Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco

Tem-se sugerido que o cálcio intracelular desempenha um papel importante em diversos mecanismos de plasticidade sináptica. Essas ideias podem ser testadas mediante o monitoramento simultâneo de alterações no cálcio e nas modificações da eficácia sináptica. Aqui demonstramos como isso é realizado combinando o imageamento de cálcio com a gravação intracelular.

Nossos experimentos são realizados com um gânglio do molusco Aplysia Cahora. Este preparo apresenta diversas vantagens, como neurônios grandes e identificados, as baixas temperaturas naturais para apia, sinais lentos e facilitação da imagem, mas as técnicas gerais que demonstramos são facilmente transferíveis para outros sistemas. Olá, sou Colin Evans no laboratório de Elizabeth Cropper no Departamento de Neurociência Fishburg e no Instituto Cerebral Freedman na Escola de Medicina Mount Sinai em Nova York.

Hoje, vamos demonstrar a imagem simultânea de mudanças na concentração intracelular de cálcio e na eficácia sináptica no gânglio bucal do molusco Aplysia cahora. Para detectar o cálcio intracelular, injetaremos um neurônio pré-sináptico com o corante indicador de cálcio permeável à membrana celular, calcium orange. Em seguida, o preparo é transferido para sob o microscópio e os neurônios pré e pós-sinápticos são impalados com eletrodos agudos.

A estimulação pré-sináptica repetida resulta em uma resposta pós-sináptica aumentada, visível como potencial pós-sináptico crescente ou amplitude do PSP. Medir o sinal fluorescente do corante indicador de cálcio permitirá detectar alterações simultâneas no cálcio intracelular pré-sináptico. Para começar, anestesie um animal adulto com cerca de 150 gramas injetando 75 mililitros de solução isotônica de cloreto de magnésio, fixe o animal anestesiado em um recipiente revestido com cera e, usando pinças e tesouras grossas, faça uma incisão no pé do animal e exponha a massa bucal.

O gânglio bucal situa-se na face ventral da massa bucal e é composto por dois hemigânglios conectados. Ele contém várias centenas de neurônios que, juntamente com neurônios de outros gânglios, contribuem para a geração e controle do comportamento alimentar do animal. Libere cuidadosamente o gânglio cortando todos os nervos dobrados com uma tesoura fina e remova-o do animal.

Em seguida, fixe o gânglio liberado na base de uma placa revestida com sil guard contendo água do mar artificial. O gânglio está envolto por uma bainha de tecido conjuntivo, que deve ser removida para expor os neurônios individuais. Utilize pinças de dissecação, tesoura de íris e extrema cautela para remover essa bainha.

Para evitar danificar os neurônios, estabilize o gânglio desseretizado com aproximadamente 15 alfinetes, pois qualquer movimento será problemático durante a obtenção de imagens. Para preparar eletrodos afiçados para gravação intracelular e injeção de corante, puxe tubos capilares com um puxador de microeletrodos. Utilizamos vidro borossilicato com filamento e parede fina, com diâmetro externo de um milímetro.

Os eletrodos de gravação devem ter uma resistência de cerca de 10 mega quando preenchidos com acetato de potássio três molar, e assim ajustamos o puxador adequadamente para preencher os eletrodos D. Mergulhe a parte traseira do eletrodo puxado em uma solução de 10 milimolar do corante orange de cálcio; a ação capilar ao longo do filamento de vidro dentro do eletrodo atrairá o corante até a ponta, depois preencha o eletrodo com cloreto de potássio 200 milimolar para garantir um bom contato elétrico. Utilizamos um Bela construído sob medida para melhorar as propriedades do eletrodo e reduzir a resistência do eletrodo de gravação para cerca de cinco mega.

O eletrodo é mantido em um ângulo de 45 graus em um fluxo de uma suspensão de óxido de alumínio. A mistura de cloreto de sódio na suspensão e a conexão de um ohmímetro permitem o monitoramento da resistência do eletrodo. Durante o processo de afiação, transferimos a placa contendo os gânglios bucais decepados para um aparato de eletrofisiologia e localizamos os neurônios de interesse ao penetrá-los com eletrodos e verificar sua identidade.

Para preparar o neurônio para a imagem de cálcio, inserimos primeiro um eletrodo preenchido com corante no soma celular e carregamos o corante eletrofisiologicamente com 30 minutos de pulsos de corrente hiperpolarizantes de 15 nanoampères. À medida que o D laranja de cálcio entra na célula, o RSO adquirirá uma coloração rosa pálida. Em seguida, retiramos cuidadosamente os eletrodos de registro e deixamos a preparação em repouso por pelo menos 30 minutos para permitir que o corante se difunda pelos processos finos do neurônio.

Em seguida, transfira a lâmina com o preparo para um microscópio de fluorescência. Utilizamos uma objetiva de imersão em água com aumento de 10 vezes e abertura numérica (NA) de 0,3 em um microscópio vertical com platina fixa, que realiza a focalização movendo a objetiva e não a platina. Isso facilita a montagem de manipuladores.

Para os eletrodos de gravação, selecione um bloco de filtros apropriado. Um bloco de três filtros SI fornecerá os filtros corretos de excitação e emissão para a calcium orange; ajuste os parâmetros da câmera e a intensidade da iluminação com filtros de densidade neutra e a abertura de campo. Mais luz resultará em menos ruído, mas pode potencialmente clarear a preparação.

A câmera CCD de clique rápido pode capturar um campo de 500 por 300 pixels a uma taxa de quadros de cerca de 30 quadros por segundo e com boa relação sinal-ruído. Minimize a iluminação dos neurônios fil por manter as fontes de luz com obturador fechado sempre que possível. No software de imagem, selecione as regiões de interesse ou ROIs.

Essas regiões definem onde o software realizará as medições de intensidade. Geralmente, realizamos imagens dos ramos primários, secundários e terciários do neurônio pré-sináptico. Posicione uma ROI adicional ao lado do neurônio difi para obter um valor de fundo que será posteriormente subtraído de todos os outros pontos de dados.

Utilizam-se eletrodos de registro intracelular em neurônios pré e pós-sinápticos para induzir e monitorar a transmissão sináptica. É possível garantir a sincronização entre a aquisição de dados eletrofisiológicos e de imagem se você usar o sinal de disparo do quadro da câmera para iniciar o software de aquisição de dados. Outra forma de garantir a sincronização é montar um LED dentro da porta da câmera.

Este LED é brevemente ligado no início da sessão de gravação, fornecendo assim uma marca de sincronização. Durante um experimento típico, você dispara potenciais de ação no neurônio pré-sináptico mediante injeção de pulsos breves de corrente. Neste exemplo, mostramos uma rajada de picos e os aumentos correspondentes no sinal de cálcio para testar hipóteses específicas.

O sinal de cálcio pode ser manipulado e os efeitos sobre a transmissão sináptica determinados. Por exemplo, fármacos como o quelante de cálcio EGTA podem ser injetados ou aplicados por meio do sistema de perfusão na região pré-sináptica. Os dados são analisados exportando-os a partir do software de imagem para um arquivo de texto e, em seguida, para o software utilizado na aquisição dos dados eletrofisiológicos, que, no nosso caso, é o spike two da Cambridge Electronic Design.

Utilizamos um script personalizado para traçar os valores de intensidade da ROI e as alterações correspondentes no potencial da membrana, quantificando as mudanças no sinal de cálcio mediante a subtração do sinal de fundo obtido a partir da ROI de fundo e calculando a variação relativa com a equação apresentada. F zero é a fluorescência logo antes da estimulação, e F é a fluorescência durante a estimulação. Aqui mostramos os resultados de um experimento no qual registramos alterações na fluorescência de cálcio no neurônio identificado B 21.

A região que imageamos está indicada em A; em B um, induzimos um surto de potenciais de ação em B 21, o que provocou potenciais pós-sinápticos em B oito e uma alteração no sinal de cálcio. B dois mostra o efeito da injeção do quelante de cálcio. EGTA, potenciais de ação em B 21 não induzem mais aumentos generalizados na fluorescência de cálcio e a amplitude do potencial pós-sináptico é reduzida.

Em conclusão, demonstramos técnicas que podem ser usadas para monitorar simultaneamente a concentração intracelular de cálcio e avaliar a eficácia da transmissão sináptica. Essas técnicas requerem apenas equipamentos modestos em comparação com a maioria das técnicas de imagem funcional e são fáceis e rápidas de aprender.