Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é observar a partição dos genomas virais nas células em divisão. Isso é feito primeiro fazendo um plasmídeo que pode ser visualizado por microscopia de fluorescência. Aqui, um plasmídeo é projetado para incluir repetições em tandem da sequência do operador de lactose ou LAC O. O segundo passo é introduzir o plasmídeo nas células em divisão, seguido pela infecção das células com um retrovírus que codifica o repressor de lactose ou olho lac fundido a uma proteína fluorescente.

As proteínas de fusão repressoras de lactose ligarão especificamente as sequências operadoras de lactose no sub plasmídeo. As células são monitoradas por microscopia de fluorescência para rastrear plasmídeos individuais por meio de vários ciclos celulares. Em última análise, as imagens adquiridas são processadas para determinar como os genomas virais são mantidos nas células em divisão.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como PCR quantitativo, Southern blotting ou hibridização in situ fluorescente, é que esta técnica permite que plasmídeos individuais sejam observados em vários pontos no tempo. Para permitir a visualização do plasmídeo por microscopia de fluorescência, técnicas padrão de clonagem molecular são usadas para introduzir um fragmento de DNA contendo aproximadamente 250 cópias da sequência do operador de lactose ou LAC O no plasmídeo. Neste exemplo, o plasmídeo é um meio traseiro de aproximadamente 170 pares de quilobases que contém todo o genoma do vírus do herpes associado ao sarcoma de cap ou KSHV e codifica a resistência à higromicina.

Introduza o DNA do plasmídeo contendo LAC O em células de mamíferos hela e SLK por transfecção Em placas de 60 milímetros, incube as células com plasmídeo purificado de 10 microgramas, DNA 25 microlitros, lipectomia, 2000 0,5 mililitros, Optum e 3,5 mililitros. DMEM por quatro horas. Mude o meio para DMEM com 10% de soro fetal bovino e permita que as células se recuperem por 48 horas.

Posteriormente, coloque as células transfectadas em baixa densidade em placas grandes e cultive por três semanas em DMEM com 10% de soro bovino fetal e 300 microgramas por mililitro de higromicina para selecionar o plasmídeo introduzido, use pedaços de viagens estéreis e papel de filtro embebido para transferir colônias resistentes à higromicina para novas placas de cultura. Coloque as placas na incubadora após uma a duas semanas, quando os clones transfectados tiverem crescido para preencher o DNA isolado da placa para digestão de restrição e southern blotting para garantir que o polímero do plasmídeo LAC O seja homogêneo e do tamanho esperado. Este exemplo de blot mostra que o polímero LAC O no clone um é homogêneo e idêntico ao do controle positivo.

Na pista sete, se o plasmídeo não tiver sido projetado para expressar uma fusão do olho lac repressor de lactose, infecte clones adequados com um retrovírus que codifica o olho lac fundido a uma proteína fluorescente vermelha, como olho lac, tomate TD, tomate TD é escolhido em vez de proteínas que fluorescem mais perto do verde para minimizar a fototoxicidade que ocorreria de múltiplas exposições por longos tempos. Uma vez que a proteína de fusão ocular LAC é introduzida, cultive as células na presença de 200 microgramas por mililitro IPTG para bloquear as proteínas de fusão de se ligarem ao DNA. Um dos aspectos mais críticos deste procedimento é a obtenção de clones com a intensidade de fluorescência adequada.

Um grande número de clones deve ser rastreado para identificar aqueles com cultura de fluorescência ideal. As células por pelo menos três dias para permitir a expressão dos clones de tela de proteína de tomate LAC eye TD para aqueles com níveis ideais de olho lac, tomate TD que revelam sinais distintos com níveis mínimos de fundo de proteína de fusão não ligada, 24 a 48 horas antes de obter imagens das células que expressam o tomate LAC I TD colocam-nas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros a uma densidade inferior a 10% de confluência. Isso permitirá que pares de células se dividam em colônias de oito a 16 células sem se sobrepor uma a três horas antes do início da imagem.

Enxágue a placa três vezes com meio de cultura que não contenha drogas seletivas e IPTG. Isso lava as células não viáveis e permite que as proteínas de fusão do olho lac se liguem aos citos LAC nos plasmídeos. Substitua o meio de cultura por dois mililitros, DMEM por 10% de soro bovino fetal e 25 milimolares Hippies incubam por uma a três horas antes da imagem substitua a parte superior da placa de cultura por papel alumínio esticado em um anel de montagem para uma placa de 35 milímetros.

Essa cobertura inibirá a evaporação do meio de cultura, o que aumentaria a concentração de sal ao longo do tempo e mataria as células. O sistema de imagem utilizado neste experimento consiste em um microscópio invertido Zeiss Axio 200 M, equipado com uma platina motorizada e uma câmera EM CCD para detecção sensível de sinais. A luz de excitação fluorescente é fornecida pelo LED branco neutro de um sistema Collibra.

O sistema de imagem é controlado por um software para aquisições automatizadas de imagens em intervalos de longo prazo com várias pilhas Z. Uma incubadora de topo de estágio é usada para manter as células a 37 graus Celsius, cinco a 10% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada. Use um colar aquecido para a objetiva de óleo para evitar que a objetiva seja sifonada.

O calor da amostra permite tempo suficiente para que o sistema atinja uma temperatura estável. Para minimizar os artefatos de movimento durante o experimento, o sistema de imagem deve ficar em uma mesa de ar para ser isolado das vibrações. Para iniciar o procedimento de visualização do DNA marcado, use a imagem DIC para visualizar as células e determinar o plano focal da parte superior e inferior das células em vários campos de visão em cada campo, mova para um plano focal a aproximadamente um terço do caminho para baixo do topo da célula, salve o x, y, Z na lista de posições de palco salvas.

Cada uma dessas posições salvas será o centro de um Zack de imagens para capturar a célula no software de controle do microscópio, definir um Zack de imagens a serem executadas em cada posição de platina salva, definir fatias suficientes para que toda a célula seja capturada junto com fatias extras acima e abaixo dos planos em que as células estão localizadas. Escolha um tamanho de passo Z de 0,35 a 0,50 mícrons para permitir a amostragem aproximada de nyquist na dimensão Z. Essas fatias permitem a detecção após os movimentos das células durante o ciclo celular e também são usadas no processamento pós-aquisição das pilhas de imagens.

Isso resultará em uma pilha de 40 a 60 imagens, dependendo da espessura das células. Defina um experimento de série temporal para coletar uma imagem de campo brilhante dos Zacks em intervalos de 30 minutos e imagens de fluorescência em intervalos de 10 a 60 minutos. Não use imagens DIC durante o experimento, pois requer mais luz do que as imagens de campo claro padrão, o que pode expor as células desnecessariamente à fototoxicidade ao longo de longos experimentos.

Inicie o experimento controlado por software. Certifique-se de que o sistema não seja perturbado durante o experimento. Depois que todas as imagens do experimento forem adquiridas, revise as imagens de cada Zack e o ponto de tempo corte todas as áreas desnecessárias das imagens para reduzir o tempo de processamento do computador.

Na próxima etapa, reatribua a intensidade do sinal ao pixel de origem em cada pilha Z. Use um algoritmo de deconvolução no software de visão Axio com base na função de propagação de pontos medidos do sistema de imagem. O resultado da deconvolução é mostrado aqui.

Examine as imagens para rastrear as mudanças de intensidade e movimentos dos plasmídeos durante o ciclo celular e a partição dos plasmídeos em células-filhas. Essas imagens, que são feitas computacionalmente para incluir vários planos Z nos quais residem os diferentes sinais, mostram que os núcleos das células HELOC que expressam o tomate LAC eye TD são fluorescentes devido ao sinal de localização nuclear na proteína de fusão, localizando-a no núcleo. Na ausência de I-P-T-G-K-S-H-V, os genomas que codificam as sequências LAC O recrutam muitas cópias da proteína fluorescente e se destacam como sinais brilhantes sobre a intensidade de fundo do núcleo.

Em contraste, na presença de IPTG, as proteínas fluorescentes oculares LAC são impedidas de se ligar ao seu reconhecimento sem sequência O, projeções de intensidade máxima de Zack adquirido de um ciclo celular em cinco momentos. Os pontos em um experimento representativo são mostrados nesta figura. Os genomas virais marcados com fluorescência na célula visível no painel A são sintetizados no mostrado no painel B.Os genomas virais são então particionados em células-filhas durante a divisão celular, conforme observado nos painéis C, D e E.O ciclo celular para células HELOC saudáveis leva aproximadamente 24 horas, e as células-filhas normalmente se ligam próximas umas das outras e se dividem ao mesmo tempo no próximo ciclo celular.

Usando este protocolo, os genomas virais na célula podem ser seguidos por várias gerações ao tentar este procedimento. É importante lembrar de observar a morfologia celular em tempo de geração para garantir que as células estejam saudáveis durante todo o experimento.