Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por Plasmodium falciparum infectados em uma configuração com poucos recursos

Este procedimento oferece algumas diretrizes padronizadas para realizar ensaios de agregação mediados por plaquetas de isolados clínicos ou laboratoriais de Plasmodium falsa parem. Primeiro, colete sangue de um paciente infectado e obtenha eritrócitos parasitados por centrifugação, em seguida cultive e purifique as formas assexuadas maduras. Em seguida, colete sangue de um doador saudável para preparar e padronizar o plasma rico em plaquetas por centrifugação.

Combine as plaquetas e os eritrócitos parasitados para o ensaio de agregação. Diz-se que os resultados da microscopia de imunofluorescência podem mostrar agregados de P. falciparum mediados por plaquetas. Esta técnica é especificamente projetada para medir o fenótipo de agregação do plasmodium sra.

Isolados clínicos em um ambiente com recursos limitados. Pequenas variações nos procedimentos têm sido relatadas como capazes de aumentar a influência no resultado do ácido de enovelamento no campo. Por conseguinte, era necessário um protocolo claro e fácil de seguir, adaptado a ambientes com poucos recursos, para padronizar os procedimentos nos locais endêmicos de malária. Em um vacutainer com citrato de sódio, colete aproximadamente cinco mililitros de sangue total de um hospedeiro não exposto à malária ou 2,5 mililitros de sangue de pacientes com malária CM ou SM.

Centrifugue o sangue total a 250 Gs durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante turvo para um tubo limpo de 15 mililitros. Lembre-se de que as plaquetas são facilmente ativadas por variações de temperatura e choques físicos.

Conte a suspensão de PRP utilizando um bower de contagem, hemocitômetro, e ajuste à concentração desejada com PBS para obter o pellet de plasma pobre em plaquetas; separe a maioria das plaquetas de uma porção da fração de PRP por centrifugação a 1500 ×g por 10 minutos. Armazene as frações de PRP e PPP a quatro graus Celsius por até oito a 10 dias. Idealmente, utilize plaquetas frescas para o ensaio de agregação.

Lave os glóbulos vermelhos periféricos em pellet três vezes com cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 em um frasco de cultura. Suplemente os GRP com meio de cultura padrão para malária e glóbulos vermelhos não infectados frescos para obter um hematócrito de 5%. Sature os frascos de cultura com uma mistura de 92,5% de nitrogênio, 2,5% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, feche-os e cultive para obtenção de parasitas maduros a partir de PBMCs do paciente.

Incube o frasco de cultura por 24 a 36 horas em uma estufa a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Coloque aproximadamente 10 a 15 microlitros de sangue em uma extremidade de uma lâmina de vidro fosca apoiada sobre uma superfície plana. Toque a gota de sangue com a borda de uma segunda lâmina até que o sangue se espalhe uniformemente pela borda da segunda lâmina, mantendo esta lâmina em um ângulo de 45 graus.

De forma rápida mas suave, sem exercer muita pressão, espalhe uniformemente o sangue pelo primeiro lâmina. Em seguida, seque ao ar a película fina de sangue e desidrate a área do espécime com metanol durante 10 segundos. Depois, seque novamente ao ar e, a seguir, imerja o espécime em 2%keem.

Mantenha por pelo menos 10 minutos. Lave abundantemente até que a água saia limpa e seque ao ar. Examine as amostras sob uma lente de imersão a óleo de 100 x em um microscópio óptico.

Em seguida, purifique e sincronize os PFS maduros de Parum, PRBC, conforme descrito no protocolo textual. Transfira toda a cultura para um tubo estéril e limpo de 15 mililitros. Peliculize as células por centrifugação à temperatura ambiente a 370 ×g por cinco minutos.

Agora, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Em seguida, ressuspenda as células de modo que metade do volume total seja jello fusing. Um terço da segunda metade é meio livre de proteína e dois terços da segunda metade são pbcs.

Transfira a suspensão para um tubo estéril de 15 mililitros e incube por 15 a 20 minutos em uma estufa a 37 graus Celsius até que uma delimitação clara se forme entre as camadas superior e inferior. Transfira cuidadosamente a camada superior para um tubo estéril novo de 15 mililitros e adicione 10 mililitros de RPMI fresco. Centrifugue a 370 a 430 ×g por cinco minutos. Em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Agora, avalie o parasita e o estágio de desenvolvimento por meio de esfregaço sanguíneo delgado e examine ao microscópio óptico conforme descrito anteriormente. Ajuste a suspensão de GRP obtida após a flutuação em gel de plasma para um vezes 10 à oitava potência de GRPs por microlitro em um tubo novo de 1,5 mililitro. Suspenderemos os PBs em 5% de hematócrito com laranja de acridina ou brometo de etídio a 20 microgramas por mililitro, concentração final, e PRP em 10% do volume total.

Da mesma forma, prepare os seguintes controles: hemácias não infectadas e PRP e PRBC com PPP para verificar o papel das plaquetas na aglomeração das PBC. Agora, transfira a suspensão para um frasco de 2 mL com tampa de rosca. Coloque o frasco sob agitação suave, girando a 10 a 12 RPM, à temperatura ambiente, coletando amostras a intervalos de 15 a 20 minutos, durante um total de 120 minutos, para verificar a formação de aglomerados.

Pipete 10 microlitros da amostra em uma lâmina de vidro e cubra com uma lamínula para examinar em fluorescência. Um agregado é considerado um conjunto de três ou mais eritrócitos infectados. Este experimento analisou aproximadamente 70% de estágios maduros de p FALs parem após enriquecimento por flutuação em gel de plasma. Os agregados são facilmente identificados ao microscópio, assim como à luz normal. Eles aparecem como agregados celulares e em fluorescência como manchas verdes ou vermelhas.

Quando coradas com acro e laranja ou brometo de atherium, respectivamente. O tamanho dos agregados aumenta significativamente para uma média superior a 15 PBMCs por agregado após incubação por 120 minutos, com alguns agregados contendo numerosos PBMCs por agregado que não puderam ser contados visualmente. A frequência do fenótipo de agregação é calculada como o número de células infectadas presentes em agregados por 1000 células infectadas contadas em ensaios duplicados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão clara de como realizar um ensaio de agregação mediada por plaquetas de plasmodium falciparum. Tenha cuidado para não ativar as plaquetas com movimentos bruscos e variações de temperatura. Este ensaio também pode ser aplicado para medir a agregação mediada por plaquetas na malária grave.