Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS

Nossa pesquisa de diagnóstico se concentra em melhorar a detecção de resistência a medicamentos na tuberculose em ambientes de recursos limitados, com foco na velocidade e no pragmatismo. No diagnóstico de TB, existem ensaios genotípicos mais abrangentes e até mesmo uma série de novos ensaios fenotípicos rápidos, e há esforços consistentes para aproximar esses testes do ponto de atendimento. Mas ainda existem várias barreiras pragmáticas.

Os desafios de recursos, de reagentes a infraestrutura e logística, continuam a ser barreiras significativas. Com qualquer coisa além da sofisticação técnica de um ensaio Cepheid Xpert, a padronização do protocolo é difícil em diferentes ambientes. Portanto, a extração de DNA MTB, conforme detalhado neste trabalho aqui, é um excelente exemplo disso.

Há uma necessidade crítica de expandir o diagnóstico de TB baseado em sequenciamento, mas muitos laboratórios ainda não têm uma maneira confiável de extrair DNA de alta qualidade. Nosso objetivo é compartilhar um método simples, prático e adequado para ambientes de ponto de atendimento com poucos recursos. Aqui apresentamos um protocolo simples de baixo custo projetado para uso em ambientes com recursos limitados.

Foi validado para aplicações NGS e é compatível com sistemas automatizados de manuseio de líquidos. Para começar, combine a solução de cloreto de sódio Tampão cloridrato de Tris, Triton X 100 e EDTA para fazer o tampão Triton. Misture mexendo e adicione água ultrapura até atingir um volume final de 100 mililitros.

Esterilize o tampão com filtro antes de usar. Em seguida, prepare 100 mililitros de tampão Tris-EDTA com baixo teor de EDTA combinando um mililitro de Tris-HCl de um molar e 20 microlitros de EDTA de 0,5 molar. Misture e encha com água ultrapura até atingir um volume final de 100 mililitros.

Em seguida, filtre e esterilize o tampão. Para preparar os tubos de lise, use uma lâmina de bisturi para cortar cuidadosamente o fundo de um tubo com tampa de rosca de 1,5 mililitro logo abaixo do ponto de inflexão. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 e faça uma cunha em forma de V perto da extremidade.

Coloque o fundo cortado do tubo com tampa de rosca na ponta da pipeta em forma de V para formar uma colher. Encha um recipiente estéril com esferas de silicato de zircônia de 0,1 milímetro. Usando a colher preparada, transfira aproximadamente 200 miligramas de contas para tubos com tampa de rosca de 1,5 mililitro.

Para a preparação da cultura de células bacterianas, transfira cinco mililitros de cultura de Mycobacterium tuberculosis para um tubo centrífugo cônico de 15 mililitros. Centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos. Agora use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover cuidadosamente tudo, exceto aproximadamente 500 microlitros do sobrenadante, sem perturbar o pellet.

Use uma pipeta P1000 para remover o sobrenadante restante. Ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão triton personalizado e, em seguida, misture bem pipetando para cima e para baixo. Aqueça a amostra em um banho de calor seco por 30 minutos a 95 graus Celsius.

Para preparar o escarro, transfira de um a cinco mililitros de amostra de escarro para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros. Para realizar a liquefação do ditiotreitol, adicione quatro volumes de ditiotreitol 10 milimolares à amostra de escarro e, em seguida, vortex completamente por 30 segundos. Centrifugue a amostra na velocidade máxima por 10 minutos.

Em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para descartar todos, exceto 500 microlitros do sobrenadante. Remova o resto do sobrenadante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet. Ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão triton personalizado.

Para realizar a liquefação de hidróxido de sódio NALC, adicione quatro volumes da solução de hidróxido de sódio NALC à amostra de escarro. Vortex a mistura por 30 segundos. Em seguida, incube o tubo por sete minutos em temperatura ambiente.

Agora adicione PBS até a marca de 50 mililitros. Vortex o conteúdo do tubo para misturar bem e, em seguida, centrifugue o tubo na velocidade máxima por 10 minutos. Após centrifugação, com uma pipeta serológica de 50 mililitros, rejeitar o sobrenadante como demonstrado anteriormente.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão triton personalizado. Primeiro, transfira 350 microlitros de amostra inativada para um tubo rotulado de 1,5 mililitro contendo 250 microlitros de esferas de silicato de zircônia de 0,1 milímetro. Bead venceu o lisado a 6,5 metros por segundo por 45 segundos com dois minutos de descanso entre os ciclos.

Centrifugue a amostra na velocidade máxima por dois minutos e, em seguida, transfira 150 microlitros do sobrenadante para um novo tubo rotulado. Em seguida, limpeza de vórtice contas magnéticas que foram equiparadas à temperatura ambiente por 30 minutos, para ressuspendê-las. Transfira 180 microlitros de esferas magnéticas para a amostra de DNA.

Pipet para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, coloque o tubo em um rack magnético e aguarde dois minutos para que a solução desapareça. Em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros para descartar o sobrenadante.

Com o tubo ainda no rack magnético, adicione 500 microlitros de etanol a 70% recém-preparado ao longo da parede oposta e aguarde 30 segundos. No final da última lavagem, remova o etanol residual com uma pipeta de 10 microlitros e seque ao ar por dois minutos. Assim que as contas ficarem opacas, remova o tubo do suporte magnético.

Ressuspender em 20 microlitros de tampão Tris de baixo EDTA. Misture por pipetagem ou vórtice para garantir que todas as esferas estejam em solução antes de uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos até ficar claro.

Em seguida, transfira menos de 20 microlitros do DNA eluído para um novo tubo marcado para evitar o transporte de contas. Para quantificar o DNA micobacteriano usando uma PCR quantitativa direcionada a 99 nucleotídeos do atpE micobacteriano, monte uma mistura mestre de QPCR no gelo. Ajuste a mistura principal com base na quantidade de amostras e padrões, incluindo um excedente de 10% para contabilizar a perda de pipetagem.

Execute o termociclador a 95 graus Celsius por 60 segundos, seguido por 35 ciclos de 95 graus Celsius por 10 segundos e 60 graus Celsius por 30 segundos com taxa de rampa de 2,11 graus Celsius por segundo. Execute todas as amostras, padrões e controles em triplicado. Aqui, as culturas de Mycobacterium tuberculosis produziram as maiores concentrações de DNA entre todas as condições testadas.

As amostras de escarro enriquecidas mostraram rendimentos de DNA progressivamente mais baixos e maior variação com a diminuição da entrada bacteriana, especialmente no grupo de 10.000 bactérias.