Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é observar a partição de genomas virais em células em divisão. Isso é conseguido primeiramente por meio da construção de um plasmídeo que pode ser visualizado por microscopia de fluorescência. Aqui, um plasmídeo é modificado para incluir repetições em tandem da sequência operadora de lactose ou LAC O. O segundo passo é introduzir o plasmídeo em células em divisão, seguido pela infecção das células com um retrovírus que codifica o repressor de lactose ou lac eye fundido a uma proteína fluorescente.

As proteínas de fusão do repressor da lactose ligam-se especificamente às sequências do operador da lactose no subplasmídeo. As células são monitoradas por microscopia de fluorescência para rastrear plasmídeos individuais ao longo de múltiplos ciclos celulares. Em última análise, as imagens adquiridas são processadas para determinar como os genomas virais são mantidos em células em divisão.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como PCR quantitativa, hibridização Southern blot ou hibridização fluorescente in situ, é que ela permite observar plasmídeos individuais em múltiplos pontos no tempo. Para permitir a visualização do plasmídeo por microscopia de fluorescência, utilizam-se técnicas padrão de clonagem molecular para introduzir um fragmento de DNA contendo aproximadamente 250 cópias da sequência operadora de lactose, ou LAC O, no plasmídeo. Neste exemplo, o plasmídeo é um bacmídeo de aproximadamente 170 pares de quilobases que contém o genoma completo do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi, ou KSHV, e codifica resistência à higromicina.

Introduza o DNA plasmidial contendo LAC O em células de mamífero HeLa e SLK por transfeção em placas de 60 milímetros, incubando as células com 10 microgramas de plasmídeo purificado, 25 microlitros de lipofectamina 2000, 0,5 mililitros de Opti-MEM e 3,5 mililitros de DMEM por quatro horas. Substitua o meio por DMEM contendo 10% de soro bovino fetal e deixe as células recuperarem por 48 horas.

Posteriormente, plaque as células transfectadas em baixa densidade em placas grandes e cultive por três semanas em DMEM com 10% de soro bovino fetal e 300 microgramas por mililitro de higromicina para selecionar o plasmídeo introduzido; utilize pedaços estéreis de tiras e papel de filtro embebido para transferir colônias resistentes à higromicina para novas placas de cultura. Coloque as placas no incubador após uma a duas semanas, quando os clones transfectados tiverem crescido o suficiente para preencher a placa, e isole o DNA para digestão com enzimas de restrição e hibridização Southern a fim de verificar se o polímero do plasmídeo LAC O é homogêneo e possui o tamanho esperado. Este exemplo de hibridização mostra que o polímero LAC O no clone um é homogêneo e idêntico ao do controle positivo.

Na faixa sete, se o plasmídeo não tiver sido projetado para expressar uma fusão do represor de lactose lac eye, infecte clones adequados com um retrovírus codificando lac eye fundido a uma proteína fluorescente vermelha, como lac eye, TD tomate. O TD tomate é escolhido em vez de proteínas que fluorescem mais próximas da cor verde para minimizar a fototoxicidade que ocorreria com múltiplas exposições prolongadas. Após a introdução da proteína de fusão LAC eye, cultive as células na presença de 200 microgramas por mililitro de IPTG para impedir que as proteínas de fusão se liguem ao DNA. Um dos aspectos mais críticos deste procedimento é obter clones com intensidade de fluorescência apropriada.

Um grande número de clones deve ser analisado para identificar aqueles com fluorescência ótima em cultura. Incube as células por pelo menos três dias para permitir a expressão da proteína LAC eye TD-tomate. Analise os clones quanto aos níveis ideais de LAC eye TD-tomate, que revelem sinais distintos com níveis mínimos de fundo de proteína de fusão não ligada. De 24 a 48 horas antes da aquisição de imagens, plaque as células expressando LAC I TD-tomate em uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros com uma densidade inferior a 10% de confluência. Isso permitirá que pares de células se dividam em colônias de oito a 16 células sem sobreposição, uma a três horas antes do início da aquisição de imagens.

Lave a placa três vezes com meio de cultura que não contenha drogas seletivas nem IPTG. Isso remove as células não viáveis e permite que as proteínas de fusão lac eye se liguem às células LAC nos plasmídeos. Substitua o meio de cultura por dois mililitros de DMEM com 10% de soro bovino fetal e 25 milimolar de Hippies. Incube por uma a três horas, logo antes da aquisição de imagens, e substitua a tampa da placa de cultura por uma folha de cultivo esticada em um anel de montagem para uma placa de 35 milímetros.

Esta tampa inibirá a evaporação do meio de cultura, o que aumentaria a concentração de sais ao longo do tempo e mataria as células. O sistema de imageamento utilizado neste experimento consiste em um microscópio invertido Zeiss Axio 200 M, equipado com uma platina motorizada e uma câmera EM CCD para detecção sensível de sinais. A luz de excitação fluorescente é fornecida pelo LED branco neutro de um sistema Collibra.

O sistema de imagem é controlado por um software para aquisições automatizadas de imagens em intervalos prolongados com múltiplas pilhas Z. Um incubador acoplado à platina é utilizado para manter as células a 37 graus Celsius, com 5 a 10% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada. Utilize um colar aquecido para a objetiva de óleo para evitar que a objetiva aspire o óleo.

O calor da amostra permite tempo suficiente para que o sistema atinja uma temperatura estável. Para minimizar artefatos de movimento durante o experimento, o sistema de imagem deve estar apoiado em uma mesa pneumática para ser isolado de vibrações. Para iniciar o procedimento de visualização do DNA marcado, utilize imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) para observar as células e determinar o plano focal da parte superior e inferior das células em múltiplos campos de visão; em cada campo, desloque-se para um plano focal localizado aproximadamente a um terço do caminho a partir do topo da célula e salve as coordenadas x, y, z na lista de posições da platina salvas.

Cada uma dessas posições salvas será o centro de um Z-stack de imagens para capturar a célula no software de controle do microscópio; defina um Z-stack de imagens a ser realizado em cada posição salva da platina, definindo um número suficiente de fatias para que toda a célula seja capturada, juntamente com fatias adicionais acima e abaixo dos planos em que as células estão localizadas. Escolha um tamanho de passo Z entre 0,35 e 0,50 micrômetros para permitir uma amostragem aproximada de Nyquist na dimensão Z. Essas fatias permitem a detecção de movimentos celulares durante o ciclo celular e também são utilizadas no processamento pós-aquisição das pilhas de imagens.

Isso resultará em uma pilha de 40 a 60 imagens, dependendo da espessura das células. Defina um experimento de série temporal para coletar uma imagem de campo claro dos Zacks em intervalos de 30 minutos e imagens de fluorescência em intervalos de 10 a 60 minutos. Não utilize imagem DIC durante o experimento, pois ela exige mais luz do que a imagem de campo claro padrão, o que pode expor desnecessariamente as células à fototoxicidade ao longo de experimentos prolongados.

Inicie o experimento controlado por software. Certifique-se de que o sistema não seja perturbado durante o experimento. Após todas as imagens do experimento terem sido adquiridas, revise as imagens para cada recorte de Zack e ponto temporal, removendo quaisquer áreas desnecessárias das imagens para reduzir o tempo de processamento do computador.

No próximo passo, realocar a intensidade do sinal ao pixel de origem em cada pilha Z. Utilize um algoritmo de desconvolução no software Axio Vision baseado na função de espalhamento pontual medida do sistema de imagem. O resultado da desconvolução é mostrado aqui.

Examine as imagens para acompanhar as alterações na intensidade e os movimentos dos plasmídeos durante o ciclo celular e a partição dos plasmídeos para as células filhas. Essas imagens, geradas computacionalmente para incluir múltiplos planos Z nos quais os diferentes sinais estão localizados, mostram que os núcleos de células HELOC que expressam o marcador fluorescente LAC eye TD tomato são fluorescentes devido ao sinal de localização nuclear presente na proteína de fusão, direcionando-a ao núcleo. Na ausência de I-P-T-G-K-S-H-V, genomas que codificam sequências LAC O recrutam muitas cópias da proteína fluorescente e se destacam como sinais brilhantes sobre a intensidade de fundo do núcleo.

Por outro lado, na presença de IPTG, as proteínas fluorescentes LAC impedem que o olho se ligue à sua sequência de reconhecimento lack O, sendo que projeções de intensidade máxima de Zack adquiridas em uma célula ao longo de cinco momentos temporais em um experimento representativo são mostradas nesta figura. Os genomas virais marcados fluorescentemente na célula visíveis no painel A são sintetizados conforme mostrado no painel B. Os genomas virais são então particionados para as células filhas durante a divisão celular, conforme observado nos painéis C, D e E. O ciclo celular para células HELOC saudáveis leva aproximadamente 24 horas, e as células filhas normalmente se aderem próximas umas às outras e continuam a se dividir ao mesmo tempo no próximo ciclo celular.

Utilizando este protocolo, os genomas virais na célula podem ser acompanhados por múltiplas gerações durante a realização deste procedimento. É importante lembrar de observar a morfologia celular no tempo de geração para garantir que as células permaneçam saudáveis ao longo do experimento.