Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por Plasmodium falciparum infectados em uma configuração com poucos recursos

Este procedimento oferece algumas diretrizes padronizadas para a realização de ensaios de aglomeração mediada por plaquetas de falsos parilates de plasmodium clínicos ou laboratoriais. Primeiro, colete sangue de um paciente infectado e colha eritrócitos parasitados por centrifugação, depois cultive e purifique os estágios maduros assexuados. Em seguida, colete sangue de um doador saudável para preparar e padronizar o plasma rico em plaquetas por centrifugação.

Combine as plaquetas e os eritrócitos parasitados para o ensaio de aglomeração. Digamos que os resultados da microscopia de imunofluorescência possam mostrar aglomerados de P Fal sperum mediados por plaquetas. Esta técnica é projetada especificamente para medir o fenótipo de aglomeração de plasmodium sra.Isolados

clínicos em um ambiente pobre em recursos. Variações mínimas nos procedimentos têm aumentado a influência no resultado da aglomeração de ácido no campo. Portanto, era necessário um protocolo claro e fácil de seguir, adaptado a ambientes de poucos recursos para padronizar os locais de campo endêmicos da malária. Em um citrato de sódio, o vacutainer coleta aproximadamente cinco mililitros de sangue total de um hospedeiro virgens de malária ou 2,5 mililitros de sangue de pacientes com malária CM ou SM.

Centrifugue todo o sangue a 250 Gs por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante turvo para um tubo limpo de 15 mililitros. Lembre-se de que as plaquetas são facilmente ativadas pela temperatura, variações e choques físicos.

Enumere a suspensão de PRP usando o hemocitômetro annoy bower's e ajuste a concentração desejada com PBS para obter pastilhas de plasma pobre em plaquetas, a maioria das plaquetas de uma porção da fração de PRP por centrifugação a 1500 GS por 10 minutos. Armazene as frações de PRP e PPP a quatro graus Celsius por até oito a 10 dias. Idealmente, usando plaquetas frescas para o ensaio de aglomeração.

Lave os glóbulos vermelhos periféricos peletizados três vezes com cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 em um frasco de cultura Suplemente o PRBC com cultura padrão de malária, glóbulos vermelhos médios e frescos não infectados para obter um hematócrito de 5%. Permeie os frascos de cultura com uma mistura de 92,5% de nitrogênio, 2,5% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, sele e cultive parasitas maduros de pbcs de pacientes.

Incubar o balão de cultura durante 24 a 36 horas numa incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono. Coloque aproximadamente 10 a 15 microlitros de sangue em uma extremidade de uma lâmina de vidro fosco apoiada em uma superfície plana. Toque a gota de sangue com a borda de uma segunda lâmina até que o sangue esteja uniformemente espalhado pela borda da segunda lâmina enquanto segura a segunda lâmina em um ângulo de 45 graus.

Rapidamente, mas suavemente, sem exercer muita pressão na primeira lâmina, espalhe uniformemente o sangue pela primeira lâmina. Em seguida, seque ao ar a fina película de sangue, desidrate a área da amostra com metanol por 10 segundos. Em seguida, seque ao ar em seguida, mergulhe a amostra com 2% keem.

Sustente por pelo menos 10 minutos. Enxágue extensivamente até que a água saia limpa e seque ao ar. Examine as amostras sob uma lente de emulsão de óleo 100 x em um microscópio óptico.

Em seguida, purifique e sincronize o par PFS maduro, PRBC conforme descrito no protocolo de texto. Todos transferem a cultura para um tubo limpo e estéril de 15 mililitros. Pulverizar as células por centrifugação à temperatura ambiente a 370 GS durante cinco minutos.

Aspirar agora cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Em seguida, ressuspenda as células de forma que metade do volume total seja fusão de gelatina. Um terço da segunda metade é meio livre de proteína e dois terços da segunda metade é pbcs.

Transfira a suspensão para um tubo estéril de 15 mililitros e incube por 15 a 20 minutos em uma incubadora a 37 graus Celsius até que uma demarcação clara se forme entre os níveis superior e inferior. Transfira cuidadosamente a camada superior para um tubo estéril fresco de 15 mililitros e adicione 10 mililitros de centrífuga RPMI fresca a 370 a 430 GS por cinco minutos. Em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Agora avalie o estágio de análise e desenvolvimento por esfregaço de sangue fino e examine ao microscópio óptico, conforme descrito anteriormente. Ajuste a suspensão de P RBC obtida após a flotação do gel de plasma para uma vez 10 elevado ao oitavo P RBCs por microlitro em um tubo novo de 1,5 mililitro. Suspendemos os hemogramas a 5% de hematócrito e laranja ou brometo de atório a 20 microgramas por mililitro, concentração final e PRP a 10% do volume total.

Da mesma forma, prepare os seguintes controles de glóbulos vermelhos não infectados e PRP e PRBC com PPP para verificar o papel das plaquetas na aglomeração do PBC. Agora transfira a suspensão para um frasco com tampa de rosca de dois mililitros. Colocar o frasco para injetáveis sob agitação suave, rolando a 10 a 12 PVP à temperatura ambiente, amostrando em intervalos de 15 a 20 minutos, durante um total de 120 minutos, para verificar a formação de touceiras.

Pipetar 10 microlitros da amostra em uma lâmina de vidro e cobrir com uma tira de vidro para examinar sob fluorescência, Um aglomerado é considerado como um agregado de três ou mais eritrócitos infectados. Este experimento analisou aproximadamente 70% dos estágios maduros de p FALs parem após o enriquecimento por aglomerados de flotação de gel de plasma são facilmente detectados ao microscópio como sob luz normal. Eles aparecem como agregados celulares e sob fluorescência como manchas verdes ou vermelhas.

Quando corado com acro e laranja ou brometo de atério morre, respectivamente. O tamanho da touceira aumenta significativamente para uma média superior a 15 pbcs por touceira após a incubação por 120 minutos, com alguns aglomerados contendo numerosos pbcs por touceira que não puderam ser contados visualmente. A frequência do fenótipo de aglomeração é calculada como o número de células infectadas presentes em aglomerados por 1000 células infectadas contadas em ensaios duplicados.

Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma compreensão clara de como realizar um ensaio de aglomeração mediada por plaquetas de plasmodium falciparum. Tenha cuidado para não ativar as plaquetas com movimentos bruscos e variações de temperatura. Este ensaio também pode ser aplicado para medir o ensaio de aglomeração mediada por plaquetas na malária grave.