Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

O objetivo geral deste procedimento é identificar eventos de sinalização induzidos e células respondedoras viáveis após sua interação física com células mortas próximas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia celular, patologia e fisiologia, como a influência que as células mortas ou moribundas exercem sobre seus vizinhos vivos. As principais vantagens dessa técnica são que ela é simples e barata, e que pode ser aplicada para estudar efeitos biológicos induzidos em células vivas após sua interação com células vizinhas submetidas à apoptose.

Demonstrando a técnica estará Lanfei Feng, um técnico do meu laboratório. Para iniciar este procedimento depois de passar as células BUNPT para placas de cultura de tecidos tratadas com plasma de gás a vácuo de 100 milímetros, cultive-as em meio de cultura A até a confluência e atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Depois disso, enxágue a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B. Em seguida, induza a apoptose incubando as células no meio de cultura B, contendo estaurosporina, um inibidor não seletivo da proteína quinase, por 3 horas a 37 graus Celsius.

Após 3 horas, colete o meio contendo células apoptóticas flutuantes que se desprenderam da monocamada. Em seguida, centrifugue este meio durante dez minutos a 500 vezes G. Em seguida, rejeitar o sobrenadante, lavar o sedimento três vezes com o meio de cultura B, antes de o voltar a adicionar às células aderentes. Após esta etapa de lavagem, separe as células aderentes restantes adicionando 5 EDTA milimolares em 1X DPBS livre de cálcio e magnésio.

Recolher o meio que contém as células apoptóticas destacadas e colocar as células separadas com as células apoptóticas flutuantes num tubo centrífugo estéril de poliestireno de 15 mililitros. Em seguida, lave as células apoptóticas três vezes por centrifugação por dez minutos a 500 x G. Seguido de ressuspensão em dez mililitros de DPBS 1X livre de cálcio e magnésio por lavagem. Após a última lavagem, suspenda as células apoptóticas em meio de cultura fresco B a 5x10 ^ 6 células por mililitro, antes de usá-las para estimular as células respondedoras.

Alternativamente, fixe as células apoptóticas lavadas em 0,4 paraformaldeído em 1X DPBS por 30 minutos, depois lave-as três vezes com meio de cultura B e suspenda-as a 5x10 ^ 6 células por mililitro antes de usá-las para estimular as células respondedoras. Depois de passar as células BUNPT para placas de cultura de tecidos tratadas com plasma de gás a vácuo de poliestireno estéril de 100 milímetros de diâmetro, cultive-as até a confluência e a atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% sob condições permissivas. Em seguida, enxágue a monocamada de células aderentes três vezes com 10 mL de meio de cultura B por enxágue.

Em seguida, desprenda as células adicionando 5 mM de EDTA em 1X DPBS livre de cálcio e magnésio. Recolher as células separadas do meio contendo EDTA e adicionar a suspensão celular a um tubo de centrifugação de poliestireno estéril de 15 ml. Em seguida, lave as células três vezes por centrifugação por dez minutos a 500 vezes G e ressuspensão em 10 mLs de DPBS livre de cálcio e magnésio por lavagem.

Após a última lavagem, suspender as células em meio de cultura fresco B a 5x10^6 células por mililitro. Em seguida, induza a necrose aquecendo as células a 70 graus Celsius por 45 minutos em banho-maria, fazendo um vórtice suave dessa suspensão celular a cada dez minutos. Após a indução da necrose, incubar as células por duas horas em uma atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius e agitar suavemente a suspensão celular a cada 15 minutos.

Neste procedimento, cultive as células BUNPT em placas estéreis de cultura de tecidos de 100 milímetros sob condições permissivas, até atingirem cerca de 85% de confluência. Em seguida, aspire o meio de cultura A e enxágue as células três vezes com 10 mL de meio de cultura B por enxágue. Em seguida, o soro deixa as células sem álcool no meio de cultura B por 18 a 24 horas em uma atmosfera umidificada de dióxido de carbono a 5% em condições não permissivas, a fim de induzir a quiescência.

Rotular uma placa de cultura de tecidos separada de células BUNPT confluentes para as seis condições experimentais para o próximo procedimento. Agora, aspire o meio de cultura B dos pratos pré-marcados de células respondedoras quiescentes ao BUNPT. Para preparar os pratos de 100 milímetros em diferentes condições, adicione dois mL de meio de cultura B sem células, a suspensão de células apoptóticas a 5X10 ^ 6 células por mililitro no meio de cultura B ou a suspensão de células necróticas a 5X10 ^ 6 células por mL em meio de cultura B. Alcance uma proporção de células mortas para respondedoras de um para um, adicionando a mL de células mortas a 5X10 ^ 6 células por mililitro a um prato confluente de 100 milímetros, que contém 10X10 ^ 6 células.

Agite suavemente os pratos. Em seguida, incube-os a 37 graus Celsius na atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Após 30 minutos, estimular as células respondedoras com veículo ou 15 nMOL EGF, de acordo com a pré-rotulagem da placa de cultura.

Incube as células por 15 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono. Depois, lave as células mortas adicionando cinco milímetros de DPBS gelado. Agite o prato e aspire o fluido de lavagem.

Repita a lavagem três vezes. Em seguida, coloque imediatamente as placas da célula de resposta no gelo para processamento posterior. Esta figura mostra que a exposição de respondedores quiescentes de BUNPT a células apoptóticas por 30 minutos inibiu fortemente a fosforilação basal de GSK3 alfa beta.

Para evitar a interação física entre os respondedores BUNPT e as células apoptóticas, os respondedores BUNPT foram cultivados em um sistema de suporte permeável e separados dos alvos apoptóticos por uma membrana de policarbonato de 0,4 mícron. A prevenção da interação física entre os respondedores ao BUNPT e as células apoptóticas aboliu a capacidade dos alvos apoptóticos de inibir a fosforilação da GSK3 alfa beta. Para avaliar o papel da fagocitose, o inibidor do citoesqueleto citocalasina D foi usado para prevenir a captação fagocítica de células mortas.

A inibição da fosforilação de GSK3 alfa beta em resposta a células apoptóticas ocorreu na ausência de fagocitose. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 4-6 horas se for realizada corretamente, excluindo o tempo necessário para eletroforese em gel e immunoblotting. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o uso de uma suspensão celular em oposição a um ligante solúvel como estímulo apresenta vários obstáculos experimentais inerentes e em grande parte inevitáveis.

Usando o mesmo procedimento, pode-se estudar outras funções celulares, como sobrevivência ou proliferação ou crescimento celular, a fim de determinar as consequências funcionais dos eventos de sinalização que são induzidos em células vivas que respondem após sua interação com células mortas próximas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar eventos de sinalização específicos que são induzidos em células respondedoras viáveis após sua interação física com células mortas próximas.