De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do comportamento celular dentro do tubo neural embrionário em alta resolução por longos períodos de tempo. Isso é feito primeiro cortando o tubo neural inicial com uma expressão de condução de uma proteína fluorescente de escolha para marcar células individuais. O próximo passo é fazer fatias do embrião inicial e montá-las em pratos com fundo de vidro.

Após a recuperação em uma incubadora, as fatias de embrião são visualizadas em um microscópio de campo amplo em intervalos regulares. Em última análise, essa técnica pode ser usada para estudar o comportamento celular dentro do neuroepitélio em desenvolvimento por longos períodos de tempo com alta resolução espacial e temporal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes para imagens de tecidos vivos é que ela nos permite observar o comportamento celular individual por longos períodos de tempo em alta resolução espacial e temporal.

Este método permite que você aborde questões-chave no campo da neurobiologia do desenvolvimento, como o papel da orientação do fuso mitótico na escolha do sulfato ou como a dinâmica de sinalização pode estar regulando o comportamento celular antes da eletroporação de plasmídeos no tubo neural. As agulhas de vidro são preparadas usando um extrator microcapilar sob um microscópio de dissecação. Use uma pinça fina para quebrar a ponta da agulha.

A ponta da agulha deve ser afiada o suficiente para perfurar o tubo neural, sem ser tão estreita que impeça a injeção da solução de DNA. O X para este experimento foi incubado a 37 graus Celsius por cerca de 36 horas para hambúrguer Hamilton. Estágio 10.

Para iniciar este procedimento, janela e ovo e coloque eletrodos a cinco milímetros de distância de cada lado do embrião, injete DNA no tubo neural. O DNA é colorido com uma pequena quantidade de verde rápido para visualização. Aplique uma corrente de 12 a 17 volts e comprimento de pulso de 50 milissegundos três vezes com 950 milissegundos entre os pulsos.

Baixas concentrações de DNA e baixas tensões de eletroporação são usadas para alcançar a expressão do mosaico para que as células individuais possam ser seguidas. Por fim, cubra a janela na casca do ovo com fita adesiva, certificando-se de que esteja selada. Deixe os embriões se recuperarem por três a quatro horas ou durante a noite a 37 graus Celsius.

A mistura de colágeno e o meio de cultura de fatias devem ser preparados cerca de uma hora antes do corte dos embriões. Para preparar a mistura de colágeno a 100 microlitros de solução de ácido acético a 0,1% para 300 microlitros de colágeno tipo um e vórtice completamente, adicione 100 microlitros de cinco vezes L 15, médio e vórtice completamente. Novamente, a solução deve ficar amarela.

Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de bicarbonato de sódio a 7,5% e vortex completamente. A solução deve ficar ligeiramente rosada. Mantenha no gelo.

Esta mistura de colágeno deve ser preparada fresca a cada vez. Para preparar o meio de cultura fatiado a seguir para 10 mililitros de meio neurobasal, suplemento B 27 glut max e solução de gentamicina, coloque o meio em uma incubadora de 37 graus Celsius, tamponada com 5% de dióxido de carbono. Deixe a parte superior do recipiente solta para permitir que ele se equilibre com o dióxido de carbono por pelo menos uma hora.

Para iniciar este procedimento, use uma tesoura pequena para cortar o embrião. Retire o embrião do ovo com uma pinça lavando L 15 médio. Coloque o embrião em uma placa de cultura de tecidos com uma camada de proteção de sílaba na parte inferior.

Prenda o embrião através das membranas embrionárias extras circundantes para que as membranas fiquem esticadas. Usando uma microfaca, corte o embrião o mais reto possível na região de interesse. Para fatias da medula espinhal devem estar entre um a dois somitos fatias de folhas grossas presas ao tecido lateral do embrião para que não sejam perdidas enquanto outros embriões estão sendo fatiados.

Uma ponta de micro perpet personalizada é necessária para transferir as fatias da medula espinhal para o prato de fundo de vidro. Para preparar isso, prenda uma ponta de 200 microlitros a um P dois ou P 10 perman e corte aproximadamente um milímetro da extremidade da ponta. Codifique o interior da ponta com colágeno preparando um microlitro da mistura de colágeno que foi preparada anteriormente.

Deixe por um a dois minutos e depois enxágue com L 15 médio. Isso evitará que o tecido grude na parte interna da ponta. Agora retire uma fatia do embrião usando uma microfaca e remova a fatia do prato usando o P dois ou P 10 equipado com a ponta de 200 microlitros.

Tente ocupar o mínimo de meio possível. Vortex a mistura de colágeno e coloque de cinco a oito microlitros em um prato de fundo de vidro revestido de poliol lisina com uma lamínula como base, coloque imediatamente a fatia do embrião no colágeno e posicione-a com uma pinça fina. Os LICs devem ser posicionados de forma que o lado a ser fotografado fique nivelado com a lamínula.

O tecido deve aderir ao revestimento de poliol lisina na lamínula. Repita isso até que você tenha várias fatias na lamínula. Normalmente, seis a nove fatias são colocadas em um prato.

Quando todas as fatias estiverem no lugar, adicione dois a três microlitros de L 15, colágeno médio a primeiro lugar e cubra o prato. Deixe o colágeno endurecer por 20 minutos. Assim que o colágeno estiver firme, adicione cuidadosamente dois mililitros de meio de cultura de fatias que tenha sido equilibrado por pelo menos uma hora em 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius.

Deve-se tomar cuidado para não desalojar o colágeno da lamínula em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% e permitir que as fatias se recuperem por pelo menos três horas antes da imagem. A imagem do comportamento celular dentro do tecido por longos períodos de tempo em alta resolução temporal e espacial é um desafio. Uma combinação de condições ótimas de cultivo e o uso de microscopia de campo branco é essencial para a obtenção de bons resultados.

Um microscópio de campo amplo com núcleo de visão delta equipado com uma câmara ambiental de estação meteorológica é usado para obter imagens das fatias. A câmara é constantemente mantida a 37 graus Celsius com um aparelho de perfusão de dióxido de carbono para manter o estágio do microscópio em 5% de dióxido de carbono e 95% A imagem de ar é normalmente realizada usando uma lente de imersão em óleo de 40 vezes 1,30 NA e as imagens são capturadas com um núcleo snap HQ dois chamados CCD camera Z As seções são capturadas a cada 1,5 mícrons a 45 mícrons de exposição do tecido. O tempo deve ser mantido o mais baixo possível, por exemplo, de cinco a 50 milissegundos.

Para cada seção mencionada, as imagens são capturadas a cada sete minutos. Até nove fatias podem ser visitadas usando os sistemas de visão Delta. A função de visita de ponto preciso mostrada aqui é um exemplo de sequência de lapso de tempo de uma célula progenitora da medula espinhal transfectada com uma construção que expressa GFP alfa A imagem da tubulina foi iniciada em uma fatia da medula espinhal de um embrião HH estágio 12 de dois dias.

Durante este estágio inicial, as células progenitoras neurais sofrem divisões predominantemente do modo progenitor progenitor durante as quais as células se dividem para gerar mais duas células progenitoras cíclicas. Esta figura mostra os quadros selecionados da sequência de lapso de tempo que acabamos de mostrar. Às duas horas e 20 minutos, a célula se divide com um plano de clivagem perpendicular à superfície apical gerando duas células-filhas.

Essas duas células se dividem mais uma vez em 24 horas e 23 minutos e 25 horas e 54 minutos. Esta próxima sequência de lapso de tempo é de uma célula transfectada com G-F-P-G-P-I marcando a membrana celular. Esta célula sofre uma divisão durante a qual o processo basal se divide em dois indicados pelas setas brancas e é igualmente herdado pelas células-filhas.

Os quadros selecionados dessa sequência de lapso de tempo mostram que a divisão celular ocorre em zero horas e 49 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como preparar e obter imagens de fatias da medula espinhal. Lembre-se, se você é novo nessa técnica, pode ter dificuldades inicialmente, pois há uma série de etapas tecnicamente desafiadoras que precisam ser unidas para que isso funcione.