Fixação de etanol e coloração DAPI: um método para visualizar o DNA em C. elegans

- Comece com uma gota de solução tampão em uma lâmina de microscópio e transfira os vermes intactos para a gota. Assim que os vermes estiverem no lugar, use um lenço de papel sem fiapos para absorver e remover o tampão. Fixe a amostra banhando os espécimes com etanol a 90% várias vezes, permitindo que evapore após cada aplicação.

Uma vez evaporado o etanol após o enxágue final, adicione uma solução contendo o corante de ácido nucleico, DAPI, à amostra. O DAPI liga-se preferencialmente às bases adenina e timina no sulco menor do DNA. Quando ligado, o complexo DAPI-DNA absorve a luz UV e emite luz azul visível.

Em seguida, adicione um conservante anti-desbotamento para prolongar a vida útil da amostra. Aplique uma lamínula e sele-a na lâmina. Em seguida, use um microscópio fluorescente com um filtro azul para visualizar os corpos DAPI, que, dependendo da célula e de seu status de ciclo, podem representar cromossomos únicos, pares de cromátides irmãs ou núcleos inteiros. Neste experimento, contaremos pares de cromátides irmãs coradas com DAPI em oócitos, para identificar cepas tetraplóides de Caenorhabditis elegans.

- As cepas tetraplóides têm 12 pares de cromossomos, que podem ser validados pela contagem dos corpos corados com DAPI em oócitos não fertilizados. Para fazer isso, solte de cinco a dez microlitros de tampão M9 em uma lâmina e transfira de seis a 10 tetraplóides putativos para a gota. Sob um microscópio de dissecação, absorva cuidadosamente a maior parte do M9 em um lenço de limpeza sem fiapos.

Em seguida, jogue 10 microlitros de etanol a 90% nas minhocas e observe o etanol evaporar completamente. Assim que a evaporação terminar, repita o processo de adição de etanol e observe-o evaporar. No total, adicione 10 microlitros em quatro aplicações. Depois que a última gota evaporar, adicione seis microlitros de DAPI a dois nanogramas por microlitro ou uma mancha semelhante.

Para armazenamento a longo prazo das lâminas, monte as minhocas em um anti-desbotamento disponível comercialmente ou caseiro. Em seguida, adicione uma lamínula e sele as bordas com esmalte. Depois que o esmalte secar, as lâminas podem ser marcadas. Use um microscópio fluorescente e ampliação de 100x.

Primeiro, encontre o oócito não fertilizado mais maduro, que está imediatamente adjacente à espermateca e ainda não entrou na espermateca ou no útero. Os corpos DAPI aqui são presumivelmente pares de cromossomos únicos. Em seguida, concentre-se no núcleo do oócito e use o foco fino do microscópio para escaneá-lo lentamente, de cima para baixo, enquanto conta os corpos DAPI. Em seguida, reconte os corpos DAPI no mesmo núcleo, movendo o foco de baixo para cima.

Os oócitos do tipo selvagem têm seis corpos DAPI em média. A presença de 12 corpos DAPI indica que os animais desta linhagem são tetraplóides parciais ou completos. Analise pelo menos 10 animais por cepa. Freqüentemente, os pares de cromossomos estarão muito próximos ou se tocando, de modo que o número de corpos DAPI geralmente é menor do que o número real de pares de cromossomos.