Name: Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a extrair DNA de Mycobacterium tuberculosis usando batimento de grânulos e purificação com esferas magnéticas. Este método rápido e padronizado é ideal para sequenciamento de nova geração em diagnóstico de tuberculose.

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Este estudo foi conduzido na Universidade da Califórnia em São Francisco (UCSF) sob a aprovação do Comitê Institucional de Biossegurança (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) e segue as diretrizes de ética em pesquisa da UCSF. Obtivemos amostras de escarro remanescente coletadas pela Discovery Life Sciences sob um protocolo de Isenção de Consentimento aprovado pelo IRB de indivíduos com condições respiratórias não TB.
1. Preparação de tampões
<ol>
	<li>Tampão Triton personalizado (Tabela 1): Para preparar 100 mL de tampão Triton personalizado, comece combinando 2 mL de NaCl 5 M, 1 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8), 1 mL de Triton X-100 e 0,2 mL de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M (EDTA). Adicione água ultrapura para elevar o volume total para 100 mL. Filtre e esterilize antes de usar. O tampão final contém 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 1% de Triton X-100.</li>
	<li>Baixo EDTA TE (Tabela 2): Para preparar 100 mL de tampão de baixo EDTA TE, combine 1 mL de 1M Tris-HCl (pH 8) e 0,02 mL de 0,5 M EDTA. Adicione água ultrapura para elevar o volume total para 100 mL. O tampão final contém 10 mM de Tris-HCl e 0,1 mM de EDTA.</li>
</ol>
2. Preparação de tubos de lise
<ol>
	<li>Usando uma lâmina de bisturi, corte cuidadosamente o fundo de um tubo de tampa de rosca de 1,5 mL logo abaixo do ponto de inflexão.</li>
	<li>Corte a ponta de uma ponta P1000, corte uma cunha em forma de V perto da extremidade e encaixe o fundo preparado do tubo da tampa de rosca nela. Consulte a Figura 1 para obter um diagrama da colher.</li>
	<li>Encha um recipiente estéril (por exemplo, um reservatório ou placa de Petri) com grânulos de zircônia-silicato de 0.1 mm e use a colher preparada para distribuir uma colher cheia de grânulos (~ 200 mg) em tubos com tampa de rosca de 1.5 mL.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Figura 1: Colher de distribuição interna de contas. A colher foi projetada para a fácil transferência de ~ 200 mg de grânulos de zircônio de 0,1 mm para tubos de processamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Preparação de entrada
NOTA: Toda a preparação de amostras deve ser conduzida de acordo com os protocolos de biossegurança de suas instalações. Recomendamos fortemente o manuseio de materiais infecciosos dentro de um Gabinete de Biossegurança Classe II (BSC) para minimizar o risco de exposição a aerossóis.
<ol>
	<li>Cultura de células bacterianas<ol>
		<li>Centrifugue ~ 5 mL de cultura de M. tuberculosis (MGIT ou cultura líquida turva) em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min.</li>
		<li>Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, remova cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante sem perturbar o pellet. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado pipetando para cima e para baixo. Se necessário (ou seja, para remover amostras para processamento fora de um BSL-3), desative a amostra de acordo com os procedimentos operacionais padrão.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de escarro<ol>
		<li>Transfira 1-5 mL de amostra de escarro (espontânea ou induzida) para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquefação de TDT<ol>
		<li>Adicione quatro volumes de ditiotreitol 100 mM à amostra de escarro (o volume pode variar). Se estiver usando um reagente comercial, siga as instruções de diluição do fabricante.</li>
		<li>Vórtice completamente por 30 s. Incubar à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Vórtice novamente por 30 s.</li>
		<li>Repita as etapas 3.3.1. e 3.3.2. 1x, para amostras muito viscosas, execute até 5 ciclos de incubação-vórtice.</li>
		<li>Centrifugue na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, descarte cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquefação NALC-NaOH<ol>
		<li>Para preparar a solução de NALC-NaOH, siga as instruções do fabricante para preparação e diluição.</li>
		<li>Adicione quatro volumes de solução de NALC-NaOH à amostra de escarro (espontânea ou induzida, o volume pode variar).</li>
		<li>Vórtice por 30 s. Incubar à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Repita as etapas 3.4.1 e 3.4.2. 1x. Para amostras muito viscosas, execute até 5 ciclos de incubação-vórtice.</li>
		<li>Adicione PBS à marca de 50 mL. Vórtice brevemente para misturar. Centrifugue na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min.</li>
		<li>Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, descarte cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.</li>
		<li>Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado. Se necessário (ou seja, para remover amostras para processamento fora de um BSL-3), desative a amostra de acordo com os procedimentos operacionais padrão.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Extração de DNA
<ol>
	<li>Transfira a suspensão bacteriana inativada (350 μL da etapa 3) para um novo tubo de tampa de rosca de 1,5 mL bem rotulado contendo ~ 250 μL de esferas de silicato de zircônia de 0,1 mm.</li>
	<li>O talão bateu o lisado a 6,5 m/s por 45 s com 2 min de descanso entre as corridas. Repita para um total de três ciclos de batimento de contas.</li>
	<li>Centrifugue na velocidade máxima (≥ 12.000 x g) por 2 min e transfira 150 μL do sobrenadante para um novo tubo bem rotulado. Tome cuidado para não transferir grânulos ou detritos celulares.</li>
	<li>Deixe os grânulos magnéticos de limpeza se equilibrarem à temperatura ambiente por 30 min e vórtice completamente para garantir a ressuspensão completa antes do uso.</li>
	<li>Adicione 180 μL (volume de 1,2x) de esferas magnéticas de limpeza e misture pipetando para cima e para baixo 10x. Incube em temperatura ambiente por 2 min.</li>
	<li>Coloque em um rack magnético e espere que a solução desapareça por ~ 2 min. Usando uma pipeta P200, descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas.</li>
	<li>Com o tubo ainda no suporte magnético, adicionar 500 μL de etanol a 70 % (v/v) recém-preparado, distribuindo ao longo da parede oposta do tubo às esferas magnéticas. Aguarde 30 s.</li>
	<li>Repita as etapas 4.5. - 4.7. para um total de duas lavagens. No final da última lavagem, remover o etanol residual com uma pipeta P10. Seque as contas brevemente por ~ 2 min.</li>
	<li>Imediatamente após o pellet de esferas ficar opaco, remova o tubo do rack magnético e ressuspenda em 20 μL de tampão Tris de baixo EDTA. Não permita que as contas fiquem secas e rachadas.</li>
	<li>Misture pipetando ou vórtice para garantir que todas as esferas estejam em solução. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Coloque em um rack magnético e espere que a solução fique clara por ~ 2 min. Transfira o DNA eluído para um novo tubo bem marcado para análise a jusante. Aspire &lt;20 μL de DNA extraído para evitar o transporte de esferas magnéticas.</li>
</ol>
5. Enumeração qPCR do DNA micobacteriano
<ol>
	<li>Para quantificar o DNA micobacteriano usando uma PCR quantitativa direcionada a 99 nucleotídeos do atpE micobacteriano (Rv1305), monte uma mistura de reação de 10 μL por amostra em gelo contendo 5 μL de mistura mestre de sonda universal (2x), 0,4 μL de primer direto (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) e primer reverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL de sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL de molde de DNA e 2 μL de água livre de nuclease (Tabela 3).</li>
	<li>Execute a reação usando as seguintes condições de ciclo térmico: desnaturação inicial a 95 °C por 60 s, seguida por 35 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s (com uma captura aqui, usando uma taxa de rampa de 2,11 °C/s; Tabela 4). NOTA: Neste caso, o qPCR foi realizado usando um ensaio TaqMan com sonda marcada com VIC em um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3,</li>
	<li>Execute todas as amostras, padrões e controles em triplicados técnicos. Gere curvas padrão usando diluições seriais de DNA purificado de M. tuberculosis . Realize análises de quantificação relativa usando software de análise.</li>
	<li>Exporte os valores de quantificação relativos resultantes para o formato CSV e visualize usando o R Studio (versão 2024.09.1+394) para gerar gráficos de caixa comparando os rendimentos de DNA entre os métodos de extração.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
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<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,1 mm de grânulos de zircônia-silicato</td><td>Produtos Biospec</td><td>11079101Z</td><td>Grânulos usados para bater o grânulo para lisar células micobacterianas</td></tr><tr><td>Contas AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>Rolamento A63880</td><td>Grânulos magnéticos para limpeza de DNA pós-lise</td></tr><tr><td>EDTA (0,5M, pH 8,0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>AM9260G</td><td>Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA</td></tr><tr><td>Preparação rápida 24</td><td>MPbio, EUA</td><td>116004500</td><td>Equipamento para batimento de contas a 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Primer Direto</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Síntese personalizada</td><td>Sequência de primers: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (Água, grau de biologia molecular)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP2819-1</td><td>Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA</td></tr><tr><td>Sonda Universal Luna</td><td>Biolabs da Nova Inglaterra</td><td>M3004</td><td>Reagente de qPCR para enumeração de DNA micobacteriano</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>REF 240863</td><td>Digestão de amostras BD MycoPrep para processamento de escarro NALC-NaOH</td></tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio, solução 5M)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>AM9759</td><td>Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>Pág. 2272</td><td>Processamento de Escarro</td></tr><tr><td>Primer reverso</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Síntese personalizada</td><td>Sequência de primer: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Síntese personalizada</td><td>Sequência de sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>AM9855G</td><td>Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA</td></tr><tr><td>Tritão X-100</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>28314</td><td>Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA</td></tr></tbody></table>

extração de dna micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho ngs

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Testamos o protocolo de extração de DNA em amostras de escarro enriquecidas com M. tuberculosis e M. tuberculosis cultivadas (n = 3 para cada condição). Usando M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 cultivado, padronizamos a entrada para 8,4 x 106 células por 50 μL, equivalente a 1 mL de uma cultura de MGIT a 200 GU. Para experimentos de escarro, aumentamos 1 mL de escarro agrupado de indivíduos com condições respiratórias não TB (obtidas comercialmente) com duas concentrações bacterianas di...

Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A comparação e otimização de dois métodos de enriquecimento de DNA orgânico de plantas são apresentadas: centrifugação diferencial tradicional e fracionamento do gDNA total com base no estado de metilação. Nós avaliamos a quantidade e a qualidade de DNA resultantes, demonstram desempenho em seqüenciamento de próxima geração de leitura curta e discutimos o potencial para uso em sequenciação de moléculas únicas de leitura longa.

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrado.

Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Long-leitura sequências facilitam grandemente a montagem de genomas complexas e caracterização da variação estrutural. Nós descrevemos um método para gerar as sequências ultra-longa pelas plataformas de sequenciamento baseado em nanopore. A abordagem adota uma extração de DNA otimizada seguida de preparações de biblioteca modificada para gerar centenas de mil leituras com cobertura moderada de células humanas.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

É descrito aqui um procedimento de funcionamento padrão simplificado para o perfilamento do microbioma usando o sequenciação metagenômica 16s rRNA e a análise usando ferramentas livremente disponíveis. Este protocolo ajudará os investigadores que são novos ao campo do microbioma assim como aqueles que exigem actualizações em métodos para conseguir o perfilamento bacteriano em uma definição mais elevada.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.

Um protocolo de extração de DNA de mosquito baseado em contas magnéticas para sequenciamento de próxima geração

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Apresentamos um método otimizado para extração de DNA de escarro descontaminado usando um método de extração baseado em matriz combinado com uma purificação de esferas magnéticas para sequenciamento de próxima geração direcionado a jusante de Mycobacterium tuberculosis.

Extração de DNA baseada em matriz para sequenciamento de próxima geração direcionado em amostras de escarro descontaminadas

Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.

Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir o sequenciamento do genoma completo de infecções bacterianas sexualmente transmissíveis a partir de amostras clínicas usando enriquecimento alvo. Este novo método baseado em painel sindrômico supera os desafios de DNA humano abundante e baixas cargas bacterianas, facilitando a vigilância genômica para Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium.

Geração de genomas bacterianos inteiros a partir de amostras clínicas usando um fluxo de trabalho de enriquecimento alvo

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Aprenda a extrair DNA de Mycobacterium tuberculosis usando batimento de grânulos e purificação com esferas magnéticas. Este método rápido e padronizado é ideal para sequenciamento de nova geração em diagnóstico de tuberculose.

Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS

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