Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

O objetivo deste procedimento é expor células cultivadas em 3D ao fluxo de fluido intersticial e quantificar os efeitos mediados pelo fluxo na invasão celular. Isso é realizado primeiramente preparando uma solução de gel composta por colágeno do tipo I e matrigel. O segundo passo é adicionar uma concentração especificada de células à solução de gel.

Em seguida, a suspensão celular é adicionada a um transwell com diâmetro de 12 milímetros e poros de oito mícrons e incubada a 37 graus Celsius até que a matriz forme gel. O passo final no preparo do ensaio é adicionar quantidades específicas de meio aos transwells para criar condições estáticas e de fluxo. Vinte e quatro horas depois, as membranas dos transwells são fixadas, coradas e visualizadas para a quantificação do número de células invadidas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como as câmaras de fluxo intersticial microfluídicas, é que ela não requer bombas nem equipamentos especializados, e permite aos pesquisadores testar múltiplas condições ou tratamentos de forma fácil e rápida. Embora este método possa fornecer informações sobre a migração e invasão celulares, ele também pode ser utilizado ou aplicado para estudar o efeito do fluxo de fluido intersticial sobre outros comportamentos celulares relevantes, como expressão proteica, proliferação celular e alterações na sinalização celular. Demonstrando este procedimento estará um LIMA two chaa.

Um estudante de pós-graduação no meu laboratório inicia este procedimento colocando uma pequena alíquota de matrigel em gelo a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare a receita do gel com água estéril de PBS, hidróxido de sódio, matrigel e colágeno tipo I de cauda de rato. Depois, misture os componentes do gel em gelo na mesma sequência e incube a solução final por uma hora a quatro graus Celsius.

Agora, coloque um inserto de cultura celular de oito micro po com diâmetro de 12 milímetros em uma placa de 12 poços utilizando um par de pinças esterilizadas. Em seguida, conte as células e re-suspenda-as em meio livre de soro a cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro, adicione 100 microlitros de suspensão celular a 900 microlitros de solução de gel. Depois disso, misture-as completamente pipetando suavemente para cima e para baixo.

Posteriormente, adicione 150 microlitros da mistura final a cada inserto. Em seguida, transfira os insertos para uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos, até que o gel polimerize. Para a condição estática, adicione 100 microlitros do meio sem soro sobre o gel e 1.200 microlitros sob o inserto.

Os níveis de fluido dentro e fora do inserto no poço devem ser aproximadamente iguais, resultando em uma diferença de pressão mínima através do gel e ausência de fluxo intersticial. Para a condição de fluxo, adicione 100 microlitros do meio sem soro sob o inserto e 650 microlitros acima do gel. Ao mesmo tempo, procure evitar a formação de bolhas de ar sob o inserto, pois elas impedirão as células de migrar através da membrana nesses locais.

Em seguida, coloque a placa em um incubador com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 24 horas. Nesta etapa, adicione 500 microlitros de PBS uma vez por poço em uma nova placa de 24 poços para lavar os insertos. Em seguida, remova o meio remanescente na porção superior dos poços de fluxo.

Em seguida, utilize cotonetes para remover o gel dos insertos. Limpe a superfície superior da membrana para remover as células não VA. Em seguida, lave os insertos colocando-os na placa de 24 poços contendo PBS uma vez por 15 segundos.

Em seguida, remova o PBS e adicione 500 microlitros de paraformaldeído a 4% sob cada inserto. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente para fixar as células transmigradas. Em seguida, remova o PFA e lave uma vez com 500 microlitros de PBS para remover o fixador residual.

Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de Triton X-100 0,5% abaixo dos inserts e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Para permeabilizar as células, corte as membranas do insert com uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque-as em 100 microlitros de DPI a dois microgramas por mililitro em solução de PBS 1x.

Tendo o cuidado de posicionar o lado inferior da membrana voltado para baixo. A solução de DPI deve ser preparada alguns minutos antes do uso e mantida no escuro. Agora, envolva a placa com papel alumínio.

Coloque-o em um agitador a 150 RPM por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as membranas com 500 microlitros de PBS uma vez e coloque-as novamente no agitador por 10 minutos. Para remover o jy livre, repita a lavagem outras duas vezes.

O próximo passo é colocar as membranas sobre lâminas de vidro com as células transmigradas voltadas para cima. Adicione solução de montagem às membranas. Em seguida, cubra-as com lamínulas.

Posteriormente, conte a coloração do citoplasma em relação aos núcleos e calcule o número de células invadidas de acordo com o manuscrito anexo. Esta figura mostra as células MDA MB 4 35 s transmigradas na membrana. As células invadidas foram fixadas após o ensaio de invasão por fluxo de fluido intersticial e coradas com DPI e foid conjugado com Alexa Fluor 4 88 para facilitar a contagem das células invadidas.

Esta é a membrana em campo claro e aqui estão os núcleos corados com DAPI. A Alexa Fluor 488, corada com F-actina, é mostrada aqui. Este gráfico mostra que a invasão de células de melanoma metastático MDA MB 435 s foi significativamente aumentada pelo fluxo intersticial.

Após 24 horas, os resultados são normalizados pela média da condição de invasão estática e a média de seis inserts de cultivo celular é apresentada. A diferença entre as condições é estatisticamente significativa, com um valor de P de 0,003. Uma vez dominado, o ensaio de fluxo de fluido intersticial pode ser montado em duas horas, seguido por uma incubação de 24 horas e, em seguida, mais duas horas para fixação e coloração das membranas transwell.

Após este procedimento, células, proteínas ou ácidos nucleicos podem ser facilmente extraídos para responder perguntas adicionais, como a forma como a expressão gênica e proteica muda em resposta ao fluxo de fluido intersticial. Desde seu desenvolvimento, este se tornou um ensaio essencial para pesquisadores que estudam os efeitos do fluxo intersticial sobre células cancerígenas.