero Aedes ou Culex.

Os sistemas de expressão por alfavírus ou ATSs podem ser utilizados para avaliar rapidamente a expressão gênica e vetores de mosquitos tanto em estudos de arbovírus quanto antes de realizar manipulações mais complexas em mosquitos, como a transgênese de mosquitos. Demonstrarão esses procedimentos a Dra. Irma Sanchez Vargas, o Dr. Eric Mossel e Aaron Phillips do laboratório do Dr. Ken Olson. Para produzir um vírus TS em células BHK-21, utilize um vírus recombinante symbis que expresse o repórter GFP após a transcrição in vitro, e eletropore o RNA do sistema transdutor de alfavírus genômico em células BHK-21.

Em seguida, recupere e amplifique o vírus antes da infecção. Prepare os mosquitos para uma alimentação eficiente com sangue a partir de um alimentador artificial mediante privação alimentar. Remova o açúcar 24 horas e a água 12 horas antes da alimentação.

Misture sangue animal defibrilado ou citratado obtido comercialmente com a cultura celular preparada para derivar uma suspensão do vírus TS para infecção eficiente do intestino médio dos mosquitos. Formule uma titulação do vírus de 10 elevado a sete unidades formadoras de placa por mililitro na refeição sanguínea para estimular os mosquitos a se alimentarem até saciedade. Adicione TP até uma concentração final de 0,02 molar.

Coloque uma membrana intestinal de poro sobre a abertura do alimentador de vidro com jaqueta de água. Em seguida, monte os alimentadores com água circulando a 37 graus Celsius. Depois, pipete a refeição para dentro da câmara e posicione os alimentadores firmemente sobre a caixa.

Após alimentar os mosquitos por 10 a 30 minutos, separe-os com anestesia fria para selecionar os espécimes com sangue ingerido, permitindo a replicação e disseminação de um vírus TS nos mosquitos escolhidos. Incube-os a 28 graus Celsius e 75% de umidade relativa por oito a dez dias. A fim de imobilizar os mosquitos.

Coloque a caixa de papel no refrigerador a quatro graus Celsius por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, transfira cinco a 10 mosquitos para uma mesa de resfriamento adaptada para uso em um microscópio fluorescente. Examine e separe os mosquitos com base na presença ou ausência de fluorescência.

Devolver os mosquitos selecionados para a caixa de papel para uso conforme desejado. Neste ponto, determinar a eficiência de infecção utilizando a intensidade fluorescente como indicador. Por fim, dissecar tecidos como intestinos médios, glândulas salivares e corpos gordurosos, e monitorar a fluorescência.

Esses órgãos e tecidos podem ser dissecados em momentos anteriores, se desejado. Deixe os mosquitos sem fonte de açúcar por 24 horas antes da alimentação. Prepare um tubo capilar de 50 microlitros que tenha sido aquecido, puxado e cortado com três a cinco microlitros de Cargill.

Óleo de imersão tipo B para garantir que os mosquitos não escapem. Remova suas pernas e asas. Agora insira o aparelho bucal no tubo.

Monitore cuidadosamente as gotas de saliva que exsudam do probóscide para dentro do óleo de imersão. Se necessário, coloque uma gota de pilocarpina a 1% sobre o tórax do mosquito para aumentar a salivação após 60 a 90 minutos, remova os mosquitos e armazene-os para posterior isolamento do vírus. Agora, para coletar a solução do tubo capilar, expulse a mistura de saliva e óleo em um tubo contendo 500 microlitros de PBS estéril com 20% de FBS.

Filtre o inóculo através de um filtro de seringa de 0,2 mícron e, em seguida, utilize este inóculo para infectar células cultivadas em células de mosquito. A eficácia da infecção com o vírus GFP DS MRE 16 cinco prime é avaliada pela expressão de GFP. Ao longo do tempo, essas células foram infectadas com o vírus em uma multiplicidade de infecção de 0,01.

Um microscópio de fluorescência epi permite a visualização completa do corpo de GFP no mosquito infectado, bem como nas diferentes partes do corpo, aqui aos 10 dias pós-infecção. A expressão seletiva de GFP nos órgãos é indicativa de uma infecção disseminada. Os intestinos médios geralmente apresentam focos distintos de infecção logo após a ingestão de uma refeição sanguínea contendo o vírus, que se espalha por todo o intestino médio posterior em momentos posteriores à infecção.

Esses eventos são sinalizados pelos repórteres GFP e DS RED. O ensaio de transmissão indica que o vírus GFP DS MRE 16 cinco-primo expressa estavelmente GFP durante todo o período de incubação extrínseco. No mosquito aqui, GFP e saliva do mosquito são detectados já no oitavo dia pós-infecção.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como infectar oralmente um mosquito com um vírus A TS, como avaliar visualmente a infecção viral em um mosquito e como avaliar a transmissão do vírus pelo mosquito.