Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

No meu laboratório, desenvolvemos sistemas de produção para vetores virais e partículas semelhantes a vírus, ou vacinas baseadas em VLP. O ensaio de captura VLP permite a detecção muito sensível de antígenos de destino exibidos em VLPs. Neste ensaio, usamos anticorpos amplamente neutralizantes direcionados contra epítopos de neutralização para provar a exposição desses epítopos na superfície VLP.

Esta é uma importante avaliação de qualidade para os candidatos à vacina, pois apenas os VLPs que exibem epítopos sensíveis à neutralização poderão obter uma resposta neutralizante de anticorpos nas vacinas. Comece suspendendo as contas magnéticas, tubulando para cima e para baixo, ou misturando-se em um rotador a 50 RPM por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpos contendo os bNABs.

Use 10 microgramas de cada bNAB em 200 microliters de ligação de anticorpos e tampão de lavagem por reação. Para cada reação, transfira 50 microliters da solução de contas magnéticas para um tubo de reação de 1,5 mililitro e, em seguida, coloque os tubos no rack de separação magnética. Aguarde até que as contas se reúnam na bola do tubo para garantir que todas as contas sejam coletadas e, em seguida, remova o sobrenatante.

Remova o ímã e suspenda as contas em 200 microliters da solução bNAB previamente preparada. Incubar por 30 minutos a três horas enquanto mistura em uma rotadora a 50 RPM à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque os tubos de reação no rack de separação magnética, espere e remova o sobrenatário.

Remova os tubos do ímã e lave as contas suspendendo em 200 microlitres de ligação de anticorpos e tampão de lavagem. Repita a lavagem com a ligação de anticorpos e o tampão de lavagem, removendo o máximo possível de tampão de lavagem quando terminar. Adicione as amostras aos bNABs ligados a contas.

Se o volume de amostra adicionado estiver abaixo de um mililitro, adicione PBS para ajustar o volume da amostra a um mililitro e, em seguida, suspenda novamente as contas por pipetação suave. Incubar as amostras e as contas por 2,5 horas em uma rotadora à temperatura ambiente, garantindo que as contas permaneçam em suspensão e a solução seja completamente misturada durante a incubação. Coloque os tubos sobre o ímã e remova o sobrenante, depois lave as contas magnéticas suspendendo-as em 200 microliters de tampão de lavagem.

Suspenda as contas em 100 microliters de tampão de lavagem e transfira a suspensão para um tubo de reação limpo e resistente ao calor. Coloque o tubo no rack de separação magnética e remova completamente o sobrenatário. Para preparar amostras desnaturadas stS-PAGE, suspenda as contas em 20 a 80 microliters de tampão Laemmli e incubar a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Prossiga diretamente com o SDS-PAGE, colocando os tubos em um rack magnético para separar as contas da solução. Alternativamente, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Um resultado representativo de VLPs primeiramente capturados a partir de cultura celular livre de células supernaciantes e pelotas VLP usando bNABs, e posteriormente submetidos à análise de manchas ocidentais para detectar proteínas do núcleo viral, é mostrado aqui.

As contas utilizadas para o ensaio de captura foram revestidas com três bNABs diferentes direcionados contra epítopos de neutralização das glicoproteínas envelope e anticorpos isótipos que servem como controles negativos. Usando contas revestidas de anticorpos de isótopos, nenhuma proteína gag foi detectável em amostras de VLP contendo VLPs carecas, ou seja, VLPs Env-negativos, ou VLPs de exibição de Env, demonstrando que a vinculação inespecífica de VLPs a contas revestidas com anticorpos humanos não mediava a captura de VLP. As VLPs carecas também não foram vinculadas por contas revestidas de bNABs e, consequentemente, nenhuma proteína gag foi detectável na análise de manchas ocidentais.

Em contraste, todos os três bNABs capturaram VLPs exibindo proteínas Env, portanto, proteínas Gag foram prontamente detectadas, demonstrando a presença de epítopos de neutralização nas Env-glicoproteínas exibidas em VLPs. Crucial para o sucesso do ensaio: uma mistura completa de VLPs com contas revestidas de anticorpos. Isso é melhor alcançado usando volumes maiores que 500 microliters em rotação.

Alternativamente, os VLPs capturados podem ser elucidos em condições não redutoras. Isso permite a análise de VLPs que empregam microscopia imuno-elétron, ou a investigação dos antígenos exibidos usando PAGE nativo.