Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de Plasmodium falciparum

O objetivo geral deste procedimento é estudar o papel dos microRNAs eritrocitários na regulação gênica pós-transcricional de transcritos de plasmodium falciparum. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da malária, como como os eventos de splicing de RNA com pequenos RNAs do hospedeiro ou do parasita podem afetar o potencial translacional dos mRNAs de fusão. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de capturar RNAs totais e pequenos juntos em um pool, demonstrando a presença de RNAs pequenos e RNAs de fusão em uma célula.

Além disso, este procedimento utiliza perfis de polissomos para mostrar como esses pequenos RNAs afetam a tradução de seus produtos de mRNA de fusão. Para começar, configure a transfecção por cento de 300 microlitros de glóbulos vermelhos em meio completo de malária a 800 vezes G por cinco minutos. Lave os eritrócitos duas vezes com meio RPMI ressuspenda as células em mistura completa de cito a 50% de hematócrito.

Em seguida, transfira as células para um veterinário de eletroporação e adicione 10 microgramas de micro RNA conjugado com biotina DYS th ou um micro RNA de controle negativo não conjugado. Para eletroporar as células, coloque o vete em um eletroporado e forneça um único pulso. Em seguida, plaquear as células e infectá-las com plasmodium falciparum após quatro horas, conforme descrito no protocolo de texto.

Em seguida, adicione 50 microlitros de ávido e grânulos embalados e descascados a 10 microgramas de RNA do parasita em um tubo microcentral e incube o tubo com rotação por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugue a tira davan e os grânulos a 800 vezes G por 30 segundos e, em seguida, lave o pellet com 500 microlitros de tampão RNP contendo uma diluição de um a 1000 de inibidor de RNA. Em seguida, eluir o RNA das esferas por Resus, suspendendo-as em 200 microlitros de RNA.

Tampão de eluição de captura contendo excesso de biotina. Incube as contas durante a noite a quatro graus Celsius com rotação. Em seguida, centrifugue os grânulos a 800 vezes G por 30 segundos e colete o RNA sobrenadante.

É fundamental eluir com excesso de biotina e usar a quantidade mínima de estreptococos ávidos e grânulos para garantir a eluição específica adequada. Isso reduz o enriquecimento de RNA de fundo. Finalmente, determine o grau de enriquecimento dos transcritos de P falciparum e o enriquecimento de microRNA por RTPCR quantitativo, conforme descrito no protocolo de texto, para iniciar a separação do polissomo.

Primeiro coloque cinco mililitros de uma solução de sacarose a 50% em um tubo de ultracentrífuga. Em seguida, coloque cuidadosamente cinco mililitros de uma solução de sacarose a 15% sobre a solução a 50%. Em seguida, sele o tubo gradiente com perfil e incline cuidadosamente o tubo até que fique horizontalmente na bancada.

Certifique-se de que o tubo esteja em uma posição estável para evitar rolar. Mantenha o tubo nesta posição por pelo menos duas horas para permitir a formação do gradiente. Enquanto isso, colete aproximadamente 100 mililitros de uma cultura assíncrona de sangue infectado com plasmódio a três a 5% de perda.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura contendo dois milimolares ciclo, heide e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrifugue as células a 500 vezes G por sete minutos e depois lave-as duas vezes com 80 mililitros de PBS contendo 200 micromolares cyclo heide resus. Suspenda o pellet em PBS com cicloheximida e coloque-o no gelo.

Pulverizar as células e remover o sobrenadante para estimar o volume do sedimento. Em seguida, ligue as células em um volume final de 4,25 mililitros de lise, tampone e incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com rotação. Tentativas anteriores de perfil de polissomos e espécies causadoras de malária revelaram principalmente monos porque a lise ponente leva à quebra do polissoma em zonas mono.

Aqui, utilizamos um tampão de lise que lisa o eritrócito e os parasitas simultaneamente para preservar o padrão polissômico do plasmodium falciparum, transferimos o lisado para tubos de microcentrífuga e depois giramos a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em um tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros pré-resfriado separado, adicione 1,25 mililitros de solução fria de almofada de sacarose molar 0,5 usando uma seringa com uma agulha de calibre 27. Coloque cuidadosamente 3,75 mililitros do sobrenadante lisado acima da almofada de sacarose.

Centrifugue a amostra a 366.000 vezes G a quatro graus Celsius por 146 minutos. Durante este tempo, retorne lentamente o tubo de ultracentrífuga morto com sacarose para a posição vertical e deixe-o repousar no gelo por pelo menos 15 minutos. Depois de retirar o lisado da ultracentrífuga, recolher cuidadosamente o sobrenadante num tubo cónico de 15 mililitros.

Armazene o sobrenadante a menos 80 graus Celsius para preservar a fração de RNA não ligada pelos ribossomos. Em seguida, ressuspenda o pellet de ribossomo em 500 microlitros de suspensão Resus, tamponamento pipetando por cinco minutos para misturar a centrífuga da amostra a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Para remover o material insolúvel, remova cuidadosamente o selo do param no tubo de gradiente para evitar perturbar o gradiente e, em seguida, coloque a suspensão ribossômica por cima com uma seringa e uma agulha de calibre 27.

Depois de centrifugar o tubo a 200.000 vezes G a quatro graus Celsius por 180 minutos, armazene os gradientes a quatro graus Celsius até que esteja pronto para carregar no fracionador. Coloque um tubo de ultracentrífuga vazio no fracionador de gradiente e lave o sistema com água livre de RNA por cinco minutos. Durante a lavagem, defina a sensibilidade do detector de absorbância UV em 254 nanômetros para 0.2.

Embora isso possa precisar ser ajustado dependendo do sinal. Em seguida, defina o sinal de linha de base para zero à medida que a água flui pelo detector. Após a lavagem do coletor, inverta o fluxo de fluido através do fracionador para esvaziar as linhas e, em seguida, remova o tubo vazio da ultracentrífuga.

Passe uma solução de sacarose a 60% pelo FRACIONADOR até que ela saia do aparelho da agulha. Em seguida, coloque o tubo de gradiente carregado na parte superior da câmara de carregamento e aperte a vedação. Perfure o fundo do tubo com a agulha.

Em seguida, redefina a velocidade de fluxo do fracionador para 12,5 por 10 e colete frações de 18 segundos em tubos de microcentrífuga. Inicie o fluxo direto da solução de sacarose a 60% para eluir as frações antes que a primeira gota da solução de gradiente entre em um tubo de microcentrífuga. Comece a coleta e o registro ao vivo da absorbância ao sinal de 254 nanômetros.

Quando o sinal absorvente cair drasticamente na interface da solução de sacarose a 50% e 60%, pare o fluxo e a gravação. Armazene as frações de gradiente a menos 80 graus Celsius. Em seguida, inverta o fluxo do fluido até que a solução a 60% se esvazie do tubo da ultracentrífuga.

Remova o tubo e comece a análise do próximo gradiente. A transfecção de glóbulos vermelhos com microRNA 4 5 1, seguida pela recuperação dos híbridos de mRNA micro NA biotinilados, revelou enriquecimento dos transcritos de fusão PKAR. A transfecção de microRNA simulada ou não relacionada não enriqueceu o transcrito de PKAR.

Os dados mostram os picos elucianos das subunidades ribossômicas de 40 s e 60 s, o ribossomo a DS e as frações polissômicas contendo o número indicado de ribossomos. Os ribossomos foram associados aos transcritos isolados da ICP que residem no interior das hemácias. A análise de sangue do norte demonstrou que os ribossomos e o polissomo estavam associados ao 18 S e ao 28 SRNA.

Juntamente com este procedimento, outros métodos como digestão de R nase H, ensaios de proteção da ribonuclease e northern blotting podem ser realizados para validar adicionalmente a presença de microRNA MR. Fusões NA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar microRNAs em eritrócitos e, posteriormente, capturar pequenos RNAs com RNA total, incluindo transcritos quiméricos. Você também deve ser capaz de recuperar o polissomo para determinar a ocupação ribossômica e, portanto, o potencial translacional desses transcritos de fusão.