Name: Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda tomografia de fluorescência difusa guiada por tomografia computadorizada para imagem de biomarcadores de câncer em modelo de glioma em camundongos. Este método combina imagem óptica e anatomia para monitorar terapias moleculares.

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Este trabalho foi financiado por verbas Instituto Nacional do Câncer R01 CA120368 e R01 CA109558 (KMT, RAC, FEG, BWP) e RO1 CA132750 (MJ, BWP) e K25 CA138578 (FL) e Canadian Institutes of Health prêmio bolsa de pesquisa de pós-doutorado (KMT ). O desenvolvimento do sistema de tomografia de fluorescência foi parcialmente financiado pelo Tecnologias Avançadas de Investigação (Montreal, QC).

1. Preparação dos animais <ol><li> Anestesiar rato nu (Charles River, Wilmington, MA) com injecção intra-peritoneal de cetamina-xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg ip). </li><li> Coloque o rato na moldura estereotáxica, fazer uma incisão no couro cabeludo do lado esquerdo do crânio e, usando uma agulha de 18 gauge, criar um orifício de 1 mm de diâmetro no crânio milímetros 2 a partir da linha central e 2 mm atrás do bregma. </li><li> Injectar 5 × 10 5 U251 humanas células de glioblastoma neuronais (gentilmente fornecida pelo Dr. Mark Israel no Dartmouth College, Hanover, NH) em 5 ml de solução tampão de fosfato para o hemisfério cerebral esquerdo, a uma profundidade de aproximadamente 2 mm abaixo da superfície do cérebro. Usar uma micro-seringa Hamilton 18 e um romba terminou calibre 27 com agulha para o implante de células e inserir a ponta da agulha 3 milímetros a partir da superfície externa do crânio e depois retirar 1 mm a criar uma bolsa para as células. </li><li> Local da sutura da incisão e permitir reperação de uma cirurgia. </li><li> Espere ~ 14 dias para permitir que o tumor crescer antes de imagem. </li></ol> 2. A calibração do sistema de fluorescência Tomografia <ol><li> No dia da imagem do rato, iniciar sistema e permitir que os lasers e detectores de luz para aquecer-se durante aproximadamente 20 minutos para evitar desvios em relação à sensibilidade do sistema. </li><li> Coloque um 100 °-por-4 ° engenharia linha difusor (Thorlabs, Newton, NJ) no centro directa do pórtico de imagem, o normal para o laser de excitação: um picossegundo-80-pulsado MHz diodo laser multimodo 635 nm (PicoQuant Photonics Norte America Inc., Westfield, MA). Ajustar o ângulo do difusor para maximizar a quantidade de sinal detectado por todos os cinco canais de recolha de luz. Uma descrição completa da geometria de imagem é fornecida em outro 11,14,15. </li><li> Coloque OD 2 filtros de densidade neutra (Thorlabs, Newton, NJ) na frente de todos os tubos de detecção de fluorescência fotomultiplicador (PMT) e 1 OD filtros de densidade neutra (Thorlabs, Newton, NJ) na frente de todos os PMTs detecção de transmitância. Colete 100 perfis de pulsos temporais de dispersão (TPSF) do laser, cada um com um tempo de integração 1-s. </li><li> Normalize cada TPSF pela referência laser, correto o desvio temporal na referência laser, e média de todas as iterações para cada detector. Estes são os médios TPSFs detector funções específicas do instrumento de resposta (IRF) utilizados na reconstrução da imagem óptica. </li></ol> 3. Imagem Protocolo <ol><li> Anestesiar o rato com 2% de isoflurano em oxigénio (1 L / min). </li><li> Injectar 1 nanomole de IRDye 800CW-EGF e 1 nanomole de Alexa Fluor 647 em 100 uL de solução de tampão fosfato, por via intraperitoneal, 12 h antes da imagem para alvejar de crescimento epidérmico superexpressão do receptor do factor no tumor. </li><li> Posicione o mouse sobre a fibra de vidro suporta o leito de imagem, organizando o mouse de modo que seu nariz permanece em um cone entregar anestesia com isoflurano. </li><li> Encerteza de que o rato é posicionado de forma adequada sobre a cama: isto é, que, quando o leito é presa no sistema de tomografia de fluorescência com o rato está no centro aproximado do pórtico de imagem. Este posicionamento pode ser guiado pela rotação do excitação laser 180 ° em torno do rato, assegurando que o ponto focal do laser ilumina um ponto aproximadamente no centro do rato a partir da perspectiva do laser em todos os ângulos. </li><li> Uma vez posicionado, transferir cuidadosamente a cama de imagem e mouse para o microCT (explorar Locus, a GE Healthcare, London, ON) scanner e coletar informações anatômicas com uma resolução de 93 mícrons isotrópico para toda a cabeça do rato. </li><li> Visualizar a pilha de imagem TC e escolher a fatia (s) a ser trabalhada com o sistema de tomografia de fluorescência. </li><li> Transferir cuidadosamente a cama de imagem e mouse de volta para o sistema de tomografia de fluorescência. Escolha o número de posições de origem para coletar dados sobre o mouse para cada slic imageme (32), o tempo de integração para cada medição TPSF (1 s), o número de iterações para cada posição da fonte (10), ea posição e número de fatias de imagem desejados a partir da pilha de imagem TC a partir do Passo 3,6. Os números entre parênteses são valores típicos para cada parâmetro de imagem rendendo aproximadamente 5 minutos de aquisição de dados por fatia de imagem. </li><li> Coloque filtros notch triplos (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) na frente dos PMTs detecção por fluorescência, para restringir qualquer luz laser de atingir os detectores de fluorescência, e OD 2 filtros de densidade neutra diante dos PMTs detecção de transmitância para evitar a saturação dessas detectores. </li><li> Executar o software de aquisição de dados, na recolha de fluorescência e de transmitância TPSFs em cada posição definida a fonte eo detector e para cada comprimento de onda de excitação (635 nm e 755 nm para excitar a Alexa Fluor 647 e IRDye 800CW-EGF marcadores, respectivamente). Para cada conjunto de TPSFs coletados, monitorar e registrar a intensidade do lasercom um canal de PMT de referência. </li></ol> 4. Reconstrução da imagem <ol><li> Determinar a superfície exterior do rato e da localização das hastes de suporte de imagem de leito a partir das imagens de TC e criar máscaras, que abrange os limites do rato e as hastes de imagem separadamente. </li><li> Use a máscara do rato para produzir uma malha de elementos finitos do animal utilizando o software NIRFAST 19. </li><li> Localizar as posições de origem e de detector a partir do sistema de tomografia de fluorescência na superfície da malha com base em microCT e registo espacial fluorescência coordenadas 20. </li><li> Remover pontos ópticos de dados associados com origem ou detector de posições que interagem com a localização das hastes de suporte de imagem de cama. </li><li> Normalizar os dados coletados em cada posição detector fonte pela referência a laser, corrigir o desvio temporal na referência laser, e correta para as sensibilidades do filtro, que foram determinadas pelo teste experimental<html> no momento da compra 15. </li><li> Tomar a Razão de Nascido dos dados (fluorescência dividida pela transmitância) para cada posição de fonte eo detector e multiplicam-se com uma simulação do modelo para a frente de transmitância com base na malha de animais de elementos finitos para uniformes propriedades ópticas. Isto é feito para minimizar os erros associados com a fonte ou detector de tecido de acoplamento 21, para calibrar os dados para o modelo 22, e para ajustar os dados para os outros aspectos da modelo de dados-incompatibilidade 23,24. </li><li> Construir um vector de dados composto da diferença em escala dos dados de taxa nascidos recolhidos em ambos os comprimentos de onda. O fator de escala é escolhido para maximizar EGFR contraste vinculativo. Execute no domínio do tempo de reconstrução de imagem com os dados diferença calibrados usando o TPSF para cada canal de detecção como uma entrada, e criar mapas de fluorescência do marcador com contraste alvo 15. </li></ol> 5. Os resultados representativos &quot;&gt; Um exemplo de uma reconstrução de fluorescência revestida com uma imagem anatómica co-CT registada a partir da cabeça de um rato com um tumor U251 glioma ortotópico é apresentado na Figura 1b. O centro de massa do glioma determinada pela reconstrução fluorescente (Figura 1b ) foi de 1 mm do centro de massa do tumor determinada por contraste de melhorar a ressonância magnética (Figura 1a). As imagens de TC e RM foram co-registados com base em uma transformação informação mútua. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Com contraste (gadolínio) ressonância magnética de cabeça de rato (a). O rato foi inoculado ortotopicamente com uma linha de células de glioma humano U251. A localização do tumor, o qual absorve mais agente de contraste do que o cérebro normal, pode ser visto no hemisfério cerebral esquerdo (à direita na imagem) e indicada pela seta branca. O corresponding computadorizada da imagem tomografia (a partir do mesmo local na cabeça de rato) é descrito em (b) com o factor de crescimento epidérmico alvo fluorescência menos o sobreposto reconstrução untargeted fluorescência. As unidades de fluorescência em mm inversa e se relacionam com o coeficiente de absorção da fluorescência específica ligada multiplicada por sua eficiência quântica e por sua concentração.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Fluorescência tomografia (FT) é um sensível, radiação ionizante modalidade de imagem molecular com base na livre visível e do infravermelho próximo de transportes luz através do tecido biológico. A maior parte do interesse na FT tem sido focada em seu potencial para acelerar a descoberta e desenvolvimento de medicamentos em animais de pequeno porte modelos experimentais 1 e uma área-chave da investigação foi o estudo da expressão de biomarcador do cancro e de resposta às terapias moleculares 26. Atualmente, existem duas abordagens concorrentes para FT projeto do sistema. O desenho mais comum é baseada em refrigeração charge-coupled device (CCD) câmeras para detecção de fluorescência 4-9. Esta concepção proporciona uma elevada densidade de medições, a maximização de amostragem de tecido uma vez que cada pixel na câmara CCD pode detectar a luz que tenha percorrido um caminho único através do tecido. No entanto, as câmaras CCD têm um alcance limitado dinâmico, leia-o ruído limita sua sensibilidade final. O segundo projeto evita a limitação potencial<html> ções de CCD detecção câmara, empregando a tecnologia de contagem altamente sensível único-fotão baseada na utilização de detectores, tais como tubos fotomultiplicadores ou fotodíodos avalanche 10-13. A desvantagem destes métodos de detecção mais sensível é que cada detector só pode recolher luz num único ponto, por isso, a obter uma amostragem de tecido denso, quer detectores muitos têm de ser utilizado (o que é muito caro), ou projecções muitos têm de ser trabalhada com o mesmo detector (que pode ser demorado). Enquanto o nível ótimo de amostras de tecido para FT pequeno animal não tiver sido acordado, e podem variar em uma base caso a caso, concorda-se que um único fóton instrumentação contagem é mais adequada para explorar os limites de sensibilidade de FT em termos da sua capacidade para detectar baixas concentrações de marcadores moleculares. Neste estudo, nós fornecemos uma metodologia para a realização de FT em um único fóton instrumentação de detecção contagem para localizar tumores em camundongos. ent &quot;&gt; Existem quatro passos críticos envolvidos para produzir conjuntos de dados robustos com o tempo correlacionados FT-fotão único de contagem. O primeiro é a aplicação de um procedimento de calibração apropriada e fácil. Na metodologia apresentada, as sensibilidades respectivas de cada canal de detecção são contabilizados para através da recolha de uma medição de referência de luz de excitação transmitida através de uma linha de difusor concebido para dirigir fracções iguais de luz para cada detector 15. Além disso, a luz detectada durante uma experiência é continuamente calibrado para a referência de laser, tanto em termos de intensidade e significa . tempo, o que poderia variar ao longo do tempo, pela operação de um laser de referência canal 11,15 O segundo passo crítico é a recolha precisas e co-registo de imagem anatómica para guiadas reconstruções de fluorescência Os dados FT sozinho não oferece qualquer informação anatómica.; por conseguinte, a fim de criar um modelo de transporte de luz que pode ser usado para reconstruir o LOcatião de fontes fluorescentes dentro de um espécime da fluorescência detectada na superfície do espécime, a anatomia do espécime em relação ao sistema de FT deve ser conhecida com precisão. No nosso sistema, a informação anatómica é adquirida por um sistema de tomografia computadorizada com micro-coordenadas espaciais que foram registados espacialmente com as do sistema de FT 15,20. O terceiro passo crítico envolve garantir que uma exposição óptima (isto é, o tempo total de detecção de fotões para cada projecção laser) é empregada em cada posição fonte eo detector. Isto é importante, por duas razões: em primeiro lugar, para assegurar que não é adequada sinal-ruído em cada posição de detecção e segundo para evitar a saturação do detector, o que poderia danificar as unidades de detecção. A fim de alcançar uma exposição óptima em cada posição do detector, um controle automático de exposição é empregue, o qual essencialmente triangula a exposição óptima a partir de dois, de baixo do sinal 14 exposições. A crítica quartopasso da metodologia está a fazer referência os dados recolhidos de fluorescência para a quantidade de luz de excitação transmitido. Esta referência é muitas vezes chamada de taxa de Born, e proporciona muitos benefícios para FT, com o principal sendo uma atenuação de erros do modelo de dados-incompatibilidade 23,24. O sistema apresentado foi concebido para detectar a luz de excitação de fluorescência e ambos transmitidos simultaneamente por canalizando a luz em cada canal de detecção em 2 tubos fotomultiplicadores separados. Ao fazer isso, nós evitamos os efeitos do movimento sobre a veracidade da relação de Born. Com um conjunto de dados robusto que lado, a reconstrução da imagem de tempo de domínio de dados envolve a solução do problema inverso da malha de elementos finitos com a expressão: d = Jx onde d é um vetor com n elementos x m para n fonte de detectores de projeções e TPSF m tempo portões; J é um n x m-por-sensibilidade l de matriz (ou Jacobiana), para os nós de l na malha; e X é o vector de fluorescência propriedades ópticas em cada nó, tendo l tamanho d são os dados recolhidos calibradas durante a experiência e J é simulado utilizando a solução de elemento finito. para a aproximação de difusão no domínio do tempo de fluorescência de transporte 25. O tempo de dimensão de J é também convolved com as funções de detecção de resposta específicos do instrumento. X é uma representação do mapa de fluorescência de interesse e é resolvido pela utilização de um Levenberg-Marqardt pelo menos não-negativo abordagem quadrados com Tikhonov regularização 15. A metodologia apresentada aqui, que descreve um procedimento capaz de localizar tumores fluorescente etiquetado em camundongos usando altamente sensíveis fóton contagem detecção por fluorescência, tem o potencial de ampliar os limites da FT. Num estudo anterior, o potencial de empregar esteabordagem em maior-que-ratos modelos animais, como ratos, bem como uma maior sensibilidade sobre projetos de sistemas existentes no rato do tamanho de amostras, foi demonstrado 17. A aplicação imediata dessa abordagem seria para o monitoramento de expressão de biomarcadores in vivo em modelos de tumores pequenos animais para avaliar a eficácia de drogas em um meio de alto rendimento. A capacidade do sistema para excitar e detectar a fluorescência em comprimentos de onda múltiplos permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores fluorescentes. Adicionais marcadores fluorescentes fornecer um meio de interrogar múltiplos aspectos de uma patologia, simultaneamente, ou poderia ser utilizado, como no presente estudo, a empregar abordagens de imagem mais quantitativos, tais como repórter duplo métodos de medição do potencial de ligação in vivo, um marcador da densidade do receptor 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW-EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647, succinimidil éster </td><td> Life Technologies </td><td> A20106 </td><td> Reagido com água para minimizar a ligação não-específica </td></tr></tbody></table>

tomografia computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Pequenos animais de fluorescência molecular imaging (FMI) pode ser uma poderosa ferramenta para a descoberta da droga pré-clínicos e estudos de desenvolvimento 1. No entanto, a absorção de luz por cromóforos de tecidos (por exemplo, a hemoglobina, água, lípidos, a melanina) tipicamente limita propagação do sinal óptico por meio de espessuras maiores do que alguns milímetros 2. Comparado a outros comprimentos de onda visíveis, absorção de tecido para o vermelho e infravermelho próximo (near-IR) de absorção de luz diminui drasticamente e não-elástica dispersão torna-se o mecanismo de interação dominante luz-tecido. O desenvolvimento relativamente recente de agentes fluorescentes que absorvem e emitem luz na gama de quase-IR (600-1000 nm), tem conduzido ao desenvolvimento de sistemas de imagem e modelos propagação da luz que podem alcançar corpo inteiro tridimensional de imagem em pequenos animais 3. Apesar de grandes avanços nesta área, a natureza mal-colocados da tomografia de fluorescência difusa permanece um significativoproblema para a estabilidade, a recuperação de contraste e resolução espacial de técnicas de imagem e de reconstrução a melhor abordagem para o FMI em pequenos animais ainda não foi acordado. A maioria dos grupos de pesquisa têm investido em charge-coupled device (CCD) baseados em sistemas que fornecem sensibilidade dos tecidos de amostragem, mas suboptimal abundantes 4-9, enquanto o nosso grupo e alguns outros 10-13 têm buscado sistemas baseados em detectores de alta sensibilidade , que neste momento permitir amostragem de tecido denso para ser conseguida somente à custa da taxa de transferência de imagem baixa. Aqui nós demonstrar a metodologia de aplicação de um único fóton tecnologia de detecção em um sistema de tomografia de fluorescência para localizar uma lesão cerebral canceroso em um modelo de mouse. A fluorescência tomografia do sistema (FT) empregados único fóton contando com tubos fotomultiplicadores (PMT) e rico em informações de detecção de luz no domínio do tempo em uma conformação de não-contato 11. Isto proporciona uma col simultânealição de excitação e emissão de luz transmitida, e inclui o controle de exposição automática de fluorescência de excitação 14, referência laser, e co-registro com um animal de pequeno tomografia computadorizada do sistema (microCT) 15. Um modelo de rato nu foi usado para geração de imagens. O animal foi inoculado ortotopicamente com uma linha de células de glioma humano (U251), no hemisfério cerebral esquerdo e fotografada 2 semanas mais tarde. O tumor foi feita a fluorescência por injecção de um traçador fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) dirigidas para o receptor de factor de crescimento epidérmico, uma proteína da membrana celular conhecido por ser superexpresso na linha de tumor U251 e muitos outros cancros 18. Um segundo, untargeted traçador fluorescente, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) foi também injectado para explicar os efeitos de receptores não-mediadas na absorção dos marcadores orientadas para fornecer um meio de quantificar ligação do marcador, receptor de disponibilidade / densidade 27. A CT-guiada, time-domínio algoritmo foi usado para reconstruir o local de ambos marcadores fluorescentes (isto é, a localização do tumor) no cérebro do rato e da sua capacidade para localizar o tumor foi verificada por meio de contraste de imagem por ressonância magnética. Embora demonstrada para imagens de fluorescência em um modelo de rato glioma, a metodologia apresentada neste vídeo pode ser estendido para diferentes modelos de tumores em vários modelos animais pequenos potencialmente até o tamanho de um rato 17.

Tomografia de fluorescência difusa oferece uma abordagem de custo relativamente baixo e com elevado potencial de todo a pré-clínica<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem do tumor. A metodologia de coleta de dados ópticos, calibração e reconstrução da imagem é apresentada para uma tomografia computadorizada guiada sem contato do sistema no domínio do tempo usando fluorescente direcionamento do tumor receptor do fator de crescimento epidérmico biomarcador em um modelo de glioma mouse.

Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer

A imagem molecular de fluorescência (IMF) em pequenos animais pode ser uma ferramenta poderosa para estudos pré-clínicos de descoberta e desenvolvimento de fármacos1. No entanto, a luz ...

O objetivo geral do seguinte experimento é obter imagens de fluorescência da expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico em um modelo murino ortotópico de glioma. Isso é alcançado inoculando o hemisfério cerebral esquerdo de um camundongo A IIC com células de glioma humano U2 51 que expressam proteína verde fluorescente. Após o tumor crescer por duas semanas, o camundongo é injetado com um coquetel de dois traçadores fluorescentes.O camundongo é então submetido a imagem em um sistema de raios-x para pequenos animais para coletar dados anatômicos necessários para a reconstrução precisa da imagem. Os dados são utilizados para posicionar anatomicamente a fonte e detectar as localizações do sistema de tomografia óptica, e um software personalizado é usado para coletar os dados de fluorescência e construir a imagem final. Em última análise, este método pode gerar uma imagem de um tumor com base na sua superexpressão do fator de crescimento epidérmico, utilizando imagens de fluorescência e raios-x, cuja precisão pode ser comparada com a imagem por ressonância magnética com contraste.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a tomografia de fluorescência em pequenos animais baseada em dispositivos de acoplamento de carga, é que a detecção por contagem de fótons individuais utilizando tubos fotomultiplicadores oferece uma sensibilidade e uma faixa dinâmica muito maiores para a detecção de luz. Este método pode, em última instância, ser usado para monitorar e avaliar o sucesso de terapias moleculares mediante a medição da expressão de seus alvos. Embora tumores subcutâneos possam ser facilmente visualizados com métodos não tomográficos por imagem de superfície, este sistema foi projetado para realizar imagens através de tecidos com espessura de até vários centímetros, tornando-o especialmente adequado para imagens, contraste, entrega de agentes e detecção de vazamento em tumores cerebrais.Embora este método possa fornecer informações sobre a expressão de biomarcadores de câncer, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como infecções, obesidade ou aspectos relacionados ao envelhecimento, tais como o Alzheimer. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à natureza difusa da propagação da luz em tecidos biológicos e à dificuldade em utilizar a tomografia de raios X para a reconstrução da luz difusa. A demonstração visual deste método é essencial.Como os passos de coleta de dados e reconstrução de imagens podem ser difíceis de aprender, é importante garantir que os dados coletados do sistema fluorescente estejam bem calibrados. O pacote de software near fast foi projetado para ler dados ópticos e usar as imagens de tomografia de raios X para criar uma malha de elementos finitos, que é utilizada como um modelo espacial para o reconstrução da fluorescência. Para começar, posicione um camundongo nu atímico anestesiado sobre um campo cirúrgico estéril e confirme a profundidade da anestesia antes de prosseguir; limpe e desinfete a pele sobre a área de incisão.Usando Betadine, coloque um campo cirúrgico estéril sobre o local da incisão; com um bisturi, faça uma pequena incisão ligeiramente à esquerda da linha mediana e 0,5 centímetros posterior à linha intraocular. Limpe a superfície do crânio removendo qualquer tecido conjuntivo para que os pontos de referência possam ser identificados. Uma vez exposto o crânio, use uma broca de alta velocidade com uma ponteira estéril de um milímetro para fazer um orifício localizado dois milímetros à esquerda da linha central e dois milímetros atrás do bgma.Carregue uma seringa Hamilton Micros com uma agulha romba de 27 gauge com as células a serem implantadas. Em seguida, posicione o camundongo sobre um aparelho estereotáxico. Depois, confirme um plano cirúrgico e anestésico profundo com um aperto no dedo do pé e reposicione o campo cirúrgico sobre o animal.Em seguida, fixe a seringa carregada no estereotáxico. Posicione a seringa sobre o orifício no crânio e insira a ponta da agulha três milímetros abaixo da superfície do crânio. Em seguida, recue a agulha um milímetro para criar um bolsão.O próximo passo é injetar lentamente as células no hemisfério cerebral esquerdo ao longo de um período de cinco minutos. Após a conclusão da injeção, retire a agulha e limpe o orifício com Betadine. Para impedir que as células cresçam fora do local da injeção, remova o camundongo do estereotáxico e preencha o orifício exposto com cera óssea pré-aquecida.Por fim, feche o local da incisão com sutura de náilon estéril 5-0. Retorne o camundongo a uma gaiola aquecida e monitore até a recuperação; após a recuperação, injete no camundongo 130 microlitros de 0,1 miligrama por quilograma de buprenorfina por via IP e permita que o tumor cresça por 14 dias antes da imagem. No dia da aquisição de imagens do camundongo, inicie o sistema para permitir que os lasers e detectores de luz aqueçam por aproximadamente 20 minutos.Para evitar desvios e sensibilidade do sistema, coloque um difusor de linha projetado de 100 graus por quatro graus exatamente no centro do suporte de imagem para dispersar os lasers de excitação entre os canais de detecção do sistema com intensidade igual. Ajuste o ângulo do difusor manualmente para maximizar a quantidade de sinal detectado pelos cinco canais de coleta de luz. Em seguida, coloque a densidade óptica.Dois filtros de densidade neutra na frente de todos os tubos fotomultiplicadores (PMTs) de detecção de fluorescência e densidade óptica. Um filtro de densidade neutra na frente de toda detecção de transmitância. Os PMTs coletam 100 funções de dispersão temporal de pulso ou T psfs do laser, cada uma com um tempo de integração de um segundo para cada laser sequencialmente, normalizam cada TPSF pela referência do laser, corrigem a deriva temporal na referência do laser e fazem a média sobre todas as iterações para cada detector e cada laser separadamente.Essas TPS médias são as funções de resposta do instrumento específicas do detector utilizadas na reconstrução da imagem óptica 12 horas antes do procedimento de imagem. Injete o camundongo-teste com um coquetel de traçadores fluorescentes. A calibração precisa do sistema de tomografia fluorescente e a restrição do movimento do animal são os aspectos mais difíceis deste procedimento.A reconstrução da imagem é tão mal colocada que erros leves na coleta de dados podem levar a erros significativos na imagem reconstruída. Para garantir que os dados coletados sejam precisos, imobilizamos o camundongo da melhor forma possível e repetimos a calibração antes e depois da varredura, aumentando a probabilidade de obtermos uma calibração precisa. Quando estiver pronto, coloque o animal anestesiado sobre os suportes de fibra de vidro da cama de imagem.Após posicionar a cabeça dentro do cone nasal para anestesia contínua com gás, fixe os dentes na barra de mordida e prenda o animal com fita. O camundongo deve ser colocado aproximadamente no centro do gantry de imagem. Esse posicionamento pode ser orientado pela rotação do laser de excitação em 180 graus ao redor do camundongo, garantindo que o ponto focal do laser ilumine um ponto aproximadamente no centro do animal, a partir da perspectiva do laser, em todos os ângulos.Uma vez posicionado corretamente, transfira cuidadosamente a maca de imagem e o camundongo para o escâner de micro-TC e colete informações anatômicas com uma resolução isotrópica de 93 micrômetros em toda a cabeça do camundongo. Visualize o conjunto de imagens de TC e selecione as fatias que serão imageadas com o sistema de tomografia por fluorescência. Transfira cuidadosamente a maca de imagem e o camundongo de volta ao sistema de tomografia por fluorescência.Escolha o número de posições da fonte para cada corte de imagem, o tempo de integração para cada medição TPSF, o número de iterações para cada posição da fonte e a posição e o número de cortes de imagem desejados a partir da pilha de imagens de TC criada anteriormente. Em seguida, coloque filtros na frente dos PMTs de detecção de fluorescência para bloquear toda a luz de excitação e filtros de densidade neutra na frente dos PMTs de detecção de transmitância. Para evitar a saturação desses detectores, execute o software de aquisição de dados coletando TPSFs de fluorescência e de transmitância em cada posição definida entre fonte e detector, em ambos os comprimentos de onda de excitação.Para cada conjunto de T psfs coletados, monitore e registre a intensidade do laser com um canal PMT de referência. Determine a superfície externa do camundongo e a localização da cama de imagem. Utilize hastes de suporte das imagens de TC e crie máscaras que cubram os limites do camundongo e da haste de imagem.Separadamente, utilize a máscara do mouse para produzir uma malha de elementos finitos do animal usando o software near fast. Localize as posições da fonte e dos detectores do sistema de tomografia de fluorescência na superfície da malha com base nas coordenadas de registro espacial do micro-TC e da fluorescência. Remova os pontos de dados ópticos associados às posições da fonte ou dos detectores que interagem com a localização da cama de imagem.As hastes de suporte normalizam os dados coletados em cada posição fonte-detectores pela referência do laser, corrigem a deriva temporal na referência do laser e corrigem as sensibilidades dos filtros, que foram determinadas por testes experimentais no momento da compra. Calcule a razão de Born dos dados para cada posição fonte-detectores e multiplique por uma simulação de modelo direto de transmitância com base na malha animal de elementos finitos para propriedades ópticas uniformes. Isso é feito para mitigar erros associados ao acoplamento do tecido com a fonte ou detector, calibrar os dados ao modelo e ajustar os dados para outros aspectos de discrepância entre modelo e dados; construa um vetor de dados composto pela diferença escalonada dos dados da razão de Born coletados em ambos os comprimentos de onda.O fator de escala é escolhido para maximizar o contraste da ligação ao EGFR, realizar a reconstrução da imagem no domínio temporal com os dados de diferença calibrados utilizando a TPSF para cada canal de detecção como entrada e criar mapas de fluorescência do traçador direcionado com contraste aumentado observado. A seguir, há um exemplo de uma reconstrução de fluorescência sobreposta a uma imagem anatômica de tomografia computadorizada coregistrada de um camundongo com um tumor de glioma ortotópico U251. O centro de massa do glioma determinado pela reconstrução de fluorescência estava a menos de um milímetro do centro de massa do tumor, determinado por imagem de ressonância magnética com contraste.O software para aquisição de dados é personalizado para este dispositivo, mas a maioria das técnicas de processamento de imagem pode ser realizada usando o software near fasts disponível em @nearfasts.org. Assim, ao realizar este procedimento, é importante garantir que tanto o sistema quanto os dados sejam calibrados com precisão antes da reconstrução da imagem. Essa calibração exige que as diferenças de sensibilidade e temporais entre os detectores sejam consideradas após a reconstrução da imagem de um traçador direcionado a um biomarcador.A imagem semelhante de um traçador não direcionado fornece um meio de correção para a captação não mediada por receptores. Isso permite quantificar a quantidade de ligação do traçador, bem como a densidade de receptores in vivo após seu desenvolvimento. Essa técnica inspirou outros pesquisadores a projetar sistemas de tomografia por fluorescência guiados por imagem de raio X, e abriu caminho para a imagem de corpo inteiro de animais maiores.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de tomografia de fluorescência difusa, que combina sistemas de imagem óptica e imagem anatômica por raios X para a detecção de biomarcadores de câncer.

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Research

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Medicine

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