Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Neste vídeo, duas técnicas relacionadas são demonstradas. O primeiro é o transplante de células-tronco de espermatogônia ou transplante SSC, e o segundo é testar esses tecidos. Xenoenxerto. O transplante de SSC é usado para gerar espermatogênese a partir das SSCs de um doador nos testículos de um receptor.

Isso é feito preparando uma suspensão celular de testículos de doadores ou células cultivadas contendo SSCs de um doador com um marcador transgênico identificável, como GFP ou LAC Z. Em seguida, os testículos do receptor masculino são exteriorizados. O receptor foi tratado para que seus testículos estejam esgotados de células germinativas. Os patos EENT do macho receptor são então isolados e injetados com células doadoras que foram misturadas com taan.

Corante azul. Em última análise, colonização do epitélio seminífero do receptor. Os túbulos seminíferos por células germinativas derivadas do doador são evidentes dois a três meses após o transplante, observados neste exemplo pela coloração xal dos testículos receptores, demonstrando a colonização da falta de células doadoras que expressam Z.

A segunda técnica a ser demonstrada neste vídeo envolve xenoenxerto de tecido testicular. O rafting de tecido testicular é usado para introduzir o desenvolvimento testicular e a espermatogênese de uma espécie doadora, transplantando fragmentos testiculares de doadores imaturos em hospedeiros de camundongos deficientes. Isso é feito primeiro preparando fragmentos de tecido adequados para transplante dos testículos de uma grande espécie de doador, como um porco, como no exemplo mostrado aqui.

O próximo passo é castrar um camundongo receptor adulto imunodeficiente e, em seguida, transplantar os fragmentos de testículos do doador sob a pele dorsal do camundongo receptor. Os camundongos receptores funcionam como incubadoras in vivo, permitindo o desenvolvimento completo dos xenoenxertos testiculares dentro de seis a sete meses, dependendo da espécie doadora. O transplante de células-tronco Speral foi desenvolvido pela primeira vez por Ralph Brister e seus colegas da Universidade da Pensilvânia e relatado pela primeira vez em 1994.

Desde então, encontrou ampla aplicação e atualmente representa o bioensaio padrão-ouro no campo da biologia de células-tronco germinativas para ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de células-tronco germinativas, como elucidar as vias de sinalização que governam a auto-renovação das células-tronco. Tivemos a ideia do xenotransplante pela primeira vez quando reconhecemos que o transplante de células-tronco de espermatogônias isoladas de doadores não roedores, por exemplo, porcos, primatas ou humanos para um testículo de camundongo, não resultou em espermatogênese completa derivada de doador. Estabelecemos que preservar o microambiente do testículo transplantando pequenos fragmentos de tecido testicular em vez de células germinativas isoladas pode superar essa limitação e levar à espermatogênese derivada de doador completo de uma espécie filogeneticamente distanciada em um hospedeiro de camundongo.

Isso foi relatado pela primeira vez por nós em 2002. O protocolo de transplante de células germinativas requer a preparação da suspensão celular a ser injetada. Consulte o manuscrito escrito para detalhes de preparação.

Comece o procedimento de transplante anestesiando o camundongo receptor e garantindo profundidade anestésica suficiente, certificando-se de que ele não exiba um reflexo de dor. Em seguida, posicione o animal dorsal reclinado e prepare cirurgicamente a área abdominal. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente um centímetro de comprimento para expor a parede abdominal.

Levante a parede usando uma pinça na ponta da linha branca para evitar ferir acidentalmente os órgãos abdominais. Em seguida, faça uma incisão de meio centímetro para expor a cavidade peritoneal com a ajuda de uma pinça fina. Exteriorize o testículo puxando a almofada de gordura presa ao testículo e ao epidídimo e coloque essas estruturas em um cartão de índice estéril.

Agora adicione corante azul trian à suspensão celular. Em seguida, carregue a suspensão celular em um tubo de polietileno conectado a uma seringa de um mililitro e conecte a pipeta puxada no tubo. Forçar suavemente a suspensão celular na pipeta aplicando pressão na seringa.

Agora vamos preferir a etapa mais crítica para o transplante de CEC, que é a identificação e canulação dos ductos otorrinolaringológicos. Usando um microscópio de dissecação, identifique os ductos eferentes entre os testículos e os EPIs e remova suavemente o tecido adiposo ao redor dos ductos. Trabalhe com cuidado, pois os patos e a membrana ao redor deles são translúcidos.

Estabilize os dutos cobrindo-os com um pedaço de plástico triangular estéril. Em seguida, insira cuidadosamente a pipeta de injeção em um duto no feixe de dutos de ferrina. Passe suavemente a pipeta alguns milímetros em direção ao testículo.

Mantendo a pipeta de injeção parada, injete lentamente as células à medida que o testículo e os túbulos ferosos começam a se encher, mantenha um fluxo constante até que quase todos os túbulos visíveis nos túbulos superficiais tenham sido preenchidos. Não encha demais ou o testículo ficará isquêmico. Agora retorne o testículo para a cavidade abdominal e repita o procedimento no testículo contralateral.

Quando concluído, feche a parede abdominal com seis pontos de seda e feche a pele com clipes de metal. Após a cirurgia, monitore o camundongo em uma almofada de aquecimento até que ele esteja recuperado o suficiente da anestesia para retornar à sua idade de gaiola de origem. O segundo procedimento a ser demonstrado, o xenotransplante de tecido testicular, envolve o uso de biópsias testiculares ou testículos intactos de doadores.

No caso de biópsias, lave os fragmentos testiculares duas ou três vezes em meio de cultura gelado contendo antibióticos. Após cada lavagem, gire a suspensão e levante o pellet. Em solução fresca, transfira o tecido lavado para um prato limpo e corte as biópsias em fragmentos menores para transplante.

Usando pinças curvas e uma lâmina de bisturi, os testículos intactos requerem mais preparação. Comece lavando cada testículo e PBS gelado contendo antibióticos duas ou três vezes. Em seguida, transfira os testículos limpos para um prato limpo com PBS.

Em seguida, remova a túnica de vaginalis fazendo uma incisão ao longo da superfície e extrude os testículos. Remova todas as estruturas anexas, como mática, epidídimo do cordão e tecido conjuntivo. Lave os testículos extraídos uma vez em PBS frio e transfira-os para uma placa de cultura com PBS.

Em seguida, remova cuidadosamente a túnica albugínea usando uma lâmina de bisturi em uma tesoura. Se os testículos forem muito pequenos, a túnica pode ser removida espremendo o tecido testicular para fora da túnica através de uma pequena incisão em uma pequena placa de cultura cheia de gelo. Meio frio, corte gradualmente os testículos em pequenos pedaços, conforme descrito anteriormente.

Finalmente, selecione os fragmentos de tecido a serem xenoenxertos e isole-os em placas de cultura com meio de cultura gelado até que sejam necessários. Anestesie um rato conforme descrito anteriormente. Em seguida, com o mouse em uma almofada de aquecimento.

Prepare o campo cirúrgico estéril cortando o cabelo no abdômen e nas costas. Limpe o abdômen com 70% de etanol e solução de Betadine. Para realizar a castração, faça uma incisão na linha média ventral de meio a um centímetro para expor a parede abdominal.

Em seguida, corte a parede abdominal para expor a cavidade abdominal. Exponha cuidadosamente o testículo, a artéria testicular e o epidídimo conforme descrito anteriormente. Em seguida, separe a cauda dos EPIs do gubernáculo por dissecção romba.

Em seguida, ligue a artéria testicular na deferência VA junto com o vaso sanguíneo usando suturas de seda. Em seguida, divida as estruturas ligadas cortando entre os testículos e a ligadura. Após repetir o procedimento para o segundo testículo, suturar a parede abdominal com um ou dois pontos cirúrgicos e fechar a incisão na pele com um ou dois clipes micc para implantar os xenoenxertos ectópicos.

Posicione um camundongo anestesiado castrado em decúbito ventral e prepare um campo cirúrgico estéril em suas costas. Para cada enxerto a ser inserido, faça uma incisão na pele de meio centímetro de comprimento em cada lado da linha média usando uma pinça para segurar uma borda da incisão na pele. Use uma tesoura para fazer uma cavidade subcutânea de cinco a 10 milímetros de profundidade.

Separe o tecido conjuntivo para criar um espaço profundo o suficiente para o enxerto, de modo que ele não seja pego pelo clipe de fechamento. Usando pinças finas. Coloque um pedaço do tecido testicular profundamente na cavidade subcutânea segurando a borda da incisão na pele com uma pinça de íris.

Feche cada incisão na pele com um clipe de microfone. Em seguida, permita que o mouse se recupere da anestesia em uma almofada de aquecimento. Uma vez recuperado, transfira o mouse para sua gaiola inicial e continue monitorando-o até que esteja totalmente recuperado.

Descobriu-se que as células-tronco da espermatogônia do doador transplantado expressando um transgene lae colonizam o testículo do receptor dois a três meses após o transplante iCal. A coloração revelou segmentos azuis distintos dos túbulos seminíferos do receptor. Uma colônia bem estabelecida tem um longo trecho azul escuro de segmentos completamente preenchidos com duas ou mais camadas de células azuis mais próximas do centro em cada extremidade da colônia.

Uma rede de pares únicos ou pequenos grupos de células também é aparente. Uma seção transversal da região do túbulo seminífero azul escuro revelou agenesia de Perato bem estabelecida e bem organizada com células germinativas azuis em vários estágios de diferenciação. No caso dos tecidos testiculares, fragmentos de xenoenxerto de testículos de doadores imaturos foram transplantados sob a pele dorsal de camundongos imunodeficientes e foram capazes de sobreviver e responder às gonadotrofinas de camundongos.

E, como resultado, o tecido testicular passou por um desenvolvimento completo, incluindo a formação de espermatozóides competentes para fertilização. Uma vez que os xenoenxertos testiculares foram coletados, eles foram usados para obter espermatozoides para exy e produção de embriões. O transplante de células-tronco de espermatozóides avança no campo da biologia de células-tronco por meio do estudo das interações de nicho de células-tronco nos testículos e do desenvolvimento de condições de cultura para expandir as células-tronco de espermatozóides in vitro após o desenvolvimento do xenoenxerto de tecido testicular.

A técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia reprodutiva masculina estudarem aspectos da espermatogênese, toxicologia reprodutiva e preservação de material genético de machos imaturos em uma variedade de espécies de doadores, desde camundongos a homens.