High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

O objetivo geral deste procedimento é expressar glicoproteínas de mamíferos com glicosilação apropriada de mamíferos, direcionando proteínas recombinantes para o retículo endoplasmático e a via secretora mediada pelo GOGI. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na imunologia, como qual é o papel de uma especificação, os padrões na estrutura e o potencial de ativação imune de anticorpos e fragmentos de anticorpos. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza células humanas para expressar proteínas humanas, o que fornece a maquinaria celular apropriada para dobrar e modificar corretamente as proteínas-alvo.

O agitador incubador para o estabelecimento celular deve ser operado a 135 RPM, 80% de umidade, 8% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes da inoculação do cultivo. Ligue a lâmpada UV da cabine de segurança biológica, pré-aqueça as garrafas seladas do meio A e do meio B em um banho-maria a 37 graus Celsius. Desligue as luzes UV e esterilize a cabine de segurança biológica com uma solução de 70% de etanol e água.

Esterilize um frasco de crescimento Erlenmeyer de 125 mililitros com tampa ventilada, pipetas, pipetadores e frascos de meio pré-aquecidos borrifando com uma solução de 70% de etanol em água. Coloque esses itens dentro da cabine de segurança biológica durante todo este procedimento. Todos os itens devem ser esterilizados desta maneira antes de serem introduzidos na cabine de segurança biológica.

Prepare meio de cultura fresco para um cultivo de 30 mililitros retirando 26 mililitros do meio A e três mililitros do meio B e transferindo para o frasco erlenmeyer de 125 mililitros. Misture com agitação suave e aqueça, em banho-maria a 37 graus Celsius, um frasco de células HEK 293F previamente congeladas a menos 80 graus Celsius até descongelar parcialmente as células. Isso leva cerca de um minuto e as células não devem ser completamente descongeladas.

Em seguida, esterilize a parte externa do frasco com a solução de etanol 70% em água e transfira-o para a cabine de segurança biológica. Utilizando uma pipeta de um mililitro, retire a suspensão celular e transfira-a para o frasco erlenmeyer de 125 mililitros contendo 29 mililitros de meio de cultura fresco. Feche a tampa do frasco de cultura e coloque o frasco no agitador de incubação por 24 horas.

24 horas após a inoculação do cultivo. Verifique a densidade celular, esterilize o frasco de cultivo com solução de etanol 70% e água e transfira-o para a cabine de segurança biológica. Utilizando uma pipeta de um mililitro e pipetador, retire lentamente 100 microlitros do cultivo e transfira para um tubo einor estéril de 0,5 mililitro.

Feche a tampa do frasco de cultura e retorne o frasco ao agitador incubador o mais rápido possível. Misture 7,5 microlitros de uma solução de azul de trian com 7,5 microlitros de células. Agite vigorosamente e, em seguida, transfira 7,5 microlitros da mistura para uma lâmina de contagem.

Ligue o contador automático de células e coloque a lâmina de contagem na câmara de carregamento. O leitor automático é ativado e as células são contadas automaticamente em unidades de número de células por mililitro e porcentagem de viabilidade. Determine o volume da cultura do doador necessário para transferência para um meio de cultura fresco, a fim de obter uma densidade celular de 300.000 células vivas por mililitro.

Prepare o meio de cultura fresco conforme mostrado anteriormente, transferindo 23 mililitros do meio A e três mililitros do meio B para um frasco de cultura novo de 125 mililitros. Em seguida, remova os frascos estoque dos meios A e B da cabine de segurança biológica para reduzir o risco de contaminação. Retire o frasco de cultura celular HEK 293 F do incubador.

Pulverize com a solução de etanol 70% em água e coloque no gabinete de segurança biológica usando uma pipeta nova. Retire a alíquota correta de células do cultivo e transfira para o frasco contendo meio de cultura fresco. Transfira ambos os cultivos do gabinete de segurança biológica para o agitador de incubação.

Cultive as células até uma densidade aproximada de dois a três milhões de células vivas por mililitro antes da transfeção. Verifique a densidade celular conforme demonstrado anteriormente e determine a quantidade de células para a transfeção. Utilizando uma pipeta serológica estéril.

Transfira o volume apropriado da suspensão celular para um tubo de centrífuga de 250 mililitros. Colete as células por centrifugação a 100 vezes G durante cinco minutos. Após a esterilização, transfira o tubo contendo as células em pellet para a cabine de segurança biológica.

Utilize uma pipeta estéril para decantar o sobrenadante, que consiste no meio de cultura usado. Resuspenda vigorosamente as células em pellet por pipetagem para cima e para baixo usando 10 mililitros de meio de cultura fresco e transfira para um frasco preparado contendo meio de cultura para transfeção fresco. Parafuse a tampa no frasco de cultura celular com ventilação e incube o frasco no agitador-incubadora por 15 minutos a uma hora enquanto as células estão em incubação.

Dilua o DNA plasmidial e os estoques de POLYETHERAMINE ou PEI usando meio de cultura fresco até uma concentração final de 0,5 microgramas por microlitro. Remova o frasco de cultura com as células dispersas do agitador de incubação e leve-o para a cabine de segurança biológica usando uma micropipeta, adicionando 300 microlitros de DNA plasmidial à cultura e misturando com agitação manual suave; em seguida, adicione 900 microlitros de PEI à cultura e misture novamente. Depois, adicione 3,8 mililitros de meio de cultura fresco.

Transfira o frasco para o agitador incubador por 24 horas. Vinte e quatro horas após a transfeção, o cultivo celular deve ser diluído. Para preparar o meio de diluição primeiro, use uma pipeta serológica estéril de um mililitro para retirar um mililitro de ácido valpróico PREWARM 220 milimolar ou VPA e transfira-o para um tubo estéril de 50 mililitros.

Em seguida, utilize uma pipeta serológica estéril para adicionar cinco mililitros do meio B pré-aquecido e 44 mililitros do meio A pré-aquecido à solução de VPA. Isso resulta em 50 mililitros de meio de cultura fresco com uma concentração final de 4,4 milimolar de VPA. Retire a cultura transfectada do incubador.

Sterilize o exterior do frasco e coloque o frasco na cabine de segurança biológica. Adicione o meio de diluição preparado à cultura. Transfira o frasco de volta para o agitador de incubação por mais quatro a cinco dias após a transfeção.

Monitore a viabilidade celular diariamente pelo procedimento demonstrado anteriormente. Aliquotas também devem ser armazenadas a cada dia para análise de expressão proteica, cinco a seis dias após a transfeção ou se a viabilidade celular cair abaixo de 50%. Recolha as células por centrifugação das células e do meio a 1000 vezes G durante cinco minutos. Colete o sobrenadante, que conterá a proteína secretada, e descarte adicionando cinco mililitros de uma solução de hipoclorito a 10% ao pellet de células HEK como resíduo biológico perigoso.

Posteriormente, a proteína é purificada a partir do sobrenadante coletado. Este sistema de expressão gerou um alto rendimento de proteínas glicosiladas, ilustrado por este padrão típico de expressão de IgG um fc após transfeção transitória de células HK 2 93 F. A purificação por afinidade utilizando uma coluna de proteína para IgG um FC ou coluna de níquel para GFP marcado com histidina com receptor de fc gama três A resultou em proteínas com alta pureza.

Este sistema expressou eficientemente IgG isotopicamente enriquecida com um FC neste espectro de RMN bidimensional que correlaciona a frequência de ressonância dos núcleos de hidrogênio e o nitrogênio amídico diretamente ligado. Sinais bem dispersos de átomos 15 foram observados. Diferentes formas glicossiladas foram produzidas com células HEK 293 F e HEK 293 s sob diferentes condições de cultivo, conforme demonstrado por análises de espectrometria de massas por ionização a laser assistida por matriz.

IgG com um FC expresso em células HEK 293, continha glicanos na forma com cinco manoses mais dois resíduos de N-acetilglicosamina, que não continham glicanos com fucose. Os glicanos expressos a partir do material de células HEK 293F eram formas complexas biantenárias com fucose central, apresentando predominantemente N-acetilglicosamina terminal ou uma pequena proporção de formas mono ou di-sialiladas. A adição de um inibidor da glicosilação a uma expressão realizada com células HEK 293F mostrou uma redução superior a 90% na incorporação de fucose. Após dominar a técnica, o estabelecimento da transfeção transitória pode ser concluído em 1,5 hora no primeiro dia e em 15 minutos no segundo dia. Após um período de expressão de quatro a seis dias, a solução contendo a proteína pode ser colhida em 15 minutos.

Por fim, a purificação da proteína levará cerca de 1,5 hora. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter uma cultura estável antes da transfeção, transfectar células em crescimento ativo e adicionar o DNA antes de adicionar o PEI. Após este procedimento, outros métodos, como a caracterização funcional da proteína utilizando uma variedade de técnicas biofísicas, podem ser realizados para investigar a estrutura e a função da glicoproteína expressa após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem a relação entre estrutura e atividade de IgG e glicosilação in vitro e in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e purificar glicoproteínas utilizando nossa combinação de células K 2 93 F e o vetor PZ N dois.