High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

O objetivo geral deste procedimento é expressar glicoproteínas de mamíferos com glicosilação de mamíferos apropriada, direcionando proteínas recombinantes para a via secretora mediada por ER e GOGI. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em imunologia, como qual é o papel de uma especificação, padrões na estrutura e potencial de ativação imunológica de anticorpos e fragmentos de anticorpos. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa células humanas para expressar proteínas humanas, o que fornece o missionário celular apropriado para dobrar e modificar adequadamente as proteínas-alvo.

O agitador da incubadora para estabelecimento celular deve ser operado a 135 RPM, 80% de umidade, 8% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius pelo menos uma hora antes da inoculação da cultura. Ligue a lâmpada UV do gabinete de biossegurança, pré-aqueça as garrafas seladas de meio A e meio B em banho-maria a 37 graus Celsius. Desligue as luzes UV e esterilize o gabinete de biossegurança com uma solução de etanol e água a 70%.

Esterilize um frasco de crescimento erlenmeyer de 125 mililitros com pipetas de tampa ventilada, pipetas e frascos de mídia pré-aquecidos pulverizando com uma solução de etanol a 70% em água. Coloque esses itens no gabinete de biossegurança durante todo este procedimento. Todos os itens devem ser esterilizados dessa maneira antes de serem levados para o gabinete de biossegurança.

Preparar o meio de cultura fresco para uma cultura de 30 mililitros, retirando 26 ml do meio A e três mililitros do meio B e transferindo para o erlenmeyer de 125 ml. Misture por agitação suave, morno, um frasco de células HEK 2 93 F previamente congeladas a 80 graus Celsius negativos em banho-maria a 37 graus Celsius para descongelar parcialmente as células. Isso leva cerca de um minuto e as células não devem ser completamente descongeladas.

Em seguida, esterilize a parte externa do frasco com a solução de etanol a 70% em água e mova-a para o gabinete de biossegurança. Com uma pipeta de um mililitro, retirar a suspensão celular e transferi-la para o erlenmeyer de 125 ml contendo 29 mililitros de meio de cultura fresco. Feche a tampa do balão de cultura e coloque-o no agitador da incubadora durante 24 horas.

24 horas após a inoculação da cultura. Verifique a densidade celular, esterilize o frasco de cultura com a solução de etanol a 70% e água e mova-o para o gabinete de biossegurança. Usando uma pipeta de um mililitro e pipetadora, retire lentamente 100 microlitros da cultura e transfira-a para um tubo einor estéril de 0,5 mililitro.

Feche a tampa do frasco de cultura e devolva-o ao agitador da incubadora o mais rapidamente possível. Misture 7,5 microlitros de uma solução azul trian com 7,5 microlitros de células. Misture vigorosamente e transfira 7,5 microlitros da mistura para uma lâmina de contagem.

Ligue o contador automático de células e coloque a corrediça de contagem na câmara de carregamento. O leitor automático é ativado e as células são contadas automaticamente nas unidades de número de células por mililitro e porcentagem de viabilidade. Determinar o volume da cultura do dador necessário para a transferência para um meio de cultura fresco, a fim de obter uma densidade celular de 300 000 células vivas por mililitro.

Preparar o meio de cultura fresco como indicado anteriormente, transferindo 23 mililitros de meio A e três mililitros de meio B para um novo balão de cultura de 125 ml. Depois disso, remova os frascos de estoque de meio A e meio B do gabinete de biossegurança para reduzir o risco de contaminação. Retirar o balão de cultura de células HEK 2 93 F da incubadora.

Pulverize-o com a solução de etanol a 70% e água e coloque-o no gabinete de biossegurança usando uma pipeta nova. Retirar a alíquota correcta de células da cultura e transferi-la para o balão que contém a cultura fresca. Média. Transfira ambas as culturas do gabinete de biossegurança para o agitador da incubadora.

Cultive as células até uma densidade aproximada de dois a 3 milhões de células vivas por mililitro antes da transfecção. Verifique a densidade celular conforme demonstrado anteriormente e determine a quantidade de células para a transfecção. Usando uma pipeta sorológica estéril.

Transferir o volume adequado de suspensão celular para um tubo de centrifugação de 250 mililitros. Recolher as células por centrifugação a 100 vezes G durante cinco minutos. Após a esterilização, transfira o tubo contendo as células peletizadas para o gabinete de biossegurança.

Use uma pipeta estéril para decantar o sobrenadante que consiste em gasto. O meio de cultura reenvia vigorosamente as células peletizadas pipetando para cima e para baixo usando 10 mililitros de meio de cultura fresco e transfere para um frasco preparado contendo cultura de transfecção fresca. Média. Aperte a tampa do balão de cultura de células ventilado e incube o frasco no agitador da incubadora por 15 minutos a uma hora enquanto as células estão incubando.

Diluir o ADN plasmático e as reservas de POLIETERAMINA ou PEI utilizando meio de cultura fresco até uma concentração final de 0,5 microgramas por microlitro. Remova o frasco de cultura com as células dispersas do agitador da incubadora e leve-o para o gabinete de biossegurança usando uma micropipeta e 300 microlitros de DNA plasmático para a cultura e misture por agitação manual suave a 900 microlitros de PEI para a cultura e misture novamente. Em seguida, a 3,8 mililitros de meio de cultura fresco.

Transferir o balão para o agitador da incubadora durante 24 horas. 24 horas após a transfecção, a cultura celular deve ser diluída. Para preparar primeiro o meio de diluição, utilizar uma pipeta serológica estéril de um mililitro para retirar um mililitro de ácido valpróico PRÉ-WARM 220 milimolar ou VPA e transferi-lo para um tubo estéril de 50 ml.

Em seguida, use uma pipeta sorológica estéril para adicionar cinco mililitros de meio pré-aquecido B e 44 mililitros de meio pré-aquecido A à solução de VPA. Isso resulta em 50 mililitros de meio de cultura fresco com uma concentração final de 4,4 milimolares de VPA. Recupere a cultura transfectada da incubadora.

Esterilize o exterior do frasco e coloque-o na cabine de biossegurança. Adicionar o meio de diluição preparado à cultura. Transfira o frasco de volta para o agitador da incubadora por mais quatro a cinco dias após a transfecção.

Monitore a viabilidade celular diariamente pelo procedimento demonstrado anteriormente. Alíquotas também devem ser guardadas todos os dias para análise da expressão proteica, cinco a seis dias após a transfecção ou se a viabilidade celular cair abaixo de 50%Colha as células centrifugando as células mais o meio a 1000 vezes G por cinco minutos. Colete o sobrenadante que conterá proteína secretada em cinco mililitros de uma solução de alvejante a 10% para o pellet de célula HEK e descarte como um risco biológico.

Posteriormente, a proteína é purificada do sobrenadante coletado. Este sistema de expressão gerou um alto rendimento de proteínas glicosiladas ilustrado por este padrão de expressão típico de IgG one fc após transfecção transitória de células HK 2 93 F. A purificação de afinidade usando uma coluna de proteína para IgG um FC ou coluna de níquel para histamina marcada com GFP com receptor gama FC três A resultou em proteínas com alta pureza.

Este sistema expressou eficientemente IgG enriquecido isotopicamente um FC neste espectro de RMN bidimensional que correlaciona a frequência de ressonância dos núcleos de hidrogênio e o nitrogênio amida diretamente ligado. Sinais bem dispersos de 15 átomos foram vistos. Diferentes formas de glico foram produzidas com células HEK 2 93 F e HEK 2 93 s sob diferentes condições de cultura, conforme mostrado por análises de espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz.

IgG um FC expresso a partir de células HEK 2 93 s, abrigadas e glicanos que eram de uma forma com cinco anos mais dois resíduos de N acetil glucosamina que não continham glicanos de glicose FU de material expresso HEK 2 93 F eram formas complexas de itinerário do tipo bi com glicose FU central e principalmente com N acetil glucosamina terminal ou uma pequena proporção de formas mono ou dilatadas. A adição de um inibidor de glican a uma expressão conduzida usando células HEK 2 93 F mostrou uma redução superior a 90% na incorporação de fuco Uma vez dominado, o estabelecimento da transfecção transitória pode ser concluído em 1,5 horas no primeiro dia e 15 minutos no segundo dia. Após um período de expressão de quatro a seis dias, a solução contendo a proteína pode ser colhida em 15 minutos.

Finalmente, a purificação da proteína levará cerca de 1,5 horas ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter uma cultura estável antes da transfecção de células em crescimento ativo e adicionar DNA antes de adicionar PEI. Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a caracterização funcional de proteínas usando uma variedade de técnicas biofísicas, podem ser realizados para investigar a estrutura e a função da glicoproteína expressa após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem a relação estrutura-atividade de IgG e glicosilação in vitro e in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e purificar glicoproteínas usando nossa combinação de células K 2 93 F e o vetor PZ N dois.