Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Para a reticulação, seguida de imunoprecipitação. As células de procedimento com densidade de 80 a 90% são incubadas com um milimolar gelado frio. DSP apenas em PBS, cálcio, magnésio ou DMSO.

Controle do veículo. DSP é um reticulador homo bifuncional permeável à membrana e redutível que reticula livremente e significa dentro de 12 angstroms um do outro. Em seguida, as células de reticulação são lisadas e as imunoprecipitações são realizadas usando controles padrão.

Os complexos proteicos são então resolvidos reduzindo a página SDS, reduzindo a DSP clivada dos agentes, permitindo a identificação de proteínas individuais por immunoblot. Olá, sou Stephanie Ick, do laboratório do Dr. Victor Fonde no Departamento de Biologia Celular da Universidade Emory. E eu sou Pearl Ryder, também do laboratório Fonde.

Hoje mostraremos um procedimento para o isolamento de complexos de myprotein usando reticulação controlada seguida de cromatografia de afinidade imunomagnética. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar interações transitórias de proteínas lábeis. Então vamos começar.

Comece rotulando a parte inferior das placas celulares para indicar o tipo de célula e a condição experimental específica. Um símbolo positivo aqui indica que o DSP tratado inclui um controle negativo do veículo apenas DMSO. Adicione mídia às placas para prepará-las para a placa de semeadura de células.

Células HEK semeadas em uma diluição de um a cinco para permitir o isolamento de 500 microgramas de proteína por reação de tubo padrão. Um único tubo pode ser suficiente para identificar os supostos parceiros de ligação de uma proteína de interesse por immunoblot a partir da análise de espectrometria de massa. Aumente o número de reações padrão pelo menos 10 vezes.

Prepare também caules da maioria das soluções usadas no experimento de reticulação. Estes incluem PBS suplementado com cloreto de cálcio 0,1 milimolar e um cloreto de magnésio milimolar denominado PBS cálcio magnésio. A adição de íons cálcio e magnésio é fundamental para a adesão das células à placa de cultura.

Durante o curso do experimento, armazene a solução a quatro graus Celsius. Outros estoques incluem solução de têmpera de reticulador 50 X coquetel inibidor de protease completo, que é um vórtice a cada 20 minutos até que o pellet seja dissolvido. 20% Tritan X 100, que é armazenado a quatro graus Celsius e deve ser usado dentro de um mês e 10 x e um x Buffer a soluções.

Prepare e armazene todas as soluções conforme detalhado no protocolo escrito que acompanha. Por fim, prepare o tampão de lise composto por um tampão X. Um mais 0,5% TRITTON X 100 e tampão de precipitação imunomagnética ou tampão IP composto por um tampão X.

A mais 0,1% TRITTON X 101 a dois dias após o revestimento, as células têm fluência de 80 a 90% co, o que é ideal para reticulação. Em condições de alta cofluência, as células tendem a se empilhar, levando a uma diminuição na acessibilidade do reticulador permeável celular a todas as células. Coloque as placas de volta na incubadora até que estejam prontas para a reticulação.

Prepare a solução DSP Crosslinker imediatamente antes de aplicar nas células. O DSP é altamente hidrofóbico e, portanto, é dissolvido em DMSO a uma concentração de 100 milimolares antes de se diluir no tampão de cálcio e magnésio PBS. Para aumentar ainda mais a diluição do DSP no tampão de cálcio e magnésio PBS, volume quente e apropriado, adicione 10 microlitros da solução estoque de DSP e DMSO.

Para cada mililitro de cálcio e magnésio PBS quente, adicione a solução estoque D-S-P-D-M-S-O gota a gota com mistura repetida até que todo o DSP tenha se dissolvido. Além disso, prepare uma solução de controle de veículo de 10 microlitros de DMSO para cada mililitro de cálcio e magnésio PBS. Depois de diluir o DSP, mantenha todas as soluções de cálcio e magnésio PBS em banho-maria gelada por no máximo 10 minutos.

Em seguida, prepare um banho de água gelada que conterá todas as placas usadas no experimento. Prossiga para retirar as placas de cultura contendo as células da incubadora de 37 graus Celsius e coloque-as imediatamente no banho de água gelada. Lave as células duas vezes com cálcio magnésio PBS gelado, usando os mesmos volumes preparados anteriormente para a incubação com o reticulador para seis, placa de poço calcular dois mililitros por poço e assim por diante.

Após a segunda lavagem. Adicione o controle do veículo, que é o DMSO dissolvido no tampão ou a solução tampão de reticulação DSP às células, incube no gelo por duas horas e verifique aproximadamente a cada 20 minutos para garantir que todas as células estejam cobertas pela solução. Se algumas células ficarem expostas, incline e gire o prato para cobri-las uniformemente novamente, é normal que uma pequena quantidade de DSP precipite.

Durante as duas horas de incubação com as células antes do término das duas horas de incubação, prepare uma solução de têmpera XDSP diluindo o caule em PBS cálcio magnésio. Mantenha a solução no gelo até usá-la para interromper a reação de reticulação, inativando o DSP que não reagiu. Quando as duas horas terminarem, remova as soluções de controle do veículo e reticulação das células.

Adicione a solução de têmpera DSP gelada e incube no gelo por 15 minutos. Enquanto isso, dilua o estoque completo do coquetel de inibidores de protease de um a 50 no tampão de lise celular. Quando os 15 minutos terminarem, lave as células duas vezes com PBS cálcio magnésio.

Em seguida, adicione o tampão de lise contendo os inibidores de protease às células e balance a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos de lise celular, use um raspador de células para coletar as células da placa. Certifique-se de manter os lisados no gelo para minimizar a atividade da protease.

Girar os lisados celulares durante 15 minutos a quatro graus Celsius numa minicentrífuga de bancada a uma velocidade máxima de 15 000 Gs. Analise os níveis de proteína usando o ensaio de Bradford e prossiga com a imunoprecipitação. Comece a se preparar para a imunoprecipitação imediatamente após iniciar a reação de reticulação de duas horas em tubos de microcentrífuga com tampa de rosca.

Combine 30 microlitros de esferas imunomagnéticas anti IgG com 500 microlitros de tampão IP. Adicione o anticorpo contra o alvo de interesse. Deve ser determinada a quantidade adequada de anticorpos para cada antigénio individual.

Em experimentos preliminares, possíveis controles negativos para os grânulos não incluem anticorpos, grânulos e grânulos de anticorpo de controle de isotipo para ligar o anticorpo IP aos grânulos magnéticos. Incube em um balancim final por duas horas em temperatura ambiente No final da incubação, gire rapidamente os tubos e deslize-os para dentro do suporte magnético. As contas se concentrarão na lateral do ímã.

Remova a solução contendo anticorpos não ligados e lave imediatamente as esferas para evitar que sequem. Após duas lavagens, adicione 500 microlitros de um micrograma por mililitro de lisado de células DSP negativo ou DSP positivo aos tubos apropriados. Um controle negativo de competição peptídica pode ser preparado nesta fase adicionando o peptídeo imunogênico em uma concentração determinada em experimentos preliminares à mistura de grânulos de lisado.

Outro possível controle negativo preparado nesta fase é uma reação apenas de tampão ou livre de lisado preparada adicionando 500 microlitros de tampão de lise apenas aos grânulos. Ressuspenda suavemente os grânulos para as reações experimentais e de controle. Não faça vórtices, pois isso fará com que as contas se quebrem incubem a quatro graus com rotação de ponta a ponta por duas horas.

Ao final de duas horas, remova o lisado usando o suporte magnético. Gire rapidamente e lave as contas por um total de seis vezes com um mililitro de buffer IP. Incubando cada lavagem a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Para evitar os complexos ligados, adicione um x tampão de amostra de gel ao tubo IP logo acima do pellet de grânulo. Para agrupar as esferas na parte inferior do tubo, bata suavemente na parte inferior do tubo para que todas as esferas sejam ressuspensas no tampão de amostra de gel. Alternativamente, para isolamento de imunoafinidade a 30 microlitros de tampão a suplementado com o peptídeo imunogênico para os grânulos.

A concentração necessária do peptídeo imunogênico é determinada empiricamente. Depois de testar uma faixa de 10 a 200 micromolares, incube as esferas a quatro graus por duas horas, bata nos tubos a cada 30 minutos. Use o suporte magnético para remover os 30 microlitros que contêm os complexos iludidos e salve em uma lavagem de tubo limpa com tampão IP e salve as contas.

Adicione um x tampão de amostra de gel aos grânulos para ambos os métodos de eluição. Aqueça as esferas imunomagnéticas ressuspensas em tampão de amostra de gel a 75 graus Celsius por cinco minutos, além de desnaturar as proteínas. Esta etapa também cleve a molécula DSP, permitindo a resolução das proteínas individuais na execução complexa.

As amostras em um gel de página SDS para western blotting. Os grânulos imunomagnéticos esvaziados podem ser repelidos por centrifugação e removidos da amostra com um suporte magnético antes do carregamento. Se a imunoafinidade EUA estiver livre de IgG tanto por coloração proteica da página SDS quanto por immunoblots, ela é adequada para espectrometria de massa.

Aqui está um exemplo de um western blot de material de lisado de células reticuladas e não reticuladas, seguido de precipitação imunomagnética usando um anticorpo monoclonal contra a subunidade AP três. A reticulação delta permite a detecção de proteínas interativas não vistas em amostras não reticuladas durante isolamentos imunomagnéticos. Os controles negativos não mostraram nenhuma redução de proteína específica usando controle livre de anticorpos e com isotipo de anticorpos usando um IgG direcionado contra o receptor de transferrina para amostras não reticuladas e reticuladas.

Neste exemplo, a eluição de peptídeos de afinidade foi usada para recuperar as proteínas ligadas ao anticorpo IP. Observe que o imunocorpo está ausente na fração supernat e permanece na fração de batimento durante a eluição do peptídeo. Acabamos de mostrar como isolar complexos MultiPro lábeis usando o reticulador químico DSP, seguido de purificação de afinidade imunomagnética.

Ao fazer este procedimento, é importante manter as soluções celulares e os lisados resfriados para manter as interações lábeis durante a reticulação e minimizar a atividade da protease. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.