Name: Usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a usar corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans. Este protocolo educacional permite estudar metabolismo e envelhecimento de forma acessível.

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NOTA: A bactéria Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) e as cepas do tipo selvagem Bristol N2 podem ser obtidas no CGC, Universidade de Minnesota, EUA ou por doação de um laboratório de C. elegans . Para a segurança dos pesquisadores, é imprescindível o uso de Equipamentos de Proteção Individual. Embora as concentrações de reagentes como hipoclorito e hidróxido de sódio sejam baixas, é essencial usar o EPI recomendado, conforme destacado no manuscrito, para minimizar quaisquer riscos potenciais associados a esses produtos químicos.
1. Conteúdo de glicogênio
<ol><li>Preparação de placas de teste<ol><li>Prepare seis placas de ágar NGM de 60 mm x 15 mm20 (10 mL de ágar meio de crescimento de nematóides, NGM, conforme descrito na Tabela Suplementar 1) por cepa de verme e deixe-as secar por 1 dia em temperatura ambiente. Mantenha as placas fechadas para evitar contaminação.</li>
		<li>Adicione 200 μL de cultura líquida de E. coli OP50 (com densidade óptica = 0,600, aproximadamente no comprimento de onda de 600 nm) por placa para inocular um total de quatro placas NGM de 60 mm x 15 mm por cepa na capela de fluxo. Deixe as placas fechadas incubarem a 37 °C por 1 dia antes de usar. NOTA: Prepare seis placas (etapa 1.1), mas inocule apenas 4 com a bactéria E. coli OP50. Reservar as duas placas restantes a 4 °C para uso posterior ao colocar as minhocas em condições de fome. Esta análise pode ser efectuada em duplicado.</li>
		<li>No dia do teste, adicione 200 μL de D-glicose 0,025 M a duas placas de ágar NGM (6 mm x 15 mm) por cepa que foram previamente semeadas com bactérias E. coli OP50. Deixe as placas secarem em temperatura ambiente na coifa de fluxo. NOTA: As placas de ágar NGM semeadas com bactérias E. coli OP50 também podem ser secas perto de lâmpadas de álcool como alternativa ao uso de uma capa de fluxo.</li>
	</ol></li>
	<li>Sincronização<ol><li>Aproximadamente 3 dias antes da sincronização, transfira 3-4 pedaços (3 cm x 3 cm) de um ágar NGM de manutenção com C. elegans Bristol N2 (tipo selvagem) em diferentes estágios (cerca de 500 vermes por pedaço) para uma nova placa (150 mm x 90 mm) que foi previamente semeada com bactérias E. coli OP50.</li>
		<li>Coloque a nova placa com minhocas em um ambiente controlado a 20 °C e mantenha a umidade &gt;95% por 3 dias (72 h permitem que a maioria das minhocas atinja o estágio adulto gravídico). NOTA: A temperatura de crescimento pode precisar ser ajustada dependendo da(s) cepa( s) de C. elegans que está sendo usada.</li>
		<li>Usando uma pipeta Pasteur, colete os vermes da placa preparada com H2O destilado e transfira-os para um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Aguarde a sedimentação dos vermes por gravidade (aproximadamente 15 min) e depois remova o sobrenadante. Repita este processo 3x para eliminar as bactérias. Após a última lavagem, reduza o volume para 5 mL.</li>
		<li>Adicione 10 mL de solução clareadora (Tabela Suplementar 1) e agite vigorosamente com as mãos por aproximadamente 6 min.</li>
		<li>Imediatamente após a conclusão da agitação, encha os tubos até a capacidade de 50 mL com tampão M9.</li>
		<li>Centrifugue a 1400 x g durante 3 min, retire o sobrenadante até 5 ml e, em seguida, adicione novamente 45 ml de tampão M9. Repita este processo 4x.</li>
		<li>Após a última lavagem, reduza o volume para 15 mL e mantenha-o a temperatura (20 °C) e umidade (&gt;95%) controladas por aproximadamente 14 h. NOTA: O processo de sincronização pode ser substituído pela obtenção de ovos por oviposição: Transfira aproximadamente 20 vermes prenhes adultos para uma placa NGM (6 mm x 15 mm) previamente semeada com 200 μL de E. coli OP50. Deixe as minhocas botarem ovos por 1 dia. Depois disso, retire os vermes prenhes e espere os ovos eclodirem.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de minhocas<ol><li>Usando uma pipeta automática, adicione 10 μL dos vermes sincronizados (etapa 1.2.8) a uma lâmina de microscópio e conte o número de vermes. Calcule quanto volume deve ser pipetado para obter 500-1000 vermes/μL.</li>
		<li>Transferir 500-1000 vermes sincronizados L1 (passo 1.2.8) para placas de ágar NGM (150 mm x 90 mm, Tabela Suplementar 1) semeadas com bactérias E. coli OP50 como fonte de alimento, até atingirem o estágio 4 (L4) da larva a 20 °C. NOTA: Os vermes podem ser transferidos usando uma pipeta automática. Se uma pipeta automática não estiver disponível, use uma pipeta Pasteur de vidro e os volumes podem ser controlados usando rótulos de microtubos ou pipetas graduadas de vidro.</li>
		<li>Após 48 h de sincronização20: coletar as larvas L4 das placas com tampão M9 (Tabela Suplementar 1), com o auxílio de uma pipeta plástica Pasteur para um tubo cônico limpo de 50 mL e lavá-las 3x com tampão M9 fresco ou repetir as lavagens até que todas as bactérias E. coli OP50 remanescentes sejam completamente removidas (em temperatura ambiente). NOTA: A etapa de lavagem é importante porque alguns vermes passarão fome durante o procedimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o ensaio<ol><li>Transferir 500-1000 sem-fins L4 (passo 1.3.1) de cada uma das novas placas de ágar NGM (60mm x 15mm) previamente preparadas (passos 1.1.2 e 1.1.3). Mantenha-os a 20 °C durante 48 h até ao dia do ensaio. Este cronograma resultará em três grupos experimentais da seguinte forma, em duplicata (Figura 1): A- (fome): os vermes crescerão em placas regulares de ágar NGM sem a bactéria E. coli OP50; B- (regular): os vermes crescerão em placas regulares de ágar NGM semeadas com bactérias E. coli OP50; C- (glicose alta): os vermes crescerão em placas de ágar NGM semeadas com bactérias E. coli OP50 e contendo 0,025 M de D-glicose.</li>
		<li>No dia do teste (após 48 h): recolher as minhocas e dar-lhes três breves lavagens no tampão M9 (passos 1.2.2 e 1.2.3) NOTA: Aqui, prepare placas de ágar NGM com a adição de D-glicose (etapa 1.3) e reserve-as até a hora de adicionar os vermes.<ol><li>Coloração com iodo: prepare uma solução de iodo de lugol a 5% (v/v) (solução de iodo/iodeto de potássio) usando tampão M9 fresco. NOTA: A solução de iodo de Lugol pode ser obtida em fornecedores locais de reagentes ou farmácias, portanto, a concentração inicial pode variar. Se necessário, calcule para obter uma solução a 5% (v/v).</li>
		</ol></li>
		<li>Transfira aproximadamente 100 μL de vermes lavados (etapa 4.2) de cada grupo para o microtubo de 1,5 mL contendo solução diluída de Lugol (5% v / v). Usando uma pipeta automática na proporção de 1:5, transfira 100 μL de vermes para 400 μL de solução de Lugol, seguida de agitação suave em um misturador por 5 min. NOTA: Se um misturador não estiver disponível, é possível agitar os microtubos cuidadosamente com as mãos.</li>
		<li>Logo após esses 5 min, centrifugue o microtubo de 1,5 mL (vermes + solução de Lugol) a 1400 x g por 3 min. NOTA: Se este ensaio for realizado em vermes do estágio L4 ou além, é possível obter sedimentação por gravidade em vez de usar uma centrífuga. Deixe os microtubos abertos em racks na bancada por 10 min até que todos os vermes se assentem na parte inferior do microtubo.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e lave os vermes com 1,0 mL de tampão M9 fresco. Repita a lavagem até que todo o iodo restante seja removido da solução (mínimo 3x).</li>
		<li>Após a última etapa de lavagem, remova o sobrenadante, exceto por um resíduo de aproximadamente 100 μL. Use-o para ressuspender suavemente os vermes e para análise microscópica.</li>
		<li>Transfira aproximadamente 50 μL da solução de verme ressuspensa para lâminas de microscopia e cubra-as com lamínulas. Observe as imagens de campo claro usando um estereomicroscópio (a 1,5x). NOTA: Se um estereomicroscópio não estiver disponível, um microscópio comum pode ser usado e as imagens podem ser capturadas com uma câmera de telefone celular (em 3.4x) usando um adaptador. Para evitar erros de luz/brilho/exposição, é crucial que todas as configurações da câmera do celular permaneçam consistentes para todas as fotos.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspeção de dados<ol><li>Dados quantitativos: Calcule o conteúdo de glicogênio com base na coloração de iodo de vermes.<ol><li>Salve imagens do estereomicroscópio contendo um mínimo de 10 vermes por grupo como um arquivo .jpeg para processamento posterior. Baixe o software gratuito ImageJ para fazer isso. Os detalhes são fornecidos no Arquivo Suplementar 1, Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2.</li>
			<li>Abra a imagem .jpeg usando o software ImageJ (que pode ser baixado gratuitamente em https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Clique em Linha segmentada e contorne o verme (um verme de cada vez). Clique em Analisar e selecione Medir para obter a quantificação da mancha. Os dados serão exibidos como a média na tabela. Média indica os dados calculados a partir da densidade de coloração por área de vermes.</li>
		</ol></li>
		<li>Dados qualitativos: Obtenha imagens do estereomicroscópio de cada grupo e compare visualmente a coloração dos vermes. Crie um sistema de pontuação, se necessário, para analisar a coloração: 0 incolor; 1 levemente manchado; 2 manchados e 3 muito manchados. Usando o estereomicroscópio, conte manualmente aproximadamente 10 vermes por grupo (mínimo) com um contador manual.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> Figura 1: Esquema geral do ensaio de conteúdo de glicogênio em C. elegans. Um esquema do experimental realizado aqui para realizar o ensaio de conteúdo de glicogênio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Avaliação da permeabilidade intestinal
<ol><li>Preparação de minhocas<ol><li>Cerca de 14 h após a sincronização (passo 1.2.8), transferir 500-1000 vermes (passo 1.3.1 e NOTA) no primeiro estádio larval (L1) para cada nova placa de ágar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparada e mantê-los a 20 °C até ao dia do ensaio. Este cronograma levará a dois grupos experimentais da seguinte forma (Figura 2): A- (jovem): os vermes crescerão em placas de ágar NGM semeadas com a bactéria E. coli OP50 até o estágio larval 4 (L4); B- (velho): os vermes crescerão em placas de ágar NGM semeadas com a bactéria E. coli OP50 até o7º dia da idade adulta. NOTA: Os vermes mantidos até o7º dia da idade adulta devem ser lavados com tampão M9 todos os dias e transferidos para novas placas de ágar NGM (60 mm x 15mm) com 200 μL de bactérias E. coli OP50 previamente semeadas para reposição alimentar e remoção da progênie. Os vermes mais jovens flutuam durante a decantação e podem ser separados removendo o sobrenadante. A proporção de vermes smurf aumenta com a idade. No entanto, a avaliação da permeabilidade intestinal pode ser realizada em qualquer fase e idade, dependendo do objetivo do estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Executando o ensaio<ol><li>No dia do teste, colete vermes L4 (2 dias após a etapa 2.1.1) e vermes da idade adulta no7º dia (agora no9º dia) com tampão M9 (Tabela Suplementar 1) e transfira para microtubos marcados de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugue a 1400 x g por 3 min, remova o sobrenadante, adicione 1,0 mL de M9 e misture delicadamente. Repita este processo 3x para remover as bactérias. Após a última lavagem, reduza o volume para 500 μL.</li>
		<li>Usando uma pipeta automática, adicione 10 μL do sedimento do verme a uma lâmina de microscópio e conte o número de vermes. Calcule o volume a ser pipetado para obter 100 vermes/μL.</li>
		<li>Coloração Smurf: prepare uma solução de sal dissódico de erioglaucina a 25% (Tabela Suplementar 1) usando água destilada. Se necessário, use o vórtice para melhor solubilização.</li>
		<li>Em novos microtubos previamente identificados, usando uma pipeta automática, adicione o volume contendo 100 vermes, 100 μL de solução salina dissódica de erioglaucina a 25%, 200 μL de E. coli OP50 e complete com tampão M9 para um volume final de 500 μL. NOTA: Os volumes de Erioglaucina dissódica, E. coli e número de vermes são fixos. O volume do tampão M9 é variável e pode ser usado para trazer o volume final para 500 μL.</li>
		<li>Incubar durante 3 h com agitação num misturador, protegido da luz, à temperatura ambiente. NOTA: Se um mixer não estiver disponível, agite os microtubos cuidadosamente com as mãos a cada 15 min.</li>
		<li>Após 3 h, centrifugue o microtubo de 1,5 mL a 1400 x g por 3 min. Remova 1,0 mL de sobrenadante e lave os vermes com 1,0 mL de tampão M9.</li>
		<li>Repita as lavagens até que a solução de sal dissódico de erioglaucina restante seja removida da solução. Após a última etapa de lavagem, remova o sobrenadante, exceto por um resíduo de aproximadamente 250 μL. Use-o para ressuspender cuidadosamente os vermes e processá-los para análise microscópica.</li>
		<li>Transfira aproximadamente 50 vermes de solução de verme ressuspensa para lâminas de microscopia e cubra-os com lamínulas. Incube as lâminas de microscopia na geladeira a -20 °C por 10 min para paralisar os vermes. NOTA: Outra alternativa para paralisar os vermes é adicionar 10 μL de solução de cloridrato de levamisol (10 mM; Tabela Suplementar 1) e cubra-os com lamínulas.</li>
		<li>Observe e conte o número total de vermes e os vermes totalmente tingidos usando o campo claro em um estereomicroscópio (a 1,5x). As imagens podem ser obtidas a partir de uma câmera de celular (a 3,4x) acoplada a um adaptador. Para evitar erros de luz/brilho/exposição, é crucial que todas as configurações da câmera do celular permaneçam consistentes para todas as fotos.</li>
	</ol></li>
	<li>Inspeção de dados<ol><li>Dados qualitativos: Obter imagens do estereomicroscópio de cada grupo (L4 e7º dia de idade adulta) e comparar visualmente a coloração dos vermes.</li>
		<li>Conte o número total de vermes e o número de vermes smurf (vermes azuis) usando um estereomicroscópio.</li>
		<li>Expresse os resultados como a porcentagem de vermes smurfs comparando os vermes jovens (L4, como grupo de controle) e os vermes velhos (7º dia da idade adulta): A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A Onde, A = número total de vermes B= número de vermes smurf</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> Figura 2: Esquema geral do ensaio de permeabilidade intestinal em C. elegans. (A) Preparação de C. elegans . (B) Coloração com sal dissódico de eriogalacina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação do metabolismo e do padrão de envelhecimento em Caenorhabditis elegans

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<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Fornecedores locais</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>incubadora de 37 graus</td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Fornecedores</td> <td>locais-placas</td><td></td></tr> <tr><td>de Petri de 6 cm&nbsp;</td><td>Fornecedores locais</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>Din & acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea Ltda.</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (tipo selvagem)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, EUA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea Ltda.</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose anidra&nbsp;</td><td>Neon</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>H2O Destilado</td><td>Fornecedores</td> <td>locais-Sal</td><td></td></tr> <tr><td>dissódico de erioglaucina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, EUA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Flow hood</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Empresa Panasonic Healthcare da América do Norte, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea Ltda.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloridrato de levamisol</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 Synth</td><td></td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>5425R Eppendorf SE, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea Ltda.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contemporânea&acirc; nea Ltda.</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>&ecirc; Risos ciente; Stereomicroscópio fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica S8 Apo (S&atilde; o Paulo, Brasil)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Estreptomax</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

O ensaio de conteúdo de glicogênio fornece um método robusto e rápido para rastrear várias condições de teste, como estudos comparativos de diferentes cepas que podem influenciar a síntese ou degradação de glicogênio. Neste estudo, os vermes L4 foram submetidos a três condições de teste distintas: grupos em jejum, alimentação e enriquecidos com glicose. O ensaio foi realizado três vezes, com cada condição replicada duas vezes em cada ensaio; uma imagem representativa é exibida na Figura 3. Após cada ensaio, os vermes corados com solução de iodo de Lugol foram observados usando um estereomicroscópio, e uma comparação qualitativa foi feita entre os grupos quanto à coloração dos vermes. Em termos de observação visual, os vermes do grupo em jejum (fome) apresentaram uma coloração menos intensa em comparação com os vermes alimentados com E. coli OP50 (regular), bem como aqueles alimentados com E. coli OP50 e D-glicose (glicose alta). Além disso, os vermes alimentados com E. coli OP50 e D-glicose (glicose alta) exibiram a coloração mais intensa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> Figura 3: Imagens representativas do ensaio de conteúdo de glicogênio. Os níveis de glicogênio em C. elegans foram avaliados por meio da coloração com iodo. Imagens microscópicas mostram vermes C . elegans representativos submetidos a (A) fome, (B) regular ou (C) condições de glicose alta por 48 h. Os vermes foram corados por imersão em solução de tampão iodo/M9 de Lugol (1%) por 5 min, seguindo o procedimento detalhado na etapa 1.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados da permeabilidade intestinal mostram a diferença na coloração de vermes jovens (L4) com intestino íntegro e vermes velhos (7º dia de idade adulta) com membranas intestinais danificadas devido ao envelhecimento (Figura 4). O intestino de C. elegans é um tecido de importância central para a saúde, pois desempenha papéis críticos na digestão e no metabolismo e serve como um centro de sinalização para a resposta ao estresse e regulação do envelhecimento21. Em vermes jovens, o intestino de C. elegans é constituído por uma forte barreira que impede o vazamento do conteúdo intestinal. No entanto, à medida que esses vermes envelhecem, a função de barreira intestinal diminui e se torna mais sensível à ruptura devido à degradação progressiva de células e microvilosidades e ao acúmulo de bactérias no intestino envelhecido21,22. Quando C. elegans jovens ingerem o corante sal dissódico de erioglaucina, o intestino do nematóide é corado (Figura 4A). Por outro lado, é possível observar que os vermes envelhecidos apresentaram extravasamento do corante, permeando todo o corpo do verme, o que indica lesão da membrana intestinal (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> Figura 4: Imagem representativa da coloração de C. elegans com sal dissódico de eriogalacina. A imagem microscópica mostra C. elegans com intestino íntegro (estágio L4) e vermes com intestino rompido (7º dia de idade adulta). Os vermes foram corados por imersão em solução de sal dissódico de Erioglaucina a 25% por 3 h, seguindo o passo 2.2.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Captura de tela do ImageJ para selecionar o contorno de C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: captura de tela do ImageJ para calcular a média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Receitas de mídia, tampão e cultura. Composição de diferentes meios, tampões e culturas usados no protocolo atual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: Descrição detalhada do software ImageJ para quantificar o conteúdo de glicogênio em vermes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

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Biologia

Nós apresentamos um método para visualizar cutícula ao...

Visualização de Caenorhabditis elegans Estruturas cutícula Usando o Dye lipofílicos Vital, DII

Aqui, descrevemos uma técnica usada para visualizar o DNA genômico em nematóides fixos e intactos. O vídeo inclui um exemplo de protocolo para contar a cromatina em oócitos de C. elegans não fertilizados.

Fixação de etanol e coloração DAPI: um método para visualizar o DNA em C. elegans

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Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em C. elegans

Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato...

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Aprenda a usar corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans. Este protocolo educacional permite estudar metabolismo e envelhecimento de forma acessível.

Usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans

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