Name: Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a identificar eventos de sinalização intracelular em células viáveis após interação com células apoptóticas vizinhas. Este método acessível utiliza células BUNPT e estaurosporina para estudar efeitos biológicos em biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, por fundos institucionais do Dr. José A. Arruda e da Seção de Nefrologia da Universidade de Illinois em Chicago (para J. S. L.); e financiamento do Departamento de Medicina da Universidade McGill e do Instituto de Pesquisa do Centro de Saúde da Universidade McGill (para J. R.)

<ol><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+versus+accessory+aspects+of+cell+death%3A+recommendations+of+the+NCCD+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015.</a> Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).</li>
<li>Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+tissue+injury+and+cell+death+in+inflammation%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective.</a> Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHochreiter-Hufford%2C+A+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 5, a008748(2013).</li>
<li>Reddy, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+macrophages+induces+novel+signaling+events+leading+to+cytokine-independent+survival+and+inhibition+of+proliferation%3A+activation+of+Akt+and+inhibition+of+extracellular+signal-regulated+kinases+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2.</a> J. Immunol. 169, 702-713 (2002).</li>
<li>Cvetanovic, M., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+discrimination+of+apoptotic+cells%3A+repression+of+proinflammatory+macrophage+transcription+is+coupled+directly+to+specific+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition.</a> J. Immunol. 172, 880-889 (2004).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells%2C+at+all+stages+of+the+death+process%2C+trigger+characteristic+signaling+events+that+are+divergent+from+and+dominant+over+those+triggered+by+necrotic+cells%3A+implications+for+the+delayed+clearance+model+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).</li>
<li>Cvetanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+apoptotic+cells+reveals+a+ubiquitous+and+unconventional+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).</li>
<li>Birge, R. B., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+apoptotic+immunity%3A+the+calming+touch+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Innate apoptotic immunity: the calming touch of death.</a> Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+apoptotic+cells+by+epithelial+cells%3A+conserved+versus+tissue-specific+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses.</a> J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition-dependent+signaling+events+in+response+to+apoptotic+targets+inhibit+epithelial+cell+viability+by+multiple+mechanisms%3A+implications+for+non-immune+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).</li>
<li>Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effects+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effects of apoptotic cells.</a> Nature. 390, 350-351 (1997).</li>
<li>Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+that+have+ingested+apoptotic+cells+in+vitro+inhibit+proinflammatory+cytokine+production+through+autocrine%2F+paracrine+mechanisms+involving+TGF-%CE%B2%2C+PGE2%2C+and+PAF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF.</a> J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).</li>
<li>Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+and+innate+immune+stimuli+combine+to+regulate+macrophage+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.</a> J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).</li>
<li>Ariel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+neutrophils+and+T+cells+sequester+chemokines+during+immune+response+resolution+through+modulation+of+CCR5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression.</a> Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).</li>
<li>Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+E1+and+protectin+D1+activate+inflammation-resolution+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes.</a> Nature. 447, 869-874 (2007).</li>
<li>Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+are+pleiotropic+inhibitors+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response.</a> Cell. 131, 1124-1136 (2007).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+activate+the+%22phoenix+rising%22+pathway+to+promote+wound+healing+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration.</a> Sci. Signal. 3, ra13(2010).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+activate+AMPK+and+inhibit+epithelial+cell+growth+without+change+in+intracellular+energy+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores.</a> J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).</li>
<li>Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cook-Mills+J.M.+Human+and+murine+high+endothelial+venule+cells+phagocytose+apoptotic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes.</a> Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Sci. Signal. 2, ra51(2009).</li>
<li>Esmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+neutrophil+granulocytes%3A+diminished+proinflammatory+neutrophil+functions+in+the+presence+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells.</a> J. Immunol. 184, 391-400 (2010).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+exposure+dictates+the+immunogenicity+of+cancer+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death.</a> Nature Med. 13, 54-61 (2007).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).</li>
<li>Sinha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+activates+the+Wnt+and+phosphatidylinositol+3-kinase+Akt+signaling+pathways+to+promote+cell+survival+in+the+absence+of+soluble+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Wakasugi, K., Schimmel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+cytokines+released+from+a+human+aminoacyl-tRNA-synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase.</a> Science. 284, 147-151 (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos aqui um protocolo para a caracterização dos acontecimentos de sinalização intracelular induzida em células viáveis ​​após a sua exposição a células que sofrem apoptose, ou outras formas de morte celular. O protocolo enfatiza os vários mecanismos pelos quais a exposição a células apoptóticas podem modulam vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis. Estes mecanismos incluem: a interacção (via ponte moléculas ou determinantes da superfície sobre a célula morta ou suas vesículas...

Apoptose, ou morte celular regulada 1, contribui de forma essencial para a manutenção e desenvolvimento de tecidos. Vistos os mais simples, as licenças de apoptose envelhecido, danificado ou excesso de células de ser eliminados sem danos a tecidos circundantes 2,3. A contribuição de apoptose para a homeostase dos tecidos, no entanto, é consideravelmente mais dinâmico e variado. As células morrem por apoptose adquirir várias novas actividades, tanto secretada e associada à célula, o que lhes permite influenciar a função de células vivas adjacentes 4-10. Estudos anteriores voltadas para a capacidade das células apoptóticas para suprimir a inflamação 11-16, mas as células apoptóticas também modular uma ampla gama de funções celulares, incluindo actividades vitais tais como a sobrevivência 4,9,10, 4,9,10 proliferação, diferenciação 17, migração de 18 anos, e crescimento de 19. Além disso, estes efeitos não são restritas para os fagócitos profissionais, como macrófagoss, mas se estendem a praticamente todos os tipos de células e linhagens de células, incluindo tradicionalmente não fagocíticas, tais como células epiteliais e endoteliais 7,9,10,18-21. A resposta específica de células vivas adjacentes após a exposição a células apoptóticas depende de vários factores que se relacionam com as células que respondem tanto viáveis ​​e as próprias células apoptóticas. Por exemplo, embora a exposição a células apoptóticas inibe a proliferação de ambas as macrófagos murinos e as células epiteliais tubulares proximais renais (PTECs), estes dois tipos de células diferem dramaticamente na sua resposta de sobrevivência de células apoptóticas 4,6,9,10. Células em apoptose promover a sobrevivência de macrófagos, mas induzir a morte apoptótica de PTECs 4,6,9,10. Notavelmente, a resposta de células apoptóticas podem variar mesmo entre células que respondem da mesma linhagem, dependendo do órgão da célula responder de origem 10 (por exemplo, nos rins contra PTECs epitelial mamáriacélulas) ou do estado de activação 22 (por exemplo, os neutrófilos). Por outro lado, as células apoptóticas podem evocar respostas diferentes na mesma célula, dependendo da natureza do estímulo 10,23 apoptótica ou a fase de apoptose 10,14. Tendo em conta a diversidade e a complexidade da resposta de células apoptóticas, muito cuidado deve ser tomado em dissecar os eventos de sinalização e responsáveis ​​para vias qualquer resultado particular. Em primeiro lugar, as respostas que requerem interação física direta entre células viáveis e apoptóticos devem ser diferenciados daqueles provocada por mediadores solúveis liberados ou geradas pelo celular por apoptose 3,6-10. Se é necessária a interacção física, em seguida, uma maior diferenciação deverá ser executado. eventos de sinalização pode depender de reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, independente de imersão subsequente, ou na captação de fagocitária, independente do receptor específico que se liga a célula apoptótica<html> 3-7,9,10,19. No último caso, a resposta não é específico para células apoptóticas, e pode ser desencadeada por qualquer material fagocítica 4,6. A importância destas diferenças pode novamente ser apreciado por contraste as respostas de macrófagos e PTECs renais. Para ambos os tipos de células, a exposição a células apoptóticas altera a actividade da pró-sobrevivência quinase Akt. A modulação é dependente da interacção física, uma vez que a separação de células apoptóticas e de responder de uma membrana de policarbonato de 0,4 um suprime a resposta 4,9,10,19. No entanto, a resposta de PTECs é mediada pelo receptor e independente de fagocitose, enquanto que a resposta de macrófagos é impulsionado por fagocitose 4,9,10,19. Esta conclusão é reforçada pelo facto de a exposição a esferas de látex, um estímulo neutro fagocitária, não tem nenhum efeito sobre a actividade de Akt em PTECs, mas imita o efeito de células apoptóticas em macrófagos 4,9. &quot;&gt; Embora menos bem estudadas, as células morrem por necrose ou morte acidental de células 1, também modulam a função de células viáveis nas proximidades 3-10,19. Tal como as células apoptóticas, células necróticas exercem os seus efeitos através de uma variedade de mecanismos, nomeadamente a fuga de conteúdo intracelular através da sua membrana celular rompido 3,5,6,9,24. Muitas células, incluindo PTECs e macrófagos, possuem receptores não concorrentes distintos para as células a morrer por necrose 5,9. Engagement desses receptores induz eventos de sinalização que são muitas vezes oposta às induzidas por acoplamento dos receptores de células apoptóticas 4-10,19. por exemplo, em PTECs, células necróticas aumentar a fosforilação da Akt, enquanto que as células apoptóticas diminuir a fosforilação 9,10,19. Aqui, descrevemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular induzidos em PTECs rins viáveis ​​através do reconhecimento mediada pelo receptor de PTECs apoptóticos adjacentes <sup&gt; 9,10,19. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha de células imortalizadas condicionalmente PCTEE conhecidas como células BU.MPT 9,10,19,25,26, é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outros órgãos o rim. Mais importante, a utilização de células apoptóticas, como um estímulo de células coloca certas dificuldades inerentes experimentais não apresentam ligandos solúveis. O mais importante destes é o de que as células apoptóticas deve ser adicionado como uma suspensão em vez de uma solução. Estas dificuldades, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. Quase todas as técnicas descritas no protocolo são simples e padrão de cultura de células. A vantagem deste protocolo reside na sua atenção para os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas modulam a transdução de sinal dentro das células que respondem. Estes mecanismos incluem a ligação via determinantes da superfície ou ponte moléculas a receptores específicos na recelular pondente, a liberação de mediadores solúveis e / ou do envolvimento da máquina fagocítica. células necróticas estão incluídos em todas as experiências para assegurar que os resultados são específicos para o tipo de morte celular, e não uma resposta generalizada de células mortas. A abordagem cuidadosa, como recomendado neste protocolo, é fundamental para a nossa compreensão da influência cada vez maior de que as células morrem exercem sobre os seus vizinhos ao vivo, na saúde e na doença.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais de cultura de células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x com [4,5 g/L] de glicose, &#671;-glutamina e piruvato de sódio-piruvato</td><td>Mediatech (Manassas, VA)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Clone II, soro fetal bovino</td><td>GE Healthcare (Logan, UT)</td><td>SH30066,03</td><td>adicionar 10% (v/v)&nbsp; ao meio de cultura A</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td> <td>10378-016</td><td>adicionar 100 unidades/mL aos meios de cultura A e B</td></tr><tr><td>&gamma;-Interferon, camundongo recombinante, de Escherichia coli</td><td>Calbiochem, Millipore (Billerica, MA)</td><td>407303</td><td>adicionar 10 unidades/mL ao meio de cultura A</td></tr><tr><td>Placas tratadas com cultura de tecidos de poliestireno Falcon, Corning não pirogênico</td><td>(Durham, NC)</td><td>353003</td><td>estéril, Tubos</td></tr> de <tr><td>centrífuga de poliestireno Falcon</td> de 100 mm de diâmetro, fundo cônico <td>Corning (Durham, NC)</td><td>352095</td><td>estéreis, 15 mL</td></tr><tr><td>de tripsina-EDTA, 0,05%, Gibco</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td>25300062</td><td>estéreis, 100 mL</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos e inibidores</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staurosporina, de Streptomyces sp.</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td> <td>S4400</td><td>use em [1 &mu; g/mL] por 3 h para induzir a apoptose</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF), [1 mg/mL]</td><td>Millipore (Billerica, MA)</td><td>EA140</td><td>use a 50 nM para estimular as células respondedoras</td></tr><tr><td>UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>15575-038</td><td>use 5 mM para separar células aderentes</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano, 0,4%</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>91691049</td><td>para coloração de células mortas</td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído, 4% em DPBS</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA)</td> <td>19943</td><td>use 0,4% (v / v) em 1x DPBS para fixação celular</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14040133</td><td>solução de estoque</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), livre de Ca2+- e Mg2+-free, 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14190367</td><td>solução estoque</td></tr><tr><td>Citocalasina D, 4 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), de Zygosporium mansonii</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>C8273</td><td>use em [4 &mu; g/mL] para inibir a fagocitose</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>D2650</td><td>solvente para citocalasina D</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Ingredientes do tampão de lise celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-tampoed salino (TBS), 10x, pH 7,4</td><td>BioRad (Hércules, CA)</td><td>1706435</td><td>para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Pirofosfato</td> <td>de sódioSigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>221368</td><td>10 mM para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D6750</td><td>0,5% p/v para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>L3771&nbsp;</td><td>0,1% p/v para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td> <td>G5516</td><td>10% para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td> <td>450022</td><td>25 mM para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Mini comprimido de coquetel de inibidor de protease sem EDTA completo</td><td>Roche Diagnostics (Indianápolis, IN)</td> <td>4693159001</td><td>para tampão de lise celular, 1 comprimido por 10 mL de tampão</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T8787</td><td>10% para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>11DTT00005</td><td>1 mM para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>4800263</td><td>1 mM para tampão de lise celular</td></tr><tr><td>Ortovandato de sódio</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>2159664</td><td>10 mM para tampão</td></tr> <tr><td>de lise celularNome</td><td>Empresa</td><td>Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T6000B centrífuga</td><td>Du Pont (Wilmington, DE)</td><td>T6000B</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissuemat, banho-maria</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desametrator sônico (sonicador), modelo 100</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diversos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células, Neubauer</td><td>Hawksley (Lancing, Sussex, Reino Unido)</td><td>AC2000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC II</td><td>Millipore (Billerica, MA)</td><td>CBA059</td><td>para coloração PI e Anexina V para determinar o estágio de apoptose</td></tr><tr><td>Tubos microcntrifuge Eppendorf, 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Suporte permeável ao transpoço, 0.4 &mu; m membrana de policarbonato</td><td>Corning (Corning, NY)</td> <td>3413</td><td>estéril, poliestireno, cultura de tecidos tratada</td></tr><tr><td><forte>Nome< / forte</td><td>><forte>Empresa< / forte></td><td><forte>Catálogo< / forte></td><td><forte>Comentários< / forte></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos < / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfoglicogênio sintase quinase-3&alfa;/&beta; (GSK-3&alfa;/&beta;) (Ser21/9), anticorpo policlonal</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9331</td><td>anticorpo policlonal de coelho</td></tr><tr><td>Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) monocorpo monoclonal ( (14C10) )</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>2118</td><td>anticorpo monoclonal de coelho</td></tr></tbody></table>

identificação de sinalização intracelular eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas submetidos a apoptose celular morte

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

As células morrem por apoptose, também conhecida como morte celular regulada, adquirir várias novas actividades que lhes permitam influenciar a função de células vivas adjacentes. actividades vitais, tais como a sobrevivência, a proliferação, crescimento e diferenciação, estão entre as muitas funções celulares modulados por células apoptóticas. A capacidade para reconhecer e responder às células apoptóticas parece ser uma característica universal de todas as células, independentemente da linhagem ou órgão de origem. No entanto, a diversidade e complexidade da resposta às células mandatos apoptóticos que grande cuidado em dissecar os eventos de sinalização e vias responsáveis ​​por qualquer resultado particular. Em particular, deve-se distinguir entre os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas podem influenciar as vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis, incluindo: o reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, libertação de mediadores solúveis pela célula apoptótica, e / ou acoplamento da phagomáquinas cytic. Aqui, nós fornecemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular que são induzidas nas células respondedoras viáveis ​​após a sua exposição a células apoptóticas. Uma grande vantagem do protocolo encontra-se em atenção o que compensa a dissecção do mecanismo pelo qual as células apoptóticas modulam eventos de sinalização dentro de células que respondem. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha imortalizada condicionalmente rato renal proximal tubular de células (células BU.MPT), é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outras do que o rim órgãos. A utilização de células mortas, como um estímulo introduz vários factores exclusivos, que podem dificultar a detecção de eventos de sinalização intracelular. Estes problemas, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. A aplicação deste protocolo deve ajudar o nosso conhecimento expansão da ampla influência que as células mortas ou a morrer exercem sobre os seus vizinhos vivos, tanto na saúde como na diseaSE.

Na Figura 1, é proporcionado um diagrama esquemático que descreve as etapas de temporização e críticos envolvidos na preparação de células apoptóticas (Protocolo 1) e células necróticas (Protocolo 2) e a estimulação de células de resposta com suspensões de células apoptóticas e necróticas (Protocolo 4). Na Figura 2, que fornecem resultados representativos que mostram o efeito de células apoptó...

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar eventos de sinalização induzidos e células respondedoras viáveis após sua interação física com células mortas próximas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia celular, patologia e fisiologia, como a influência que as células mortas ou moribundas exercem sobre seus vizinhos vivos. As principais vantagens dessa técnica são que ela é simples e barata, e que pode ser aplicada para estudar efeitos biológicos induzidos em células vivas após sua interação com células vizinhas submetidas à apoptose.Demonstrando a técnica estará Lanfei Feng, um técnico do meu laboratório. Para iniciar este procedimento depois de passar as células BUNPT para placas de cultura de tecidos tratadas com plasma de gás a vácuo de 100 milímetros, cultive-as em meio de cultura A até a confluência e atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Depois disso, enxágue a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B. Em seguida, induza a apoptose incubando as células no meio de cultura B, contendo estaurosporina, um inibidor não seletivo da proteína quinase, por 3 horas a 37 graus Celsius.Após 3 horas, colete o meio contendo células apoptóticas flutuantes que se desprenderam da monocamada. Em seguida, centrifugue este meio durante dez minutos a 500 vezes G. Em seguida, rejeitar o sobrenadante, lavar o sedimento três vezes com o meio de cultura B, antes de o voltar a adicionar às células aderentes. Após esta etapa de lavagem, separe as células aderentes restantes adicionando 5 EDTA milimolares em 1X DPBS livre de cálcio e magnésio.Recolher o meio que contém as células apoptóticas destacadas e colocar as células separadas com as células apoptóticas flutuantes num tubo centrífugo estéril de poliestireno de 15 mililitros. Em seguida, lave as células apoptóticas três vezes por centrifugação por dez minutos a 500 x G. Seguido de ressuspensão em dez mililitros de DPBS 1X livre de cálcio e magnésio por lavagem. Após a última lavagem, suspenda as células apoptóticas em meio de cultura fresco B a 5x10 ^ 6 células por mililitro, antes de usá-las para estimular as células respondedoras.Alternativamente, fixe as células apoptóticas lavadas em 0,4 paraformaldeído em 1X DPBS por 30 minutos, depois lave-as três vezes com meio de cultura B e suspenda-as a 5x10 ^ 6 células por mililitro antes de usá-las para estimular as células respondedoras. Depois de passar as células BUNPT para placas de cultura de tecidos tratadas com plasma de gás a vácuo de poliestireno estéril de 100 milímetros de diâmetro, cultive-as até a confluência e a atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% sob condições permissivas. Em seguida, enxágue a monocamada de células aderentes três vezes com 10 mL de meio de cultura B por enxágue.Em seguida, desprenda as células adicionando 5 mM de EDTA em 1X DPBS livre de cálcio e magnésio. Recolher as células separadas do meio contendo EDTA e adicionar a suspensão celular a um tubo de centrifugação de poliestireno estéril de 15 ml. Em seguida, lave as células três vezes por centrifugação por dez minutos a 500 vezes G e ressuspensão em 10 mLs de DPBS livre de cálcio e magnésio por lavagem.Após a última lavagem, suspender as células em meio de cultura fresco B a 5x10^6 células por mililitro. Em seguida, induza a necrose aquecendo as células a 70 graus Celsius por 45 minutos em banho-maria, fazendo um vórtice suave dessa suspensão celular a cada dez minutos. Após a indução da necrose, incubar as células por duas horas em uma atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius e agitar suavemente a suspensão celular a cada 15 minutos.Neste procedimento, cultive as células BUNPT em placas estéreis de cultura de tecidos de 100 milímetros sob condições permissivas, até atingirem cerca de 85% de confluência. Em seguida, aspire o meio de cultura A e enxágue as células três vezes com 10 mL de meio de cultura B por enxágue. Em seguida, o soro deixa as células sem álcool no meio de cultura B por 18 a 24 horas em uma atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% em condições não permissivas, a fim de induzir a quiescência.Rotular uma placa de cultura de tecidos separada de células BUNPT confluentes para as seis condições experimentais para o próximo procedimento. Agora, aspire o meio de cultura B dos pratos pré-marcados de células respondedoras quiescentes ao BUNPT. Para preparar os pratos de 100 milímetros em diferentes condições, adicione dois mL de meio de cultura B sem células, a suspensão de células apoptóticas a 5X10 ^ 6 células por mililitro no meio de cultura B ou a suspensão de células necróticas a 5X10 ^ 6 células por mL em meio de cultura B. Alcance uma proporção de células mortas para respondedoras de um para um, adicionando a mL de células mortas a 5X10 ^ 6 células por mililitro a um prato confluente de 100 milímetros, que contém 10X10 ^ 6 células.Agite suavemente os pratos. Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius na atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Após 30 minutos, estimular as células respondedoras com veículo ou 15 nMOL EGF, de acordo com a pré-rotulagem da placa de cultura.Incube as células por 15 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Depois, lave as células mortas adicionando cinco milímetros de DPBS gelado. Agite o prato e aspire o fluido de lavagem.Repita a lavagem três vezes. Em seguida, coloque imediatamente as placas da célula de resposta no gelo para processamento posterior. Esta figura mostra que a exposição de respondedores quiescentes de BUNPT a células apoptóticas por 30 minutos inibiu fortemente a fosforilação basal de GSK3 alfa beta.Para evitar a interação física entre os respondedores BUNPT e as células apoptóticas, os respondedores BUNPT foram cultivados em um sistema de suporte permeável e separados dos alvos apoptóticos por uma membrana de policarbonato de 0,4 mícron. A prevenção da interação física entre os respondedores ao BUNPT e as células apoptóticas aboliu a capacidade dos alvos apoptóticos de inibir a fosforilação da GSK3 alfa beta. Para avaliar o papel da fagocitose, o inibidor do citoesqueleto citocalasina D foi usado para prevenir a captação fagocítica de células mortas.A inibição da fosforilação de GSK3 alfa beta em resposta a células apoptóticas ocorreu na ausência de fagocitose. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 4-6 horas se for realizada corretamente, excluindo o tempo necessário para eletroforese em gel e immunoblotting. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o uso de uma suspensão celular em oposição a um ligante solúvel como estímulo apresenta vários obstáculos experimentais inerentes e em grande parte inevitáveis.Usando o mesmo procedimento, pode-se estudar outras funções celulares, como sobrevivência ou proliferação ou crescimento celular, a fim de determinar as consequências funcionais dos eventos de sinalização que são induzidos em células vivas que respondem após sua interação com células mortas próximas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar eventos de sinalização específicos que são induzidos em células respondedoras viáveis após sua interação física com células mortas próximas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Um fluxo de trabalho usando a centrifugação diferencial ou citometria de fluxo é desenvolvido para detectar, quantificar e isolar corpos apoptotic de uma amostra de apoptotic de alta pureza.

Detecção e isolamento de corpos Apoptotic de alta pureza

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

A apoptose pode ser caracterizada pela análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos precoce e tardio. A linhagem celular de câncer cervical, SiHa, foi analisada para biomarcadores de apoptose após tratamento com Actinomicina D usando citômetro de fluxo de bancada.

Análise por citometria de fluxo de biomarcadores apoptóticos em células de câncer cervical SiHa tratadas com Actinomicina D

Um método para gerar células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de expressão retrovírus mediada ectópica de Oct4, SOX2, KLF4 e MYC é descrito. Uma maneira prática de identificar humanos colônias de IPSC com base na expressão de GFP também é discutida.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Aprenda a identificar eventos de sinalização intracelular em células viáveis após interação com células apoptóticas vizinhas. Este método acessível utiliza células BUNPT e estaurosporina para estudar efeitos biológicos em biologia celular.

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Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

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