Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

Simplesmente cultivando o sangue total com meio otimizado livre de soro animal. Em um frasco de 75 centímetros quadrados, os CFCs E aderem à superfície do frasco para remover a maioria dos glóbulos vermelhos e brancos. Lave o frasco no primeiro dia e elimine as células restantes trocando o meio total no quinto dia.

Continue rastreando colônias em dias alternados ou, se conveniente, três vezes por semana. E você deve observar as primeiras colônias por volta do dia 12. Olá, meu nome é Nicole Hoffman, do laboratório da Unidade de Pesquisa de Células-Tronco da Universidade Médica.

Hoje mostraremos um processo simplificado para o isolamento e expansão de células progenitoras formadoras de colônias endoteliais ou ECFC do sangue periférico humano adulto. Em nosso laboratório, usamos esse processo para estudar a função e a biologia do ECFC in vitro e in vivo. Então vamos começar.

Esta seção começa com a preparação e esterilização por filtro do meio de crescimento endotelial dois, que será usado para cultura. Os EFCs pré-aquecem 20 mililitros de meio em banho-maria de 37 graus. Retire cinco mililitros de sangue periférico humano adulto da veia cubital para um tubo vacutainer de sangue de heparina sódica livre de conservantes de seis mililitros.

As amostras de sangue devem ser processadas dentro de duas horas após a coleta em uma capela de fluxo laminar. Um balão de 1 75 centímetros quadrados com uma tampa ventilada, 1 pipeta de 25 mililitros e duas pipetas de cinco mililitros em uma bancada de fluxo laminar. Use uma pipeta de 25 mililitros para pré-encher o frasco com 15 mililitros de E GM dois suplementados pré-aquecidos.

Abra o arquivo de sangue e use a pipeta de cinco mililitros para transferir diretamente todos os cinco mililitros de sangue para o frasco. Use a pipeta para enxaguar o frasco de sangue vazio com os cinco mililitros restantes de E GM dois pré-guerra. Adicionar este volume ao balão.

Feche a tampa ventilada do balão, que deve agora conter 25 mililitros. Colocar o balão numa incubadora regulada para 37 graus, 5% de dióxido de carbono e 95% de humidade durante 24 horas. No dia seguinte, pré-aqueça 20 mililitros de e GM suplementado dois e 30 mililitros de PBS em banho-maria a 37 graus e arrume 2 pipetas de 25 mililitros e três pipetas de 10 mililitros em uma capela de fluxo laminar.

Retirar da incubadora o balão que contém a amostra e retirar a mistura de sangue médio que contém células não aderentes com uma pipeta de 25 mililitros. Tome cuidado para não arranhar a superfície do frasco com a pipeta. Para evitar arranhar as células aderentes, adicione suavemente 10 mililitros de PBS pré-aquecido à superfície aderente da célula do frasco interno e incline o frasco de um lado para o outro.

Remova e descarte imediatamente o PBS. Repita isso, lave duas vezes. Em seguida, trabalhando de forma rápida e suave.

Para evitar o desprendimento das células, adicione 20 mililitros de pré-aquecimento fresco e GM dois ao frasco e coloque-o de volta na incubadora. Tomando cuidado para não levar o frasco para fora da incubadora por mais de cinco minutos, use um microscópio de luz de baixa ampliação para verificar se há crescimento de ECFC no frasco em dias alternados. Começando no segundo dia no quinto dia após a semeadura pré-guerra 20 mililitros de EGM dois em banho-maria de 37 graus e preparar 2 pipetas de 25 mililitros.

Trabalhando rapidamente para evitar a secagem. Use esses suprimentos para substituir o meio por pré-aquecimento fresco suplementado e GM dois, que removerá as células não aderentes. Colocar o balão de volta na incubadora e repetir o processo de triagem diariamente.

Substitua 30% do meio por EGM recém-suplementado. Duas vezes por semana. Colônias típicas com morfologia de paralelepípedos devem aparecer por volta do dia 12.

Assinalar o lado exterior superior do balão para indicar a posição de cada colónia. Deixe as colônias crescerem até o dia 28, a menos que as células individuais comecem a se desprender. Uma vez identificadas as colônias primárias, elas podem ser colhidas entre os dias 14 e 28, dependendo de seu tamanho.

Pré-aqueça cinco mililitros de uma solução de tripsina EDTA e 20 mililitros de PBS a 37 graus. Tomando cuidado para não tocar na superfície do frasco, transfira todo o meio para um tubo de falcão. Isso é usado posteriormente para extinguir a atividade da tripsina e lavar cuidadosamente as células com 10 mililitros de PBS pré-guerra.

Adicione cinco mililitros de tripsin EDTA e incube a solução por aproximadamente cinco minutos a 37 graus ou até que as células se desprendam. Tome cuidado para não incubar por mais de sete minutos, pois a tripsina pode se tornar tóxica para as células após a incubação, bata fortemente nas laterais do frasco para ajudar as células a se desprenderem após a reação. Extinguir a atividade da protease de tentina adicionando aproximadamente 10 mililitros do meio de cultura usado preservado.

Transfira a suspensão celular para um tubo de falcão de 50 mililitros. Lave o balão uma vez com 10 mililitros de PBS e adicione a solução de lavagem à suspensão de células colhidas. Girar a suspensão celular a 300 vezes G durante sete minutos numa centrifugadora refrigerada para recolher as células e remover a tripsina, rejeitar o sobrenadante e ressuspender imediatamente o sedimento celular em um mililitro de PBS.

Mantenha as células ressuspensas no gelo. Determine o número de células conforme descrito em outro protocolo JoVE de Ricardo e Phelan. Em seguida, passe para a expansão do ECFC.

No caso de mais de 360.000 E CFCs serem recuperados, prossiga para a etapa de expansão no caso de menos de 260.000 e CFCs serem recuperados. Considere expandir ainda mais as células antes da expansão em larga escala. Faça isso semeando aproximadamente 75.000 EFCs em 20 mililitros de E GM dois em um frasco de cultura de células de 75 centímetros quadrados e cultura por mais uma semana ou até que a confluência seja alcançada.

Suplemento 500 mililitros de E GM dois conforme descrito no protocolo escrito que acompanha e pré-aqueça esta mistura em banho-maria a 37 graus. Para cada aproximadamente 2.500 centímetros quadrados de espaço de cultura, prepare uma fábrica de células de quatro camadas ou CA quatro. Além disso, reúna duas tampas frescas de Tyvek e um funil estéril especial e armazene-as na capela de fluxo laminar para semear E CFCs a uma densidade celular inicial de 100 células por centímetro quadrado.

Primeiro, calcule o número de células para cada CF quatro 250.2, 800. As células são ressuspensas em 500 mililitros de E GM dois frescos e despejadas no CF quatro. Usando um funil estéril, use a tampa coberta de Tyvek para fechar uma abertura e incline o CF quatro para um lado longitudinal para permitir a distribuição igual do meio entre os quatro níveis.

Agora a câmara pode ser inclinada para trás e a tampa da tampa do Tyvek pode ser aberta. Certifique-se de proteger as aberturas abertas usando duas tampas vermelhas. Essas tampas podem ser compradas com o CF quatro no caminho para a incubadora.

Coloque o CF quatro na incubadora e remova as tampas vermelhas para permitir a troca gasosa de 20% do meio pelo meio pré-guerra pelo menos uma vez por semana até que o CF quatro seja confluente. Esse processo depende do doador e provavelmente ocorrerá após 10 a 14 dias. Finalmente, as células podem ser colhidas conforme descrito anteriormente, usando Tripsin EDTA pré-guerra e o meio usado para extinguir a atividade da protease.

Além disso, use aproximadamente 200 mililitros de PVS para lavar por volta do dia 12. As colônias ECFC começarão a aparecer com uma morfologia típica de paralelepípedos, como você pode ver nesta colônia, ou como algumas células agrupadas, como nesta colônia encontrada no dia 12. À medida que as colônias crescem, mais células formam a morfologia típica de paralelepípedos.

Como você pode ver aqui, após 15 dias e após 18 dias por imunoquímica, os CFCs e isolados podem ser caracterizados com marcadores típicos de superfície celular endotelial como CD 1 46, CD 1 44, fermentação de CD 31 e fator de von Willebrand. Acabamos de mostrar como isolar e expandir uma colônia endotelial formando células progenitoras do sangue periférico humano adulto enquanto faz este procedimento. É importante lembrar que a taxa de sucesso deste protocolo depende do doador e varia de 50 a 70%Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.