Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco Aplysia

O cálcio intracelular tem sido implicado como uma parte importante de vários mecanismos de plasticidade sináptica. Essas ideias podem ser testadas monitorando simultaneamente as mudanças no cálcio e as alterações na eficácia sináptica. Aqui demonstramos como isso é feito combinando imagens de cálcio com registro intracelular.

Nossos experimentos são conduzidos com um gânglio do molusco Aplysia Cahora. Esta preparação tem uma série de vantagens, como grandes neurônios identificados, as baixas temperaturas que são naturais para a apia, sinais lentos e facilitam a imagem, mas as técnicas gerais que demonstramos são facilmente transferidas para outros sistemas. Olá, sou Colin Evans no laboratório de Elizabeth Cropper no Departamento de Neurociência de Fishburg e no Freedman Brain Institute na Mount Sinai School of Medicine, em Nova York.

Hoje, vamos demonstrar imagens simultâneas de alterações na concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no gânglio bucal do molusco Aplysia cahora. Para detectar cálcio intracelular, injetaremos um neurônio pré-sináptico com a célula IMP indicador de cálcio permeável corante cálcio laranja. A preparação é então movida ao microscópio e os neurônios pré e pós-sinápticos são empalados com eletrodos afiados.

A estimulação pré-sináptica repetida resulta em uma resposta pós-sináptica aprimorada visível como aumento do potencial pós-sináptico ou amplitude PSP. A medição do sinal fluorescente do corante indicador de cálcio nos permitirá detectar alterações simultâneas no cálcio intracelular pré-sináptico. Para começar a anestesiar um animal adulto pesando cerca de 150 gramas, injetando 75 mils de solução isotônica de cloreto de magnésio, prenda o animal anestesiado em um prato coberto de cera e, em seguida, usando uma pinça grosseira e uma tesoura, faça uma incisão no pé do animal e exponha a massa bucal.

O gânglio vestibular fica no lado ventral da massa bucal e consiste em dois hemigânglios conectados. Ele contém várias centenas de neurônios que, juntamente com neurônios em outros gânglios, contribuem para a geração e controle do comportamento alimentar do animal. Liberte cuidadosamente o gânglio cortando todos os nervos dobrados com uma tesoura fina e remova-o do animal.

Em seguida, prenda o gânglio libertado na base de um prato revestido de sil guard cheio de água do mar artificial. O gânglio é envolto em uma bainha de tecido conjuntivo, que deve ser removida para expor os neurônios individuais. Use uma pinça de verificação, uma tesoura de íris e muito cuidado para cortar essa bainha.

Para evitar danos aos neurônios, estabilize o gânglio da bainha com cerca de 15 pinos de minuto, pois qualquer movimento será problemático durante a imagem. Para preparar eletrodos afiados para gravação intracelular e injeção de corante, puxe o tubo capilar com um extrator de microeletrodo. Usamos vidro de silicato de jibóia de filamento de parede fina com um diâmetro externo de um milímetro.

Os eletrodos de registro devem ter uma resistência de cerca de 10 mega quando preenchidos com acetato de potássio de três molares e, portanto, ajustamos o extrator de acordo para preencher os eletrodos D. Mergulhe a parte de trás do eletrodo puxado em uma solução de 10 milimolares da ação capilar do corante de laranja de cálcio ao longo do filamento de vidro dentro do eletrodo atrairá o corante para a ponta e, em seguida, preencha o eletrodo com cloreto de potássio 200 milimolar para garantir um bom contato elétrico. Usamos um Bela personalizado para melhorar as propriedades do eletrodo e diminuir a resistência do eletrodo de gravação para cerca de cinco mega.

O eletrodo é mantido em um ângulo de 45 graus em um fluxo de uma suspensão de óxido de alumínio. A mistura de cloreto de sódio na suspensão e a conexão de um medidor de som permitem o monitoramento da resistência do eletrodo. Durante o processo de chanfro, transferimos o prato contendo os gânglios da fivela enganados para um equipamento de eletrofisiologia e localizamos os neurônios de interesse, empalando-os com eletrodos e verificando sua identidade.

Para preparar o neurônio para imagens de cálcio, primeiro inserimos um eletrodo preenchido com corante no soma da célula e carregamos o eletro do corante teoricamente com 30 minutos de pulsos de corrente hiperpolarizantes de 15 nano amperes. À medida que o D laranja de cálcio entra na célula, o SOR adquire uma cor rosa fraca. Em seguida, retraímos cuidadosamente os eletrodos de registro e deixamos a preparação em repouso por pelo menos 30 minutos para permitir que o corante se difunda nos processos finos do neurônio.

Em seguida, transfira o prato com a preparação para um microscópio fluorescente. Usamos uma lente de imersão em água 10 vezes NA 0.3 em um microscópio de platina fixa vertical, que focaliza movendo a lente e não a platina. Isso facilita a montagem de manipuladores.

Para os eletrodos de gravação, selecione um bloco de filtro apropriado. Um bloco de três filtros SI fornecerá os filtros corretos de excitação e emissão para laranja de cálcio, ajustará os parâmetros da câmera e a intensidade da iluminação com filtros de densidade neutra e a abertura do campo. Mais luz resultará em menos ruído, mas pode potencialmente branquear a preparação.

A câmera CCD de encaixe legal pode capturar um campo de 500 por 300 pixels a uma taxa de quadros de cerca de 30 quadros por segundo e uma boa relação sinal-ruído. Minimize a iluminação dos neurônios fil mantendo o obturador das fontes de luz fechado sempre que possível. No software de imagem, selecione regiões de interesse ou R ois.

Essas regiões definem onde o software fará as medições de intensidade. Geralmente imaginamos os ramos primário, secundário e terciário do neurônio pré-sináptico. Coloque um ROI adicional ao lado do neurônio difi para obter um valor de fundo que é posteriormente subtraído de todos os outros pontos de dados.

Eletrodos de registro intracelular nos neurônios pré e pós-sinápticos são usados para induzir e monitorar a transmissão sináptica. Você pode garantir a sincronização entre a aquisição de dados eletrofisiológicos e de imagem se usar o sinal de disparo de quadro da câmera para iniciar o software de aquisição de dados. Outra maneira de garantir a sincronização é montar um LED dentro da porta da câmera.

Este LED é ligado brevemente no início da sessão de gravação e, portanto, fornece uma marca de sincronização. Durante um experimento típico, você aciona potenciais de ação no neurônio pré-sináptico por injeção de pulsos de corrente breve. Neste exemplo, mostramos uma explosão de picos e aumentos correspondentes no sinal de cálcio para testar hipóteses específicas.

O sinal de cálcio pode ser manipulado e os efeitos na transmissão sináptica determinados. Por exemplo, medicamentos como o quelante de cálcio EGTA podem ser injetados pré-sinapticamente ou aplicados através do sistema de perfusão. Os dados são analisados exportando-os do software de imagem para um arquivo de texto e, em seguida, para o software que foi usado para adquirir os dados eletrofisiológicos, que no nosso caso é o pico dois da Cambridge Electronic Design.

Usamos um script escrito personalizado para plotar os valores de intensidade de ROI e as mudanças correspondentes no potencial de membrana, quantificar as mudanças no sinal de cálcio subtraindo o sinal de fundo obtido do ROI de fundo e calculando a mudança relativa com a equação mostrada. F zero é a fluorescência imediatamente antes da estimulação e F é a fluorescência durante a estimulação. Aqui mostramos os resultados de um experimento no qual imaginamos mudanças na fluorescência do cálcio no neurônio B 21 identificado.

A região que fotografamos é indicada em A, em B um, induzimos uma explosão de picos em B 21, que induziu potenciais pós-sinápticos em B oito e uma mudança no sinal de cálcio. B dois mostra o efeito da injeção do quelante de cálcio. Os picos de EGTA em B 21 não induzem mais aumentos generalizados na fluorescência do cálcio e a amplitude do potencial pós-sináptico é diminuída.

Em conclusão, demonstramos técnicas que podem ser usadas para monitorar simultaneamente a concentração de cálcio intracelular e avaliar a eficácia da transmissão sináptica. Essas técnicas requerem apenas equipamentos modestos em comparação com a maioria das imagens funcionais e são fáceis e rápidas de aprender.