Tomografia Computadorizada guiada por tomografia difusa no domínio do tempo de fluorescência em pequenos animais para localização de biomarcadores de câncer

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir imagens de fluorescência da expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico em um modelo de camundongo com glioma ortotópico. Isso é conseguido inoculando o hemisfério cerebral esquerdo de um camundongo A IIC com proteína fluorescente verde que expressa células de glioma U2 51 humanas. Depois que o tumor cresceu por duas semanas, o camundongo é injetado com um coquetel de dois traçadores fluorescentes.

O camundongo é então fotografado em um sistema de raios-x de pequenos animais para coletar dados anatômicos necessários para uma reconstrução precisa da imagem. Os dados são usados para posicionar anatomicamente a fonte e detectar locais do sistema de tomografia óptica, e um software personalizado é usado para coletar os dados de fluorescência e construir a imagem final. Em última análise, este método pode construir uma imagem de um tumor com base em sua superexpressão do fator de crescimento epidérmico usando imagens de fluorescência e raios-x, cuja precisão pode ser comparada com a ressonância magnética com contraste.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a tomografia de fluorescência de pequenos animais baseada em dispositivos e acoplamento de carga, é que a detecção de contagem de fótons únicos usando tubos fotomultiplicadores oferece uma sensibilidade e faixa dinâmica muito maiores para detecção de luz. Este método pode ser usado para monitorar, avaliar o sucesso das terapias moleculares, medindo a expressão de seus alvos, enquanto os tumores subcutâneos são prontamente visualizados com métodos não tomográficos usando imagens de superfície. Este sistema foi projetado para obter imagens através de tecidos de até vários centímetros de espessura, tornando-o especialmente adequado para imagens, contraste, entrega de agentes e vazamento em tumores cerebrais.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a expressão de biomarcadores de câncer, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como infecção, obesidade ou elementos de envelhecimento, como Alzheimer. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à natureza difusa da propagação da luz no tecido biológico e à dificuldade em usar a tomografia de raios-x para a reconstrução difusa da luz. A demonstração visual desse método é crítica.

Como as etapas de coleta de dados e reconstrução de imagens podem ser difíceis de aprender, é importante garantir que os dados coletados do sistema fluorescente estejam bem calibrados. O pacote de software quase rápido foi projetado para ler dados ópticos e usar as imagens de tomografia de raios-x para criar uma malha de elementos finitos, que é usada como modelo espacial para reconstrução de fluorescência. Para começar, coloque um camundongo nu atímico anestesiado em uma cortina cirúrgica estéril e confirme a profundidade da anestesia antes de prosseguir com a limpeza e desinfecção da pele sobre a área da incisão.

Usando Betadine, coloque um campo cirúrgico estéril sobre o local da incisão usando um bisturi, faça uma pequena incisão ligeiramente à esquerda da linha média e 0,5 centímetros posterior à linha intraocular. Limpe a superfície do crânio limpando qualquer tecido conjuntivo para que os pontos de referência possam ser identificados. Uma vez que o crânio esteja exposto, use uma broca de alta velocidade com uma broca estéril de um milímetro para fazer um furo que esteja dois milímetros à esquerda da linha central e dois milímetros atrás do bgma.

Carregue uma seringa Hamilton Micros com uma agulha de calibre 27 com pontas rombas com as células a serem implantadas. Em seguida, coloque o mouse em um quadro estereotáxico. Em seguida, confirme um plano cirúrgico e estético profundo com uma pinça no dedo do pé e recoloque o campo cirúrgico no animal.

Em seguida, prenda a seringa carregada na estrutura estereotáxica. Posicione a seringa sobre o orifício no crânio e insira a ponta da agulha três milímetros abaixo da superfície do crânio. Em seguida, retire a agulha um milímetro para criar um bolso.

O próximo passo é injetar lentamente as células no hemisfério cerebral esquerdo durante um período de cinco minutos. Quando a injeção estiver concluída, retire a agulha e limpe o orifício com Betadine. Para evitar que as células cresçam fora do local da injeção, remova o camundongo da estrutura estereotáxica e preencha o orifício exposto com cera óssea pré-quente.

Por fim, feche o local da incisão com sutura estéril de cinco oh nylon. Retorne o camundongo a uma gaiola aquecida e monitore até se recuperar após a recuperação, injete no camundongo 130 microlitros de 0,1 miligrama por quilograma de buprenorfina IP e deixe o tumor crescer por 14 dias antes da imagem. No dia da imagem do mouse, inicie o sistema para permitir que os lasers e detectores de luz aqueçam por aproximadamente 20 minutos.

Para evitar desvios e sensibilidade do sistema, coloque um difusor de linha de engenharia de 100 graus por quatro graus no centro direto do pórtico de imagem para dispersar os lasers de excitação entre os canais de detecção do sistema em igual intensidade. Ajuste o ângulo do difusor manualmente para maximizar a quantidade de sinal detectado por todos os cinco canais de coleta de luz. Em seguida, coloque a densidade óptica.

Dois filtros de densidade neutra na frente de todos os tubos fotomultiplicadores de detecção de fluorescência chamados PMTs e densidade óptica. Filtros de densidade neutra na frente de toda a detecção de transmitância. Os PMTs coletam 100 funções de propagação de pulso temporal ou T psfs do laser, cada uma com um tempo de integração de um segundo para cada laser sequencialmente, normalizam cada TPSF pela referência do laser, corrigem o desvio temporal na referência do laser e calculam a média de todas as iterações para cada detector e cada laser separadamente.

Esses TPSs médios são as funções de resposta do instrumento específicas do detector usadas na reconstrução da imagem óptica 12 horas antes do procedimento de imagem. Injete no camundongo de teste um coquetel de marcadores fluorescentes. A calibração precisa do sistema de tomografia fluorescente e a restrição do movimento do animal são os aspectos mais difíceis desse procedimento.

A reconstrução de imagens é tão mal colocada que mesmo pequenos erros na coleta de dados podem levar a erros significativos na imagem reconstruída. Para garantir que dados precisos sejam coletados, imobilizamos o mouse da melhor maneira possível e repetimos a calibração antes e depois da digitalização para melhorar a chance de obter uma calibração precisa quando estiver pronto. Coloque o animal anestesiado nos suportes de fibra de vidro do leito de imagem.

Depois de posicionar a cabeça no cone do nariz para anestesia contínua com gás, prenda os dentes na barra de mordida e prenda o animal com fita adesiva. O mouse deve ser colocado no centro aproximado do pórtico de imagem. Esse posicionamento pode ser guiado girando o laser de excitação 180 graus em torno do mouse, garantindo que o ponto focal do laser ilumine um ponto aproximadamente no centro do mouse da perspectiva do laser em todos os ângulos.

Uma vez posicionado corretamente, transfira cuidadosamente o leito de imagem e o mouse para o scanner de micro CT e colete informações anatômicas com uma resolução de 93 micrômetros isotrópicos para toda a cabeça do mouse. Visualize a pilha de imagens de TC e escolha as fatias a serem visualizadas com o sistema de tomografia de fluorescência. Transfira cuidadosamente a cama de imagem e o mouse de volta para o sistema de tomografia de fluorescência.

Escolha o número de posições de origem para cada fatia de imagem, o tempo de integração para cada medição TPSF, o número de iterações para cada posição de origem e a posição e o número de fatias de imagem desejadas da pilha de imagens de TC criada anteriormente. Em seguida, coloque os filtros na frente dos PMTs de detecção de fluorescência para bloquear toda a luz de excitação e densidade óptica para filtros de densidade neutra na frente dos PMTs de detecção de transmitância. Para evitar a saturação desses detectores, execute o software de aquisição de dados coletando fluorescência e transmitância t psfs em cada posição definida do detector de fonte em ambos os comprimentos de onda de excitação.

Para cada conjunto de T psfs coletado, monitore e registre a intensidade do laser com um canal PMT de referência. Determine a superfície externa do mouse e a localização do leito de imagem. Apoie as hastes das imagens de tomografia computadorizada e crie máscaras que cubram os limites do camundongo e da haste de imagem.

Separadamente, use a máscara do mouse para produzir uma malha de elementos finitos do animal usando o software quase rápido. Localize as posições da fonte e do detector do sistema de tomografia de fluorescência na superfície da malha com base em micro CT e coordenadas de registro espacial fluorescente. Remova os pontos de dados ópticos associados às posições da fonte ou do detector que interagem com a localização do leito de imagem.

As hastes de suporte normalizam os dados coletados em cada posição do detector de fonte pela referência do laser, corrigem a deriva temporal na referência do laser e corrigem as sensibilidades do filtro, que foram determinadas por testes experimentais no momento da compra. Pegue a razão de nascimento dos dados para cada posição do detector de fonte e multiplique com uma simulação de modelo direto de transmitância baseada na malha animal de elementos finitos para propriedades ópticas uniformes. Isso é feito para mitigar erros associados ao acoplamento de tecido de fonte ou detector, para calibrar os dados para o modelo e ajustar os dados para outros aspectos da incompatibilidade de dados do modelo, construir um vetor de dados composto pela diferença dimensionada dos dados da razão de nascidos coletados em ambos os comprimentos de onda.

O fator de escala é escolhido para maximizar o contraste de ligação do EGFR, realizar a reconstrução da imagem no domínio do tempo com os dados de diferença calibrados usando o TPSF para cada canal de detecção como entrada e criar mapas de fluorescência do traçador direcionado com contraste aprimorado visto. Aqui está um exemplo de uma reconstrução de fluorescência sobreposta com uma imagem anatômica de TC co-registrada de um camundongo com um tumor de glioma ortotópico U2 51. O centro de massa do glioma determinado pela reconstrução de fluorescência estava dentro de um milímetro do centro de massa do tumor, determinado por ressonância magnética com contraste.

O software para aquisição de dados é construído sob medida para este dispositivo, mas a maioria das técnicas de processamento de imagem pode ser feita usando o software de quase jejuns available@nearfasts.org. Portanto, ao tentar esse procedimento, é importante garantir que o sistema e os dados sejam calibrados com precisão antes da reconstrução da imagem. Essa calibração requer que a sensibilidade e as diferenças temporais entre os detectores sejam contabilizadas Após a reconstrução da imagem de um traçador direcionado a biomarcadores.

Imagens semelhantes de um traçador não direcionado fornecem um meio de corrigir a captação não mediada pelo receptor. Isso permite que a quantidade de ligação do traçador, bem como a densidade do receptor in vivo, sejam quantificadas após seu desenvolvimento. Essa técnica inspirou outros pesquisadores a projetar sistemas de tomografia de fluorescência guiada por imagens de raios-x e abriu caminho para imagens de corpo inteiro de animais maiores.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de tomografia de fluorescência difusa, que combina imagens anatômicas de raios-x e sistemas de imagens ópticas para imagens de biomarcadores de câncer.