Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura
February 10th, 2022
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.
No meu laboratório, desenvolvemos sistemas de produção para vetores virais e partículas semelhantes a vírus, ou vacinas baseadas em VLP. O ensaio de captura VLP permite a detecção muito sensível de antígenos de destino exibidos em VLPs. Neste ensaio, usamos anticorpos amplamente neutralizantes direcionados contra epítopos de neutralização para provar a exposição desses epítopos na superfície VLP.
Esta é uma importante avaliação de qualidade para os candidatos à vacina, pois apenas os VLPs que exibem epítopos sensíveis à neutralização poderão obter uma resposta neutralizante de anticorpos nas vacinas. Comece suspendendo as contas magnéticas, tubulando para cima e para baixo, ou misturando-se em um rotador a 50 RPM por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpos contendo os bNABs.
Use 10 microgramas de cada bNAB em 200 microliters de ligação de anticorpos e tampão de lavagem por reação. Para cada reação, transfira 50 microliters da solução de contas magnéticas para um tubo de reação de 1,5 mililitro e, em seguida, coloque os tubos no rack de separação magnética. Aguarde até que as contas se reúnam na bola do tubo para garantir que todas as contas sejam coletadas e, em seguida, remova o sobrenatante.
Remova o ímã e suspenda as contas em 200 microliters da solução bNAB previamente preparada. Incubar por 30 minutos a três horas enquanto mistura em uma rotadora a 50 RPM à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque os tubos de reação no rack de separação magnética, espere e remova o sobrenatário.
Remova os tubos do ímã e lave as contas suspendendo em 200 microlitres de ligação de anticorpos e tampão de lavagem. Repita a lavagem com a ligação de anticorpos e o tampão de lavagem, removendo o máximo possível de tampão de lavagem quando terminar. Adicione as amostras aos bNABs ligados a contas.
Se o volume de amostra adicionado estiver abaixo de um mililitro, adicione PBS para ajustar o volume da amostra a um mililitro e, em seguida, suspenda novamente as contas por pipetação suave. Incubar as amostras e as contas por 2,5 horas em uma rotadora à temperatura ambiente, garantindo que as contas permaneçam em suspensão e a solução seja completamente misturada durante a incubação. Coloque os tubos sobre o ímã e remova o sobrenante, depois lave as contas magnéticas suspendendo-as em 200 microliters de tampão de lavagem.
Suspenda as contas em 100 microliters de tampão de lavagem e transfira a suspensão para um tubo de reação limpo e resistente ao calor. Coloque o tubo no rack de separação magnética e remova completamente o sobrenatário. Para preparar amostras desnaturadas stS-PAGE, suspenda as contas em 20 a 80 microliters de tampão Laemmli e incubar a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Prossiga diretamente com o SDS-PAGE, colocando os tubos em um rack magnético para separar as contas da solução. Alternativamente, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Um resultado representativo de VLPs primeiramente capturados a partir de cultura celular livre de células supernaciantes e pelotas VLP usando bNABs, e posteriormente submetidos à análise de manchas ocidentais para detectar proteínas do núcleo viral, é mostrado aqui.
As contas utilizadas para o ensaio de captura foram revestidas com três bNABs diferentes direcionados contra epítopos de neutralização das glicoproteínas envelope e anticorpos isótipos que servem como controles negativos. Usando contas revestidas de anticorpos de isótopos, nenhuma proteína gag foi detectável em amostras de VLP contendo VLPs carecas, ou seja, VLPs Env-negativos, ou VLPs de exibição de Env, demonstrando que a vinculação inespecífica de VLPs a contas revestidas com anticorpos humanos não mediava a captura de VLP. As VLPs carecas também não foram vinculadas por contas revestidas de bNABs e, consequentemente, nenhuma proteína gag foi detectável na análise de manchas ocidentais.
Em contraste, todos os três bNABs capturaram VLPs exibindo proteínas Env, portanto, proteínas Gag foram prontamente detectadas, demonstrando a presença de epítopos de neutralização nas Env-glicoproteínas exibidas em VLPs. Crucial para o sucesso do ensaio: uma mistura completa de VLPs com contas revestidas de anticorpos. Isso é melhor alcançado usando volumes maiores que 500 microliters em rotação.
Alternativamente, os VLPs capturados podem ser elucidos em condições não redutoras. Isso permite a análise de VLPs que empregam microscopia imuno-elétron, ou a investigação dos antígenos exibidos usando PAGE nativo.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus (PSVs) usando um ensaio de captura. O método emprega anticorpos amplamente neutralizantes (bNABs) para avaliar a exposição desses epítopos, o que é crucial para avaliar candidatos a vacinas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Desenvolvimento de Vacinas
- Virologia
Fundo
- Partículas semelhantes a vírus (PSVs) são importantes para o desenvolvimento de vacinas.
- Epítopos de neutralização são críticos para provocar uma resposta imune.
- Anticorpos amplamente neutralizantes podem ser usados para detectar esses epítopos.
- Avaliação da qualidade de PSVs é essencial para candidatos a vacinas eficazes.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um ensaio sensível para detectar epítopos de neutralização em PSVs.
- Demonstrar a importância desses epítopos na eficácia da vacina.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores no campo.
Métodos Utilizados
- Imunoprecipitação de PSVs derivadas do HIV usando bNABs.
- Uso de contas magnéticas conjugadas com proteína G para captura de PSVs.
- SDS-PAGE e análise de Western blot para detectar proteínas do núcleo viral.
- Mistura completa de PSVs com contas revestidas de anticorpos para captura eficaz.
Principais Resultados
- PSVs exibindo proteínas Env foram capturadas com sucesso usando bNABs.
- Nenhuma proteína Gag foi detectada em PSVs negativas para Env, confirmando a especificidade.
- Todos os três bNABs demonstraram ligação eficaz a PSVs sensíveis à neutralização.
- O sucesso do ensaio depende de condições adequadas de mistura e incubação.
Conclusões
- O ensaio fornece um método confiável para avaliar a qualidade das PSVs.
- Epítopos de neutralização são essenciais para induzir uma resposta imune.
- Este protocolo pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas eficazes.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The VLP capture assay provides a sensitive method to evaluate vaccine candidate quality by confirming the presence of neutralization-sensitive epitopes on antigen-displaying virus-like particles. This enables early prediction of neutralizing B-cell response potential, supporting go/no-go decisions in vaccine development pipelines. The assay reduces biological risk by validating structural integrity of envelope glycoproteins prior to costly preclinical and clinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms exposure of neutralization-sensitive epitopes on VLP surfaces, enabling therapeutic hypothesis interrogation of vaccine immunogenicity.
- Operational Value: Uses broadly neutralizing antibodies as functional probes to de-risk target validation through epitope-specific binding evidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of antigen-displaying VLPs for downstream immunoassays by isolating particles with preserved structural integrity.
- Operational Value: Delivers quantitative detection of viral core proteins (e.g., Gag) via Western blot, supporting assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from VLP production to immune relevance by linking epitope exposure to predicted neutralizing antibody responses in humans.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying VLPs capable of eliciting protective immunity before animal challenge studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, positioning post-production VLP characterization before immunogenicity testing to inform lead candidate selection.
- Discovery Biology: Validates that VLPs display cognate antigens in native conformation, supporting biological de-risking of vaccine constructs.
- Screening: Confirms assay readiness through specific capture of Env-positive VLPs and absence of signal in Env-negative controls.
- Analytics: Generates Western blot readouts of Gag proteins as a quantitative proxy for captured VLP yield and integrity.
- Translational Research: Connects biophysical VLP quality to immunological predictive value by confirming exposure of neutralization-sensitive epitopes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC platform for VLP-based vaccine candidates across multiple antigen targets and serotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vaccine efficacy through direct assessment of neutralizing epitope exposure.
- Operational Value: Standardized capture and wash steps using magnetic beads ensure reproducibility across laboratories and production batches.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by filtering VLPs lacking functional epitopes, reducing late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of VLP candidates based on structural and functional quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, antibody handling, and magnetic bead-based separation techniques.
- Depends on access to protein A/G-conjugated magnetic beads, broadly neutralizing antibodies, and Western blot instrumentation.
- Necessitates standardization of bead-VLP mixing volumes (>500 µL) and rotation conditions to ensure efficient capture.
- Involves adaptation considerations for non-HIV VLPs, including antibody selection and buffer optimization for different antigen targets.
- Includes practical limitations such as the need for high-titer bNAbs and potential steric hindrance in densely packed VLP arrays.
