Name: FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a montar um sistema de microscopia FRET de baixo custo para monitorar sinais intracelulares em células vivas usando biossensores. Este método permite visualizar dinâmicas de cAMP em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

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Os autores gostariam de agradecer a Anke Rüttgeroth e Karina Zimmermann para assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (concessão NI 1301/1-1 a VON) e Universidade de Göttingen Medical Center (&quot;pro futura&quot; subvenção para VON).

<ol><li>Zaccolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chimeric+fluorescent+proteins+and+fluorescence+resonance+energy+transfer+to+monitor+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses.</a> Circ. Res. 94, 866-873 (2004).</li>
<li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+from+the+field%3A+genetically+encoded+fluorescent+reporters+uncover+signaling+dynamics+in+living+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+spatial+and+temporal+dynamics+of+intracellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling.</a> Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).</li>
<li>Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578, 55-67 (2007).</li>
<li>Willoughby, D., Cooper, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cAMP dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cAMP+synthesis+and+degradation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells.</a> Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).</li>
<li>Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer-based+Biosensors+for+the+Quantitative+Analysis+of+Inositol+1%2C4%2C5-Trisphosphate+Dynamics+in+Calcium+Oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations.</a> J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+for+real-time+monitoring+of+cGMP+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Exp.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells.</a> Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).</li>
<li>Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+patterning+of+cGMP+in+vascular+smooth+muscle+cells+revealed+by+single+GFP-linked+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).</li>
<li>Borner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+measurements+of+intracellular+cAMP+concentrations+and+cAMP+analog+permeability+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells.</a> Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).</li>
<li>Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+molecular+toolkit+for+cAMP+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells.</a> BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).</li>
<li>Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+live+cell+imaging+using+dual+FRET+sensors+with+a+single+excitation+light%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light.</a> PLoS One. 4, e6036(2009).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+dual-parameter+FRET+kinase+probes+based+on+pleckstrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin.</a> Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).</li>
<li>Aoki, K., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+small+GTPase+activity+with+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.</a> Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

neste protocolo, que demonstram como criar um sistema de imagens simples, de baixo custo, mas poderosa FRET para aplicações de rotina com uma variedade de biossensores disponíveis. O sistema aqui apresentado é projetado para PCP e YFP, ou tipos similares de proteínas fluorescentes, como o par dador-aceitador. Ao mesmo tempo, outros biossensores individuais tornam-se disponíveis que utilizam, por exemplo, de verde e vermelho proteínas fluorescentes 14. Para adaptar o sistema descrito para outras cores, fontes ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> BES Tampão Grau </td><td> APPLICHEM </td><td> A1062 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 dihidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5010 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslides vidro </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004710781 </td><td> 24 mm de diâmetro </td></tr><tr><td> Com fundo de vidro de cultura celular pratos </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> FD3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Biochrom AG </td><td> F0445 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo (FCS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30073.02 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0283 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 hexahidrato </td><td> APPLICHEM </td><td> A4425 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> APPLICHEM </td><td> A1149 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9707 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2213 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência invertido </td><td> por exemplo, Nikon </td><td> Pedido da Nikon </td><td></td></tr><tr><td> CoolLED </td><td> CoolLED </td><td> p E-100 </td><td> 440 nm </td></tr><tr><td> DualView </td><td> Fotometria </td&gt; <td> DV2-SYS </td><td></td></tr><tr><td> DualView deslizante filtro </td><td> Fotometria </td><td> 05-EM </td><td></td></tr><tr><td> PCP / YFP conjunto de filtros </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49052 </td><td> sem o filtro de emissão </td></tr><tr><td> ORCA-03G câmera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> C8484-03G02 </td><td></td></tr><tr><td> Arduino placa I / O </td><td> Sparkfun Eletrônica </td><td> DEV-00666 </td><td></td></tr><tr><td> Attofluor câmara de celular </td><td> Invitrogen </td><td> A-7816 </td><td></td></tr><tr><td> Computador pessoal com sistema Windows XP ou Windows7 </td><td> Qualquer fornecedor </td><td></td><td> Incluem disco rígido de alta capacidade </td></tr></tbody></table>

fret microscopia para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia continua a ganhar cada vez mais interesse como uma técnica de monitoramento em tempo real de eventos bioquímicos e sinalização em células vivas e tecidos. Comparado com métodos bioquímicos clássicos, esta nova tecnologia é caracterizada por resolução temporal e espacial. FRET usar vários experimentos geneticamente codificados biossensores que podem ser expressas e representado ao longo do tempo in situ ou in vivo 1-2. Biossensores típicos pode relatar interacções proteína-proteína, medindo FRET entre um par fluoróforo etiquetado de proteínas ou mudanças conformacionais em uma única proteína que abrigam dador e aceitador fluoróforos interligados com uma porção de ligação para uma molécula de interesse 3-4. Biossensores bimoleculares para interacções proteína-proteína incluem, por exemplo, constrói concebido para monitorizar a activação da proteína G em células de 5, enquanto que os sensores unimoleculares meaSuring alterações conformacionais são amplamente utilizados para mensageiros segunda imagem, tais como o cálcio 6, cAMP 7-8, 9 e fosfatos de inositol cGMP 10-11. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagem de simples componentes disponíveis comercialmente e como controlar toda a configuração utilizando o freeware Manager-Micro. Este instrumento simples, mas poderosa é projetado para medições de rotina ou mais sofisticados FRET em células vivas. Imagens obtidas são processadas utilizando auto-escrito plug-ins para visualizar mudanças em relação FRET em tempo real durante todas as experiências antes de ser armazenado em um formato de vídeo compatível com o build-in ImageJ de freeware utilizado para posterior análise de dados. Este sistema de baixo custo, é caracterizada por uma elevada flexibilidade e pode ser utilizado com sucesso para monitorar diversos eventos bioquímicos e moléculas de sinalização por uma pletora de biossensores FRET disponível em células vivas e tecidos. Como um exemplo, demonstramos how para usar este sistema de imagem para realizar monitorização em tempo real de cAMP em células 293-vivo por estimulação com um agonista do receptor β-adrenérgico e bloqueador.

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

A microscopia de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) continua a despertar um interesse crescente como técnica para o monitoramento em tempo real de processos bioquímicos...

Este artigo em vídeo descreve como montar um sistema personalizado de imagemamento por fluorescência epidual FRET a partir de componentes comercialmente disponíveis e mostra como utilizá-lo para o monitoramento em tempo real do AMP cíclico intracelular em células intactas. Primeiro, é detalhado um procedimento passo a passo para montagem do sistema de imagemamento FRET. Em seguida, é apresentado o processo de instalação e configuração do software após a montagem completa do sistema.Seu uso na medição de níveis intracelulares de AMP cíclico. Dados obtidos usando este sistema demonstram sua utilidade no monitoramento da dinâmica intracelular de AMP cíclico mediante a medição de razões FRET. A principal vantagem desta técnica é que permite visualizar mensageiros SEC, eventos bioquímicos ou interações entre proteínas com alta resolução espacial e temporal em células e tecidos intactos.E isso não é possível com métodos bioquímicos existentes, como ELISA ou radioimunoensaios. Utilizamos este método para obter informações sobre a dinâmica dos nucleotídeos cíclicos, mas ele pode ser facilmente aplicado a outros sistemas usando biossensores FRET. Esses biossensores podem ser expressos em li

fret-microscopy-for-real-time-monitoring-signaling-events-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

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Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.

A ativação do Ser/Thr kinase multifuncional AURKA é marcada por sua autofosforilação em Thr288. Sondas fluorescentes que dependem de FRET podem discriminar entre seus estados inativos e ativados. Aqui, ilustramos algumas estratégias para a engenharia de sondas, juntamente com um protocolo RÁPIDO DE FRET para acompanhar a ativação da quinase ao longo da mitose.

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Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a dinâmica espaço-temporal da ativação e fosforilação de Akt em células HepG2 vivas. A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa que fornece informações valiosas sobre as vias de sinalização da insulina e a regulação metabólica em células cancerígenas.

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Nós apresentamos uma integração inovadora e poderosa de nanofotônica (QD-FRET) e microfluídica para investigar a formação de polyplexes polieletrólito, que é esperado para prestar um melhor controle e síntese de polyplexes uniforme e personalizável para à base de ácido nucléico futuro terapêutica.

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