Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

O objetivo deste procedimento é expor células cultivadas em 3D ao fluxo de fluido intersticial e quantificar os efeitos mediados pelo fluxo na invasão celular. Isso é feito preparando primeiro uma solução de gel composta por colágeno tipo um e matrigel. O segundo passo é adicionar uma concentração especificada de células à solução de gel.

Em seguida, a suspensão celular é adicionada a um transwell de 12 milímetros de diâmetro e tamanho de poro de oito mícrons e incubada a 37 graus Celsius até que a matriz gelifique. A etapa final na configuração do ensaio é adicionar quantidades específicas de meio aos transwells para criar condições estáticas e de fluxo. 24 horas depois, as membranas transwell são fixadas, coradas e visualizadas para a quantificação do número de células invadidas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como câmaras de fluxo microfluídico e intersticial, é que ela não requer bombas ou equipamentos especializados e permite que os pesquisadores testem várias condições ou tratamentos com facilidade e rapidez. Embora esse método possa fornecer informações sobre a migração e invasão celular, ele também pode ser usado ou aplicado para estudar o efeito do fluxo de fluido intersticial em outros comportamentos celulares relevantes, como expressão de proteínas, proliferação celular e alterações na sinalização celular. Demonstrando este procedimento será um LIMA dois chaa.

Um estudante de pós-graduação em meu laboratório Comece este procedimento jogando uma pequena alíquota de gel matri no gelo a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare a receita do gel com água estéril PBS, hidróxido de sódio, matrigel e colágeno tipo um de cauda de rato. Em seguida, misture os componentes do gel no gelo na mesma sequência e incube a solução final por uma hora a quatro graus Celsius.

Agora coloque uma inserção de cultura de oito células micro po de 12 milímetros de diâmetro em uma placa de 12 poços usando um par de pinças esterilizadas. Em seguida, conte as células e ressuspenda-as em meio livre de soro em cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro, adicione 100 microlitros de suspensão celular a 900 microlitros de solução em gel. Depois disso, misture-os bem pipetando suavemente para cima e para baixo.

Posteriormente, adicione 150 microlitros da mistura final a cada inserção. Em seguida, transfira as inserções para uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5% por 30 minutos até que o gel polimerize. Para a condição estática, adicione 100 microlitros do meio livre de soro em cima do gel e 1.200 microlitros de microlitros sob a inserção.

Os níveis de fluido dentro e fora do inserto no poço devem ser aproximadamente iguais, resultando em uma diferença mínima de pressão no gel e nenhum fluxo intersticial. Para a condição de fluxo, adicione 100 microlitros do meio livre de soro sob a inserção e 650 microlitros acima do gel. Ao mesmo tempo, tente evitar a criação de bolhas de ar sob a inserção, pois elas impedirão que as células migrem através da membrana nesses locais.

Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5% por 24 horas. Nesta etapa, adicione 500 microlitros de uma vez PBS por poço em uma nova placa de 24 poços para lavar as inserções. Em seguida, remova o meio restante na parte superior dos poços de tendências de fluxo.

Em seguida, use cotonetes para remover o gel das inserções. Limpe a parte superior da superfície da membrana para remover as células não-VA. Em seguida, lave as inserções colocando-as na placa de 24 poços contendo uma vez PBS por 15 segundos.

Depois disso, remova o PBS e adicione 500 microlitros de formaldeído a 4% embaixo de cada inserção. Incube-os por 30 minutos em temperatura ambiente para fixar as células transmigradas. Em seguida, remova o PFA e enxágue-os uma vez com 500 microlitros uma vez PBS para remover o fixador residual.

Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de Triton X 100 a 0,5% sob as inserções e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Para permanenteizar as células, corte as membranas da inserção usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque-os em 100 microlitros de dois microgramas por mililitro DPI em uma solução PBS de uma vez.

Tenha o cuidado de colocar a parte inferior da membrana voltada para baixo. A solução de DPI deve ser preparada alguns minutos antes do uso e mantida no escuro. Agora embrulhe o prato em papel alumínio.

Coloque-o em uma coqueteleira a 150 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as membranas em 500 microlitros uma vez PBS e coloque-as de volta no shaker por 10 minutos. Para remover o jy livre, repita a lavagem mais duas vezes.

O próximo passo é colocar as membranas em lâminas de vidro com as células transmigradas voltadas para cima. Adicione a solução de montagem às membranas. Em seguida, cubra-os com lamínulas.

Depois, conte a mancha manchada em núcleos e calcule o número de células invadidas de acordo com o manuscrito que o acompanha. Esta figura mostra as células MDA MB 4 35 s transmigradas na membrana. As células invadidas foram fixadas após o ensaio de invasão do fluxo de fluido intersticial e coradas com DPI e Alexa Fluor 4 88 conjugado para facilitar a contagem das células invadidas.

Esta é a membrana sob campo claro e aqui estão os núcleos de manchas manchadas. O Alexa Fluor 4 88 foid em corado com F actina são mostrados aqui. Este gráfico mostra que a invasão de células de melanoma metastático MDA MB 4 35 s foi significativamente aumentada pelo fluxo intersticial.

Após 24 horas, os resultados são normalizados para a média da condição de invasão estática e a média de seis inserções de cultura de células é apresentada. A diferença entre as condições é estatisticamente significativa com um valor de P de 0,003. Uma vez dominado, o ensaio de fluxo de fluido intersticial pode ser configurado em duas horas, seguido por uma incubação de 24 horas e, em seguida, duas horas para fixar e colorir as membranas transformadoras.

Após esse procedimento, células, proteínas ou ácidos nucléicos podem ser facilmente extraídos para responder a perguntas adicionais, como como a expressão gênica e proteica muda em resposta ao fluxo de fluido intersticial. Desde o seu desenvolvimento, este tornou-se um ensaio essencial para pesquisadores que estudam os efeitos do fluxo intersticial nas células cancerígenas.