Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Para a reticulação, seguida por imunoprecipitação. Células em procedimento com densidade de 80 a 90% são incubadas com DSP gelado de um milimolar em PBS, cálcio, magnésio ou DMSO apenas.

Controle com veículo. O DSP é um crosslinker homobifuncional, permeável à membrana e redutível, que liga covalentemente grupos livres localizados a até 12 angstroms um do outro. Após o crosslinking, as células são lisadas e são realizadas imunoprecipitações utilizando controles padrão.

Os complexos proteicos são então separados por eletroforese SDS-PAGE em condições redutoras, na qual o DSP clivado por agentes redutores permite a identificação de proteínas individuais por imunoblot. Olá, sou Stephanie Ick do laboratório do Dr. Victor Fonde, do Departamento de Biologia Celular da Universidade Emory. E eu sou Pearl Ryder, também do laboratório Fonde.

Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de complexos de myprotein utilizando reticulação controlada seguida por cromatografia de afinidade imunomagnética. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar interações proteicas transitórias e lábeis. Então, vamos começar.

Comece rotulando a parte inferior das placas de células para indicar o tipo celular e a condição experimental específica. Um sinal positivo aqui indica que o tratamento com DSP inclui um controle negativo com veículo apenas DMSO. Adicione meio às placas para prepará-las para o plaqueamento celular.

Células HEK semeadas em uma diluição de um para cinco para permitir o isolamento de 500 microgramas de proteína por reação padrão em tubo. Um único tubo pode ser suficiente para identificar os possíveis parceiros de ligação de uma proteína de interesse por imunoblot a partir da análise de espectrometria de massas. Aumente o número de reações padrão pelo menos dez vezes.

Prepare também soluções estoque da maioria das soluções utilizadas no experimento de reticulação. Estas incluem PBS suplementado com cloreto de cálcio 0,1 milimolar e cloreto de magnésio 1 milimolar, denominado PBS cálcio-magnésio. A adição de íons cálcio e magnésio é essencial para a adesão das células à placa de cultura.

Durante o experimento, armazene a solução a quatro graus Celsius. Outros estoques incluem solução de inativação do reticulante 50 X coquetel completo de inibidores de protease, que deve ser vortexado a cada 20 minutos até que o precipitado seja dissolvido. Triton X 100 a 20%, que é armazenado a quatro graus Celsius e deve ser usado dentro de um mês, e soluções tampão A 10 X e 1 X.

Prepare e armazene todas as soluções conforme detalhado no protocolo escrito acompanhante. Por fim, prepare o tampão de lise composto por tampão 1 X A mais 0,5% TRITTON X 100 e tampão de precipitação imunomagnética ou tampão IP composto por tampão 1 X.

Adicione 0,1% de TRITON X-101 dois dias após o plaqueamento, quando as células apresentarem 80 a 90% de confluência, o que é ideal para o reticulamento. Em condições de alta confluência, as células tendem a se sobrepor, reduzindo a acessibilidade do reticulador permeável às células. Devolva as placas ao incubador até o momento do reticulamento.

Prepare a solução de crosslinker DSP imediatamente antes de aplicá-la às células. O DSP é altamente hidrofóbico e, portanto, é dissolvido em DMSO até uma concentração de 100 milimolares antes de ser diluído no tampão PBS com cálcio e magnésio. Para melhorar ainda mais a diluição do DSP no tampão PBS com cálcio e magnésio, aqueça um volume apropriado e adicione 10 microlitros da solução estoque de DSP em DMSO.

Para cada mililitro de PBS morno com cálcio e magnésio, adicione a solução estoque de D-S-P-D-M-S-O gota a gota com mistura repetida até que todo o DSP tenha se dissolvido. Além disso, prepare uma solução controle veículo contendo 10 microlitros de DMSO para cada mililitro de PBS com cálcio e magnésio. Após a diluição do DSP, mantenha todas as soluções de PBS com cálcio e magnésio em banho de gelo por não mais de 10 minutos.

Em seguida, prepare um banho de água com gelo capaz de acomodar todas as placas utilizadas no experimento. Retire então as placas de cultura contendo as células da incubadora a 37 graus Celsius e coloque-as imediatamente no banho de água com gelo. Lave as células duas vezes com PBS gelado contendo cálcio e magnésio, utilizando os mesmos volumes preparados anteriormente para a incubação com o crosslinker; para uma placa de seis poços, calcule dois mililitros por poço, e assim por diante.

Após a segunda lavagem, adicione o controle do veículo, que é o DMSO dissolvido em tampão, ou a solução tampão de reticulação com DSP às células, incube em gelo por duas horas e verifique aproximadamente a cada 20 minutos para garantir que todas as células estejam cobertas pela solução. Se algumas células ficarem expostas, incline e gire o recipiente para cobri-las novamente de forma uniforme; é normal que uma pequena quantidade de DSP precipite.

Durante a incubação de duas horas com as células, antes de terminar esse período de duas horas, prepare uma solução de quenching de um XDSP diluindo o reagente no PBS contendo cálcio e magnésio. Mantenha a solução em gelo até usá-la para interromper a reação de reticulação, inativando o DSP que não reagiu. Quando as duas horas terminarem, remova das células as soluções controle e de reticulação.

Adicione a solução de parada gelada de DSP e incube no gelo por 15 minutos. Enquanto isso, dilua o coquetel completo de inibidores de protease na proporção de 1 para 50 no tampão de lise celular. Após os 15 minutos, lave as células duas vezes com PBS contendo cálcio e magnésio.

Em seguida, adicione o tampão de lise contendo os inibidores de protease às células e agite a 4 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos de lise celular, use um espátula para células para coletar as células da placa. Certifique-se de manter os lisados no gelo para minimizar a atividade de proteases.

Centrifugue os lisados celulares por 15 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga mini de bancada, na velocidade máxima de 15.000 Gs. Pipete o sobrenadante para um tubo novo e descarte o precipitado. Analise os níveis de proteína utilizando o ensaio de Bradford e prossiga com a imunoprecipitação. Comece a preparar a imunoprecipitação imediatamente após iniciar a reação de reticulação de duas horas em tubos de centrífuga microfugáveis com tampa rosqueável.

Combine 30 microlitros de microesferas imunomagnéticas anti-IgG com 500 microlitros de tampão IP. Adicione o anticorpo contra o alvo de interesse. A quantidade apropriada de anticorpo deve ser determinada para cada antígeno individual.

Em experimentos preliminares, os possíveis controles negativos para as microesferas incluem ausência de anticorpo, microesferas e microesferas com anticorpo de controle isotípico para ligar o anticorpo de IP às microesferas magnéticas. Incubar em um agitador rotativo durante duas horas à temperatura ambiente. Ao final da incubação, fazer uma centrifugação rápida dos tubos e colocá-los no suporte magnético. As microesferas se concentrarão no lado do ímã.

Remova a solução contendo anticorpos não ligados e lave imediatamente as perlas para evitar que sequem. Após duas lavagens, adicione 500 microlitros de um micrograma por mililitro de lisado de células negativas ou positivas para DSP aos tubos apropriados. Um controle negativo de competição com peptídeo pode ser preparado nesta etapa adicionando o peptídeo imunogênico em uma concentração determinada em experimentos preliminares à mistura de lisado e perlas.

Outro controle negativo possível preparado nesta etapa é uma reação contendo apenas tampão ou livre de lisado, preparada pela adição de apenas 500 microlitros de tampão de lise às esferas. Resuspenda suavemente as esferas para as reações experimentais e de controle. Não vortex, pois isso causará a quebra das esferas; incube a quatro graus com rotação de ponta a ponta durante duas horas.

Após duas horas, remova o lisado utilizando o suporte magnético. Faça uma centrifugação rápida e lave as microesferas por um total de seis vezes com um mililitro de tampão de IP. Incube cada lavagem a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Para evitar os complexos ligados, adicione um volume de tampão de amostra para gel ao tubo de IP logo acima do pellet de esferas. Para agrupar as esferas na parte inferior do tubo, bata suavemente na base do tubo para que todas as esferas sejam ressuspendidas no tampão de amostra para gel. Alternativamente, para isolamento por imunofiltração, adicione 30 microlitros de tampão suplementado com o peptídeo imunogênico às esferas.

A concentração necessária do peptídeo imunogênico é determinada empiricamente. Após testar uma faixa de 10 a 200 micromolar, incubar as microesferas a quatro graus por duas horas, batendo levemente nos tubos a cada 30 minutos. Utilize o suporte magnético para remover os 30 microlitros contendo os complexos eluídos e guarde em um tubo limpo, lave com tampão IP e conserve as microesferas.

Adicione um tampão amostral de gel a uma vez aos grânulos para ambos os métodos de eluição. Aqueça os grânulos imunomagnéticos re-suspendidos em tampão amostral de gel a 75 graus Celsius por cinco minutos, além de desnaturar as proteínas. Este passo também clivará a molécula de DSP, permitindo a separação das proteínas individuais no complexo analisado.

As amostras em um gel de eletroforese SDS-PAGE para western blot. As microesferas magnéticas imunológicas esvaziadas podem ser repelidas por centrifugação e removidas da amostra com um suporte magnético antes da aplicação. Se o ensaio imunoenzimático por afinidade estiver livre de IgG, tanto pela coloração proteica do SDS-PAGE quanto por blots imunológicos, ele é adequado para espectrometria de massas.

Aqui está um exemplo de um western blot de material proveniente de lisados celulares com e sem reticulação, seguido por precipitação imunomagnética utilizando um anticorpo monoclonal contra a subunidade AP três. A reticulação com delta permite a detecção de proteínas interagentes não observadas em amostras sem reticulação durante isolamentos imunomagnéticos. Os controles negativos não mostraram captação específica de proteínas utilizando controles livres de anticorpo e controles de isotipo de anticorpo com IgG direcionada contra o receptor de transferrina, tanto para amostras com quanto sem reticulação.

Neste exemplo, utilizou-se a eluição com peptídeo de afinidade para recuperar as proteínas ligadas ao anticorpo de IP. Observe que o anticorpo imuno está ausente na fração do sobrenadante e permanece na fração do pellet durante a eluição com peptídeo. Acabamos de mostrar como isolar complexos MultiPro lábeis utilizando o crosslinker químico DSP, seguido por purificação de afinidade imunomagnética.

Ao realizar este procedimento, é importante manter as soluções celulares e os lisados resfriados para preservar interações instáveis durante o reticulamento e minimizar a atividade de proteases. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.