Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar seu desenvolvimento em camundongos por citometria de fluxo. Isso é conseguido preparando suspensões de células únicas do camundongo, timo e baço. Como segundo passo, os timócitos e citos são corados com um coquetel de anticorpos para a identificação de populações específicas.

Em última análise, a frequência e o número de várias populações de linfócitos podem ser avaliados por análise de citometria de fluxo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no desenvolvimento de células T, como quais genes e vias são importantes para gerar um repertório de células T funcional, mas tolerante a células. Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de células T no timo, ele também pode ser aplicado no exame do desenvolvimento de outras células imunológicas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades no design de seus coquetéis de anticorpos para citometria de fluxo. Antes de iniciar a dissecação, coloque uma tela de malha de aço estéril em uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Em seguida, adicione cinco mililitros de HBSS ao prato e guarde o prato no gelo para colher o timo.

Primeiro, use uma pinça para levantar a ponta inferior do esterno e revelar o diafragma. Em seguida, evitando o fígado, corte o diafragma para separar a caixa torácica e, em seguida, corte a caixa torácica para cima de cada lado. Tomando cuidado para evitar os pulmões e o coração.

Agora use a pinça para puxar suavemente a caixa torácica para trás. O timo é um órgão bilobado branco localizado acima do coração. Use a borda plana da pinça para segurar a parte inferior dos lóbulos.

Em seguida, puxe suavemente o timo para fora e coloque-o em uma das telas de malha previamente preparadas. Para colher o baço, faça uma incisão através do peritônio para expor a cavidade abdominal. O baço é um órgão vermelho em forma de prancha de surf localizado no lado esquerdo da cavidade abdominal do camundongo, abaixo do fígado.

Em seguida, use um par de pinças para retirar o baço e outro para retirar o tecido conjuntivo. Em seguida, coloque o baço dissecado em uma tela de malha separada. Agora use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para triturar cada órgão em sua tela de malha até que apenas o tecido conjuntivo e a gordura permaneçam pipetar as células e o HBSS em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, enxágue cada malha com HBS S3 fresco. Em seguida, faça uma pelota nas células por cinco minutos a 335 vezes G e quatro graus Celsius. Depois de aspirar o resus sobrenadante, suspenda os citos em 500 microlitros de um tampão de lise CK por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto os glóbulos vermelhos esplênicos estão sendo deitados Resus.

Suspenda os timócitos em 20 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em tampão de fax e coloque-os de lado no gelo. Agora adicione cinco mililitros de HBSS para retornar os citos à isotonicidade depois de girar as células novamente, resus suspende o pellet livre de hemácias em 20 vezes 10 elevado às sextas células por mililitro em tampão de fax. Comece esta etapa por Ali Watting.

Quatro vezes 10 elevado ao sexto dos TIMÓCITOS reservados por amostra de citometria de fluxo para cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione citos aos poços de uma placa de 96 poços para controles de compensação. Em seguida, bloqueie os receptores FC em cada uma das amostras de células por incubação com anti CD 1632 por 10 minutos no gelo.

Agora gire a placa para baixo e, em seguida, dissipe o líquido dos poços, sacudindo a placa uma vez virada para baixo em uma pia, em seguida, suspenda cada poço em 200 microlitros de buffer de fax e repita a lavagem. Em seguida, incubar as amostras experimentais com 200 microlitros de coquetel de anticorpos ou anticorpos conjugados com fluorocromo único para os controles de compensação. Tudo em buffer de fax no gelo no escuro.

Após 30 minutos, lave as células duas vezes com tampão de fax e, em seguida, após suspender as células em tampão de fax, transfira as amostras para tubos de fax em modelos transgênicos TCR fisiológicos e camundongos do tipo selvagem. A seleção positiva começa no estágio de brilho positivo duplo antes de passar para o estágio de opacidade positivo duplo. Após o antígeno encontrar os timócitos duplos positivos opacos, em seguida, entrar em um estágio de transição CD quatro positivo CD oito baixo antes de se tornar CD quatro.

Timócitos únicos positivos ou CD oito únicos positivos Os timócitos simples positivos maduros são caracterizados por sua alta expressão de TCR e perda de CD 24. Embora o perfil CD oito por CD quatro possa revelar defeitos na seleção positiva, examinar o TCR beta por CD 69 ou CD cinco pode fornecer mais informações sobre onde está o defeito. Tanto o CD 69 quanto o CD cinco são regulados positivamente após a estimulação do TCR com interações mais fortes levando a uma maior expressão desses marcadores.

Neste gráfico TCR beta por CD 69 em um camundongo selvagem, a marcha TCR R beta baixa CD 69 negativa representa uma população de timócitos duplo-positivos pré-seleção. Considerando que esta marcha positiva intermediária TCR beta CD 69 representa uma população de transição diretamente após o engajamento do TCR e consiste em duplo positivo brilhante com algumas células duplamente positivas maçantes e CD quatro positivas CD oito células baixas. Aqui, a marcha positiva TCR R beta high CD 69 ilustra a população de células diretamente após a seleção positiva, que consiste em células duplamente positivas de CD maçante quatro positivas, CD oito baixas e CD quatro células únicas positivas.

Finalmente, esta marcha TCR beta alta CD 69 negativa mostra uma população mais madura de células que consiste principalmente em células positivas únicas CD quatro e CD oito. A ausência das populações TCR R beta intermediária CD 69 positiva e TCR R beta alta CD 69 positiva pode ser indicativa de alterações de seleção positiva prejudicadas na proporção do CD quatro único positivo para CD oito. Células positivas únicas dentro da população TCR beta alta CD 69 negativa podem sugerir alterações no comprometimento da linhagem.

A perda das populações positivas para TCR beta alto CD 69 positivo e TCR beta alto alto CD 69 negativo pode refletir problemas de sobrevivência após a seleção positiva. Examinar o TCR beta pelo CD cinco é outra estratégia para identificar populações de seleção pré e pós-positivas. Essas duas primeiras populações consistem principalmente de timócitos brilhantes duplos positivos.

A população baixa de CD cinco de TCR beta baixa representa timócitos duplos positivos de pré-seleção, e a população intermediária de CD cinco de TCR beta é composta pelas células que iniciam a seleção positiva. A geração prejudicada desta ou da população anterior sugere seleção positiva defeituosa. A população TCR R beta intermediária CD cinco alta, no entanto, representa timócitos em processo de seleção positiva e consiste principalmente de duplo positivo maçante e CD quatro positivo.

CD oito timócitos baixos. A população TCR beta alta CD cinco altas consiste principalmente de seleção pós-positiva. Os timócitos positivos únicos mudam na proporção de CD quatro, positivos únicos para CD oito.

Células positivas únicas dentro desta população, apesar das populações precedentes normais, podem sugerir alterações no comprometimento da linhagem. Além disso, a ausência dessa população pode indicar uma diminuição da sobrevida dos timócitos após a seleção positiva, pois a seleção negativa envolve a deleção de pequenas populações específicas de antígenos. Defeitos neste processo são melhor observados usando camundongos transgênicos TCR em HY CD quatro timócitos de camundongos expressando o HYT transgênico

O H-Y-T-C-R reconhece o antígeno HY específico do sexo masculino apresentado no MHC Classe um db. Assim, HY CD quatro camundongos machos sofrem seleção negativa de timócitos H-Y-T-C-R positivos, conforme indicado por uma redução no número de timócitos duplo-positivos T três vírgula 70 positivos e uma diminuição mais dramática no número de timócitos positivos de T 3,7 CD oito positivos. Em contraste, HY CD quatro camundongos fêmeas sofrem seleção positiva para gerar T 3,7 CD positivo oito células T positivas simples.

Embora uma redução no número de timócitos duplos positivos seja indicativa de seleção negativa, a ausência de timócitos positivos únicos específicos do antígeno é a medida mais precisa. Um exame mais aprofundado dos poucos timócitos T três vírgula 70 positivos CD oito únicos positivos em HY CD quatro camundongos machos revela que a maioria são células imaturas CD 24 altas. Enquanto a maioria dos timócitos T três vírgula 70 CD positivos oito únicos positivos no HY CD quatro fêmeas atingiram a maturidade e são CD 24 baixos, fornecendo suporte adicional, essa seleção negativa ocorre em HY CD quatro camundongos machos.

Uma ressalva dos modelos transgênicos TCR é que é difícil caracterizar ainda mais a seleção positiva identificando populações com base na expressão de TCR e CD 69 ou CD cinco devido à alta expressão de TCR ao longo do desenvolvimento de seu CYTE, HY CD quatro camundongos fêmeas têm uma grande população de timócitos T três vírgula 70 positivos duplo-positivos que sofrem seleção positiva. Conforme indicado por um aumento na população positiva para CD 69 em comparação com a seleção negativa do tipo selvagem, envolve um estímulo TCR de maior afinidade do que a seleção positiva. Isso é indicado pela maior expressão de CD 69 em timócitos T três vírgula 70 duplo-positivos duplo-positivos em camundongos machos HY CD, quatro resultando em um deslocamento do pico do histograma para a direita.

Tendências semelhantes são observadas com a expressão de CD cinco ao analisar a seleção tímica em camundongos geneticamente manipulados. O exame da expressão de CD 69 ou CD cinco pode determinar se o defeito está na sinalização do TCR ou em um resultado a jusante da estimulação do TCR. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em duas horas e meia para preparação e coloração celular, além de uma hora adicional para coleta de dados no citômetro de fluxo.

Se executado corretamente, cada mouse adicional adicionará aproximadamente 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear os timócitos com cuidado e garantir que você planejou a estratégia de coloração com antecedência. Seguindo este procedimento.

Outros ensaios, como ensaios de morte ou ensaios de produção de citocinas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se os timócitos exportados funcionam adequadamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar o desenvolvimento do sítio tímico usando citometria de fluxo.