Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura
10 de fevereiro de 2022
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.
No meu laboratório, desenvolvemos sistemas de produção para vetores virais e partículas semelhantes a vírus, ou vacinas baseadas em VLP. O ensaio de captura VLP permite a detecção muito sensível de antígenos de destino exibidos em VLPs. Neste ensaio, usamos anticorpos amplamente neutralizantes direcionados contra epítopos de neutralização para provar a exposição desses epítopos na superfície VLP.
Esta é uma importante avaliação de qualidade para os candidatos à vacina, pois apenas os VLPs que exibem epítopos sensíveis à neutralização poderão obter uma resposta neutralizante de anticorpos nas vacinas. Comece suspendendo as contas magnéticas, tubulando para cima e para baixo, ou misturando-se em um rotador a 50 RPM por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpos contendo os bNABs.
Use 10 microgramas de cada bNAB em 200 microliters de ligação de anticorpos e tampão de lavagem por reação. Para cada reação, transfira 50 microliters da solução de contas magnéticas para um tubo de reação de 1,5 mililitro e, em seguida, coloque os tubos no rack de separação magnética. Aguarde até que as contas se reúnam na bola do tubo para garantir que todas as contas sejam coletadas e, em seguida, remova o sobrenatante.
Remova o ímã e suspenda as contas em 200 microliters da solução bNAB previamente preparada. Incubar por 30 minutos a três horas enquanto mistura em uma rotadora a 50 RPM à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque os tubos de reação no rack de separação magnética, espere e remova o sobrenatário.
Remova os tubos do ímã e lave as contas suspendendo em 200 microlitres de ligação de anticorpos e tampão de lavagem. Repita a lavagem com a ligação de anticorpos e o tampão de lavagem, removendo o máximo possível de tampão de lavagem quando terminar. Adicione as amostras aos bNABs ligados a contas.
Se o volume de amostra adicionado estiver abaixo de um mililitro, adicione PBS para ajustar o volume da amostra a um mililitro e, em seguida, suspenda novamente as contas por pipetação suave. Incubar as amostras e as contas por 2,5 horas em uma rotadora à temperatura ambiente, garantindo que as contas permaneçam em suspensão e a solução seja completamente misturada durante a incubação. Coloque os tubos sobre o ímã e remova o sobrenante, depois lave as contas magnéticas suspendendo-as em 200 microliters de tampão de lavagem.
Suspenda as contas em 100 microliters de tampão de lavagem e transfira a suspensão para um tubo de reação limpo e resistente ao calor. Coloque o tubo no rack de separação magnética e remova completamente o sobrenatário. Para preparar amostras desnaturadas stS-PAGE, suspenda as contas em 20 a 80 microliters de tampão Laemmli e incubar a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Prossiga diretamente com o SDS-PAGE, colocando os tubos em um rack magnético para separar as contas da solução. Alternativamente, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Um resultado representativo de VLPs primeiramente capturados a partir de cultura celular livre de células supernaciantes e pelotas VLP usando bNABs, e posteriormente submetidos à análise de manchas ocidentais para detectar proteínas do núcleo viral, é mostrado aqui.
As contas utilizadas para o ensaio de captura foram revestidas com três bNABs diferentes direcionados contra epítopos de neutralização das glicoproteínas envelope e anticorpos isótipos que servem como controles negativos. Usando contas revestidas de anticorpos de isótopos, nenhuma proteína gag foi detectável em amostras de VLP contendo VLPs carecas, ou seja, VLPs Env-negativos, ou VLPs de exibição de Env, demonstrando que a vinculação inespecífica de VLPs a contas revestidas com anticorpos humanos não mediava a captura de VLP. As VLPs carecas também não foram vinculadas por contas revestidas de bNABs e, consequentemente, nenhuma proteína gag foi detectável na análise de manchas ocidentais.
Em contraste, todos os três bNABs capturaram VLPs exibindo proteínas Env, portanto, proteínas Gag foram prontamente detectadas, demonstrando a presença de epítopos de neutralização nas Env-glicoproteínas exibidas em VLPs. Crucial para o sucesso do ensaio: uma mistura completa de VLPs com contas revestidas de anticorpos. Isso é melhor alcançado usando volumes maiores que 500 microliters em rotação.
Alternativamente, os VLPs capturados podem ser elucidos em condições não redutoras. Isso permite a análise de VLPs que empregam microscopia imuno-elétron, ou a investigação dos antígenos exibidos usando PAGE nativo.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus (VLPs) utilizando um ensaio de captura. O método emprega anticorpos amplamente neutralizantes (bNABs) para avaliar a exposição desses epítopos, o que é crucial para a avaliação de candidatos a vacinas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Imunologia
- Desenvolvimento de Vacinas
- Virologia
Contexto
- Partículas semelhantes a vírus (VLPs) são importantes para o desenvolvimento de vacinas.
- Epitopos de neutralização são fundamentais para induzir uma resposta imune.
- Anticorpos amplamente neutralizantes podem ser utilizados para detectar esses epitopos.
- A avaliação da qualidade das VLPs é essencial para candidatos eficazes a vacinas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio sensível para detectar epítopos de neutralização em VLPs.
- Demonstrar a importância desses epítopos na eficácia vacinal.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Imunoprecipitação de VLPs derivados do HIV usando bNABs.
- Uso de esferas magnéticas conjugadas com proteína G para captura de VLPs.
- Análise por SDS-PAGE e Western blot para detecção de proteínas do núcleo viral.
- Mistura completa de VLPs com esferas revestidas com anticorpos para captura eficaz.
Principais Resultados
- VLPs que exibem proteínas Env foram capturados com sucesso utilizando bNABs.
- Nenhuma proteína Gag foi detectada em VLPs negativos para Env, confirmando a especificidade.
- As três bNABs demonstraram ligação eficaz a VLPs sensíveis à neutralização.
- O sucesso do ensaio depende das condições adequadas de mistura e incubação.
Conclusões
- O ensaio fornece um método confiável para avaliar a qualidade das partículas virais pseudotipadas (VLP).
- Os epítopos de neutralização são essenciais para induzir uma resposta imune.
- Este protocolo pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas eficazes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O ensaio de captura de partículas tipo vírus (VLP) fornece um método sensível para avaliar a qualidade de candidatos a vacinas, confirmando a presença de epítopos sensíveis à neutralização em partículas tipo vírus que exibem antígenos. Isso permite a predição precoce do potencial de resposta de células B neutralizantes, apoiando decisões de continuidade ou interrupção no desenvolvimento de vacinas. O ensaio reduz o risco biológico ao validar a integridade estrutural das glicoproteínas de envelope antes do avanço dispendioso para fases pré-clínicas e clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Confirma a exposição de epítopos sensíveis à neutralização nas superfícies de VLPs, permitindo a investigação de hipóteses terapêuticas sobre a imunogenicidade da vacina.
- Valor Operacional: Utiliza anticorpos amplamente neutralizantes como sondas funcionais para reduzir os riscos na validação do alvo por meio de evidências de ligação específica a epítopos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Permite a preparação de VLPs que exibem antígenos para ensaios imunológicos subsequentes, isolando partículas com integridade estrutural preservada.
- Valor Operacional: Oferece detecção quantitativa de proteínas do núcleo viral (por exemplo, Gag) por meio de Western blot, apoiando a padronização e reprodutibilidade do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a continuidade da produção de partículas tipo vírus à relevância imunológica, associando a exposição de epítopos às respostas preditas de anticorpos neutralizantes em humanos.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco, identificando partículas tipo vírus capazes de induzir imunidade protetora antes de estudos de desafio em animais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na sequência de descoberta a pré-clínico, posicionando a caracterização de partículas virais pseudotipadas pós-produção antes dos testes de imunogenicidade, a fim de orientar a seleção do candidato líder.
- Biologia de Descoberta: Valida que as partículas virais tipo vírus (VLPs) exibem antígenos cognatos em conformação nativa, apoiando a redução de riscos biológicos de construtos vacinais.
- Triagem: Confirma a prontidão do ensaio por meio da captura específica de VLPs positivos para Env e ausência de sinal em controles negativos para Env.
- Analítica: Gera resultados de Western blot para proteínas Gag como uma medida quantitativa indireta do rendimento e integridade das VLPs capturadas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a qualidade biofísica das VLPs ao valor preditivo imunológico, confirmando a exposição de epítopos sensíveis à neutralização.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma plataforma de controle de qualidade reutilizável para candidatos a vacinas baseados em VLPs, abrangendo múltiplos alvos antigênicos e sorotipos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na eficácia da vacina por meio da avaliação direta da exposição de epítopos neutralizantes.
- Valor Operacional: Etapas padronizadas de captura e lavagem utilizando esferas magnéticas garantem reprodutibilidade entre laboratórios e lotes de produção.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar ao filtrar VLPs que carecem de epítopos funcionais, reduzindo o risco de falhas biológicas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de candidatos a VLP com base em métricas de qualidade estrutural e funcional.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imunoprecipitação, manipulação de anticorpos e técnicas de separação baseadas em microesferas magnéticas.
- Depende do acesso a microesferas magnéticas conjugadas com proteína A/G, anticorpos amplamente neutralizantes e equipamentos para Western blot.
- Necessita padronização dos volumes de mistura entre microesferas e VLPs (>500 µL) e das condições de rotação para garantir captação eficiente.
- Envolve considerações de adaptação para VLPs não derivados de HIV, incluindo seleção de anticorpos e otimização de tampão para diferentes alvos antigênicos.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de bNAbs com alto título e a possibilidade de impedimento estérico em arranjos densos de VLPs.
