De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do comportamento celular dentro do tubo neural embrionário com alta resolução por longos períodos de tempo. Isso é realizado primeiramente seccionando transversalmente o tubo neural inicial com um construto que induz a expressão de uma proteína fluorescente de escolha, para marcar células individuais. O próximo passo é produzir fatias do embrião inicial e montá-las em placas de vidro com fundo de vidro.

Após a recuperação em uma incubadora, as fatias de embrião são analisadas em um microscópio de campo amplo em intervalos regulares. Em última análise, esta técnica pode ser utilizada para estudar o comportamento celular no epitélio neuro em desenvolvimento ao longo de períodos prolongados com alta resolução espacial e temporal. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para o registro de imagens de tecidos vivos é que ela permite observar o comportamento individual das células ao longo de períodos prolongados com alta resolução espacial e temporal.

Este método permite abordar questões fundamentais na área da neurobiologia do desenvolvimento, como o papel da orientação do fuso mitótico na escolha do sulfito, ou como a dinâmica de sinalização pode estar regulando o comportamento celular antes da eletroporação de plasmídeos no tubo neural. Agulhas de vidro são preparadas utilizando um puxador de micropipetas sob um microscópio estereoscópico. Utilize pinças finas para quebrar a ponta da agulha.

A ponta da agulha deve ser afiada o suficiente para perfurar o tubo neural, sem ser tão estreita a ponto de impedir a injeção da solução de DNA. Os X para este experimento foram incubados a 37 graus Celsius por cerca de 36 horas até o estágio de Hamburger-Hamilton 10.

Para iniciar este procedimento, abra uma janela no ovo e posicione eletrodos a cinco milímetros de distância, em ambos os lados do embrião; em seguida, injete DNA no tubo neural. O DNA é corado com uma pequena quantidade de verde rápido para visualização. Aplique uma corrente de 12 a 17 volts com pulso de 50 milissegundos, repetido três vezes, com intervalos de 950 milissegundos entre os pulsos.

Concentrações baixas de DNA e voltagens baixas de eletroporação são utilizadas para obter expressão em mosaico, de modo que células individuais possam ser acompanhadas. Por fim, cubra a janela na casca do ovo com fita adesiva, certificando-se de que esteja vedada. Deixe os embriões se recuperarem por três a quatro horas ou durante a noite a 37 graus Celsius.

A mistura de colágeno e o meio de cultura de fatias devem ser preparados cerca de uma hora antes do corte dos embriões. Para preparar a mistura de colágeno, adicione 100 microlitros de uma solução de ácido acético 0,1% a 300 microlitros de colágeno tipo I e vortexe completamente; em seguida, adicione 100 microlitros do meio L 15 cinco vezes concentrado e vortexe completamente. Novamente, a solução deve ficar amarela.

Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de bicarbonato de sódio a 7,5% e vortexe completamente. A solução deve ficar levemente rosa. Mantenha em gelo.

Essa mistura de colágeno deve ser preparada fresca cada vez. Para preparar o meio de cultura de fatias, adicione ao seguinte meio neurobasal de 10 mililitros, suplemento B27, GlutaMax e solução de gentamicina, coloque o meio em um incubador a 37 graus Celsius, tamponado com 5% de dióxido de carbono. Deixe a tampa do recipiente solta para permitir que equilibre com o dióxido de carbono por pelo menos uma hora.

Para iniciar este procedimento, use um par de tesouras pequenas para recortar o embrião. Remova o embrião do ovo com pinças, lavando-o com meio L 15. Coloque o embrião em uma placa de cultura de tecidos com uma camada de Sylgard no fundo.

Fixe o embrião através das membranas extraembrionárias circundantes de modo que as membranas fiquem esticadas. Usando uma microfaca, corte o embrião o mais reto possível pela região de interesse. Para cortes da medula espinhal, os cortes devem ter entre um e dois somitos de espessura, com os fragmentos aderidos ao tecido lateral do embrião para que não se percam enquanto outros embriões estão sendo seccionados.

É necessário um micro bico personalizado para transferir as fatias de medula espinhal para a placa de fundo de vidro. Para prepará-lo, acople um bico de 200 microlitros a uma pipeta P2 ou P10 e corte aproximadamente um milímetro da extremidade do bico. Revesta o interior do bico com colágeno preparando um microlitro da mistura de colágeno que foi preparada anteriormente.

Deixe por um a dois minutos e depois enxágue com meio L 15. Isso impedirá que o tecido adere ao interior da ponteira. Agora, desprenda uma fatia do embrião usando uma microfaca e remova a fatia do recipiente usando a pipeta P dois ou P 10 equipada com ponteira de 200 microlitros.

Tente utilizar o mínimo possível de meio. Vortexe a mistura de colágeno e coloque de cinco a oito microlitros dela em um recipiente com fundo de vidro revestido com poliol lisina e com uma lamínula como base; imediatamente coloque a fatia embrionária no colágeno e posicione-a com uma pinça fina. As LICs devem ser posicionadas de modo que o lado a ser imageado fique alinhado com a lamínula.

O tecido deve aderir ao revestimento de poliolisina na lamínula. Repita isso até que você tenha várias fatias na lamínula. Geralmente, seis a nove fatias são colocadas em um único recipiente.

Quando todas as fatias estiverem posicionadas, adicione de duas a três microlitros de meio L 15 ao colágeno posicionado mais anteriormente e cubra a placa. Deixe o colágeno solidificar por 20 minutos. Uma vez que o colágeno tenha solidificado, adicione cuidadosamente dois mililitros de meio de cultura de fatias que tenha sido equilibrado por pelo menos uma hora em 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius.

Deve-se ter cuidado para não deslocar o colágeno do lamínula; coloque em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e deixe as fatias se recuperarem por pelo menos três horas antes da aquisição de imagens. A obtenção de imagens do comportamento celular em tecidos por longos períodos, com alta resolução temporal e espacial, é desafiadora. Uma combinação de condições ideais de cultivo e o uso de microscopia de campo claro são essenciais para obter bons resultados.

Um microscópio de campo amplo Delta Vision Core equipado com uma câmara ambiental de estação meteorológica é utilizado para imagens dos cortes. A câmara é mantida constantemente a 37 graus Celsius com um aparato de perfusão de dióxido de carbono para manter a platina do microscópio a 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. As imagens normalmente são obtidas usando uma objetiva de imersão em óleo de 40 vezes e abertura numérica 1,30, e as imagens são capturadas com uma câmera CCD Core Snap HQ2. As seções Z são capturadas a cada 1,5 mícrons ao longo de 45 mícrons de tecido. O tempo de exposição deve ser mantido tão baixo quanto possível, por exemplo, entre cinco e 50 milissegundos.

Para cada seção mencionada, imagens são capturadas a cada sete minutos. Até nove cortes podem ser visitados utilizando os sistemas Delta Vision. A função de visita a pontos precisos mostrada aqui é um exemplo de sequência de lapso de tempo de uma célula progenitora da medula espinhal transfectada com um construto que expressa GFP alfa Tubulina; o registro de imagens foi iniciado em um corte da medula espinhal de um embrião de dois dias com estágio HH 12.

Nesta fase inicial, as células progenitoras neurais realizam predominantemente divisões no modo progenitor-progenitor, nas quais as células se dividem para gerar duas outras células progenitoras em ciclo. Esta figura mostra quadros selecionados da sequência de lapso de tempo recém-apresentada. Após duas horas e 20 minutos, a célula se divide com um plano de clivagem perpendicular à superfície apical, gerando duas células-filhas.

Essas duas células se dividem novamente às 24 horas e 23 minutos e às 25 horas e 54 minutos. Esta próxima sequência de microscopia de tempo real é de uma célula transfectada com G-F-P-G-P-I, marcando a membrana celular. Esta célula sofre uma divisão na qual o processo basal se divide em dois, indicado pelas setas brancas, e é igualmente herdado pelas células-filhas.

Quadros selecionados desta sequência de lapso de tempo mostram que a divisão celular ocorre em zero hora e 49 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como preparar e obter imagens de fatias da medula espinhal. Lembre-se, se você for novo nesta técnica, pode ter dificuldades inicialmente, pois há várias etapas tecnicamente desafiadoras que precisam ser executadas corretamente para que isso funcione.