Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados
December 15th, 2017
Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.
O objetivo geral desta abordagem de imagem in vivo específica para o alvo é visualizar marcadores moleculares da atividade da doença na doença inflamatória intestinal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença inflamatória intestinal e pesquisas terapêuticas relacionadas sobre a influência de terapias experimentais ou eventos celulares específicos na inflamação. A principal vantagem dessa técnica é que a atividade da doença pode ser monitorada longitudinalmente e de forma não invasiva.
Embora esse método possa fornecer informações sobre distúrbios inflamatórios, ele também pode ser aplicado para estudar outras doenças, como câncer ou doenças relacionadas ao sistema imunológico. Para induzir a colite, encha o suprimento de água potável dos camundongos experimentais com dois gramas de sulfato de sódio dextrano, ou DSS, dissolvido em 100 mililitros de água potável autoclavada, estimando cinco mililitros de água por camundongo por dia. 24 horas antes do exame, colocar o cocktail de anticorpos de interesse numa seringa estéril protegida da luz e injectar os anticorpos por via intravenosa nas veias da cauda dos animais experimentais.
No dia do experimento, use um barbeador elétrico para raspar o pelo na região abdominal dos animais experimentais para minimizar a reflexão e absorção da luz. Usando um simulador de tecido com espessura e características de absorção definidas, encha o simulador com um volume específico da solução de anticorpo de interesse e meça a fluorescência no dispositivo FMT. Em seguida, em uma tomografia veterinária mediada por fluorescência ou dispositivo FMT para pequenos animais, clique em Novo estudo e inclua os traçadores relevantes na descrição do estudo, incluindo os parâmetros de imagem e as doses.
Criar grupos de estudo de acordo com o desenho experimental, equipando cada grupo com o número adequado de animais. Quando o sistema tiver sido calibrado para as construções traçadoras, coloque o primeiro camundongo anestesiado na posição supina em um de exame aquecível a 42 graus Celsius. Insira o no sistema de imagem e selecione a amostra apropriada do grupo de estudo correspondente.
Selecione o traçador administrado para garantir que os valores da concentração do traçador sejam calculados corretamente e adquira a imagem de refletância de fluorescência no comprimento de onda apropriado para a varredura. Clique em Adquirir imagem para contornar o campo de varredura e confirme se o campo de varredura aparece como uma sobreposição na imagem de refletância de fluorescência. Ajuste o campo de varredura até que ele envolva a região de interesse, tomando cuidado para evitar erros ou áreas de pêlo restante.
Dependendo do destino da imagem, selecione uma resolução de campo de digitalização para definir o número de pontos de dados da imagem dentro do campo de digitalização. Em seguida, clique em Digitalizar para iniciar a aquisição da imagem no comprimento de onda selecionado. No final do exame, remova o animal do para permitir que ele se recupere totalmente com monitoramento antes de retornar à gaiola.
O FMT pode então ser repetido em vários momentos, conforme experimentalmente apropriado. Para analisar as imagens adquiridas, abra o software de análise de imagem apropriado e selecione os dados brutos para a primeira varredura. Usando a ferramenta de reconstrução, crie mapas 3D da distribuição de fluorescência.
Quando todas as varreduras tiverem sido adicionadas ao conjunto de dados de reconstrução apropriado, abra o primeiro conjunto de dados de interesse. Todas as varreduras realizadas para o animal experimental individual selecionado serão mostradas. Selecione a verificação apropriada e clique em Carregar.
Uma reconstrução 3D da distribuição do traçador aparecerá como uma sobreposição da imagem de refletância de fluorescência inicialmente adquirida. Em seguida, identifique os focos de acúmulo de rótulos inespecíficos nos mapas 3D reconstruídos e use a ferramenta de medição para selecionar a região de interesse. O software gerará então uma intensidade de fluorescência para a região de interesse, bem como medições da quantidade picomolar do traçador para o qual a varredura foi calibrada.
Neste experimento, um anticorpo conjugado com fluorescência contra o murino F4/80 foi empregado para visualizar diretamente os macrófagos ativados. Um acúmulo significativamente elevado de traçador fluorescente foi medido por tomografia mediada por fluorescência nos cólons dos camundongos colíticos em comparação com os animais de controle não cólicos, indicando um aumento na infiltração de monócitos e diferenciação em macrófagos ativos nos animais colíticos. Por outro lado, a aplicação de um anticorpo IgG conjugado com fluorescência não específico não desencadeou uma resposta de fluorescência detectável no abdômen ou intestino no grupo de controle colítico ou não cólico, demonstrando a especificidade da interação sonda-alvo do anticorpo F4 / 80.
Medições ex vivo do acúmulo de traçador direcionado a F4/80 em cólons explantados verificam ainda mais a origem colônica do acúmulo de sinal do traçador F4/80 detectado in vivo. De fato, as quantidades calculadas de anticorpos ligados se correlacionam bem com o número histologicamente determinado de macrófagos infiltrantes, confirmando que a imagem in vivo com traçadores específicos pode ser indicativa da atividade local da doença. Uma vez dominado, isso pode ser executado e analisado em alguns minutos, se for executado corretamente.
As etapas de preparação, incluindo a produção de marcadores específicos baseados em anticorpos, geralmente levam de dois a três dias. Ao planejar um procedimento experimental como este, é importante incluir controles apropriados e confiáveis, tanto para o anticorpo quanto para o modelo de doença animal. Após este procedimento, outros métodos, como colonoscopia ou citometria de fluxo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais e validar e quantificar os dados.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem de imagem in vivo específica para visualizar marcadores moleculares da atividade da doença em doença inflamatória intestinal. Utilizando uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa, a pesquisa se concentra na infiltração de macrófagos intestinais em um modelo murino de colite.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Doença Inflamatória Intestinal
Fundamentos
- Sondas específicas são ferramentas inovadoras para analisar mecanismos moleculares.
- Podem ser usadas para estudar a expressão de proteínas em várias doenças.
- Este método permite o monitoramento longitudinal e não invasivo da atividade da doença.
- Pode ser aplicado a distúrbios inflamatórios, câncer e doenças relacionadas ao sistema imunológico.
Objetivo do Estudo
- Visualizar marcadores moleculares da atividade da doença em doença inflamatória intestinal.
- Abordar questões-chave na pesquisa terapêutica relacionada à inflamação.
- Avaliar a influência de terapias experimentais na inflamação.
Métodos Utilizados
- Indução de colite usando sulfato de dextran sódico (DSS).
- Administração de um coquetel de anticorpos por via intravenosa em camundongos experimentais.
- Tomografia mediada por fluorescência para imagem da infiltração de macrófagos.
- Monitoramento longitudinal da atividade da doença in vivo.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da infiltração de macrófagos intestinais.
- Demonstrou a capacidade de monitorar a atividade da doença de forma não invasiva.
- Forneceu insights sobre a dinâmica da inflamação na colite.
- Aplicações potenciais para o estudo de outras doenças foram identificadas.
Conclusões
- A abordagem de imagem específica é eficaz para estudar doença inflamatória intestinal.
- Este método pode melhorar a compreensão dos mecanismos da doença e dos efeitos terapêuticos.
- Pesquisas futuras podem expandir sua aplicação para outras doenças inflamatórias e relacionadas ao sistema imunológico.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
