Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

O objetivo geral deste procedimento é isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco de pulso gentio humano de dentes permanentes usando dois métodos. Isso é feito coletando dentes do siso impactados saudáveis, cortando-os ao redor da junção do cimento com o esmalte no início. As células-tronco poli dentárias D PSCs são isoladas por dois métodos diferentes.

No primeiro método, os tecidos dos pólipos são digeridos enzimaticamente por incubação em solução de colagenase tipo um mais espaço em disco. Aqui nós os chamamos de ed. Considerando o método de isolamento no segundo método, os tecidos palpais são colocados apenas no frasco sem qualquer digestão.

Desta forma, os dpss começam a migrar do tecido para o frasco. Essas células chamadas OG referem-se ao método de isolamento de crescimento. A segunda etapa do procedimento é a identificação de células-tronco por citometria de outono.

A terceira etapa do procedimento é a indução da diferenciação de odontoblastos, e a etapa final do procedimento é a avaliação comparativa da diferenciação de odontoblastos entre dois grupos por meio de coloração em vermelho e QBCR. Eu sou RA Kde do Departamento de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento do Instituto Rian. Hoje vou mostrar a vocês o isolamento, caracterização e diferenciação comparativa de células-tronco mesenquimais humanas usando dois métodos.

Olá, sou o Dr.Rezaian do Instituto Rio. Estamos trabalhando em um projeto relacionado a células-tronco da polpa dentária humana. Essas células são uma espécie de células-tronco mecânicas, fáceis de obter com o mínimo de dor e morbidade.

As células-tronco mechy especificam com capacidade de aran plástico, formação de colônias e capacidade de diferenciação múltipla. Olá, sou a Dra. Ami do Departamento de Células-Tronco. No instituto, usamos esse procedimento em nosso laboratório para isolar células-tronco para fins de estudos de pesquisa e aplicações futuras.

Na medicina regenerativa, o primeiro passo para usar essa fonte de células-tronco para futuras terapias baseadas em células-tronco é escolher o melhor protocolo para isolar células-tronco do tecido da parte humana. Para atingir esse objetivo, é crucial investigar certos aspectos do comportamento celular sob diferentes condições de isolamento de células-tronco. Primeiro, vou isolar células-tronco da polpa dentária humana usando a dissociação enzimática da polpa ou o crescimento de células-tronco de implantes de tecido.

Em seguida, caracterize-os e diferencie-os em explosão ogen. Então vamos começar. Primeira via, espaço e colagenase Tipo um dissolvem ambos em PBS.

Em seguida, filtre-os usando um filtro de seringa de 0,2 mícron. Puxe ambos para dentro do tubo cônico. Em seguida, adicione pener e PBS para atingir a concentração final.

Transfira os dentes do siso saudáveis para o laboratório no meio básico frio sob a condição de aço. Limpe a superfície do dente com etanol a 70% antes de estudar. Certifique-se de limpar a brisa da superfície do dente.

Corte o dente ao redor da junção do esmalte de cimento usando disco dentário esterilizado para revelar a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte deve ser realizado lentamente para reduzir o superaquecimento do tecido dentário. Em seguida, separe suavemente o tecido pulpar da coroa significa tecido pulpar em pedaços de um a dois milímetros com a lâmina Scarpa.

Transfira pequenos pedaços de tecido pulpar para uma solução enzimática de mililitro por uma hora a 37 graus Celsius a cada 30 minutos para ajudar a quebrar os tecidos pulpar. Em seguida, remova os agregados grandes passando-os por uma cepa de células de 70 mícrons. Em seguida, adicione PBS contendo centrífugas PENER em 1.200 RPM por cinco minutos.

Remova o supernat com cuidado. Em seguida, suspendemos a placa no meio de proliferação pm, transferimo-la para o frasco de cultura e adicionamos o meio. Em seguida, incubar incubado.

Troque o meio a cada três dias até que a confluência celular seja alcançada para o método outwork. Repita o processo de corte. Depois de cortar o dente, os tecidos pop se transformam em um fragmento de um a dois milímetros.

Em seguida, coloque-os na cultura. Flash com proliferação, médio e incubado. Deve-se considerar que o volume total do meio de proliferação deve suportar a fixação de todas as peças para posterior crescimento celular.

Mude o meio depois de observar o crescimento e, em seguida, a cada três dias até que a confluência celular seja alcançada. Para imunofenotipagem, incube ambos os tipos de PSCs D com anticorpos conjugados com PE ou FITC por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, adicione visualizações PBS e centi a 1.200 RPM por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e o resus, suspenda a placa em PBS e, finalmente, avalie os marcadores de superfície usando a subcultura do citômetro de fluxo, ambos os tipos de DPCs para três passagens. Em seguida, tropeçar no gelo e transferi-los para seis placas de cultura vermelha com fluência de 60% de Co, substitua o PM pelo meio odontogênico. Três poços permanecem como controle negativo adicionando pm.

Troque o meio a cada três dias no dia 21 lave as células com PBS. Em seguida, fixe-os em um mililitro por poço. 10% de altura formal do gel por 15 minutos em temperatura doméstica.

Após 15 minutos, remova o fixador com cuidado e enrole as células três vezes com água destilada. Em seguida, substitua a água por um mililitro por alza vermelha em solução de corante vermelho. Após 20 minutos, removemos o excesso de corante e lavamos as células quatro vezes com água deionizada.

Em seguida, adicione um milímetro por água de poço para evitar que as células sequem. Após a coloração, você pode ver três trilhos ascendentes se transformarem em vermelho em comparação com os controles sob o microscópio, você pode ver a absorção de cor de dis stain ao redor da célula por grande ampliação para quantificação de uma coloração vermelha. Após remover a água, adicione um mililitro por poço, ácido 10% e incubado por 30 minutos com agitação.

Em seguida, raspe suavemente as células da placa usando um raspador de células. Em seguida, transfira-os para os tubos separados. O VOR leva vigorosamente por 30 segundos.

Em seguida, aqueça-os a 85 graus Celsius por 10 minutos. Para evitar a evaporação dos tubos de vedação com o tubo de transferência ParaView para o gelo por cinco minutos, eles os usaram a 20.000 G por 15 minutos. Enquanto isso, faça a diluição serial padrão do vermelho de Alzheimer de acordo com o protocolo da região.

Após a centrifugação, remova o snat e transfira-os para os novos tubos. Neutralize o pH com 10% de hidrócito de amônio. Em seguida, adicione padrões e também amostras em 96.

Placa de poço e, em seguida, meça a absorbância em 405 nanômetros e analise os dados de acordo com a diluição serial padrão. Aqui você pode ver DPCs, que são isolados por dissociação enzimática nos dias 10, 15 e 18, e também DPCs superados no quinto, 10º, 13º e 18º dias. Ambos os tipos de dpss na sase três estão quase no mesmo tamanho e morfologia Os resultados da imunofenotipagem mostram a presença de marcadores de células-tronco mesenquimais, como CD 44, CD 73 e CD 19, e a ausência de marcadores hematopoiéticos e endoteliais, como CD 34, CD 45 e CD 11 B. Curiosamente, as expressões de CD 1 0 5 e CD 146 são mais em PSCs d superadas em comparação com D-P-S-C-E-D, a quantificação da coloração com vermelho enzimático no 21º dia de diferenciação do odontoblasto mostra maior deposição de cálcio em D-P-S-C-E-D em comparação com sem topo dentário de células-tronco.

Os resultados de QPCR também indicam expressões significativamente mais altas de MEP e A LP como marcadores de mineralização em D-P-S-C-D em comparação com o dente de saída de células-tronco. Enquanto isso, ambos os genes são regulados durante a diferenciação e também a expressão de DSPP à medida que o marcador odontogênico aumenta durante a diferenciação. No entanto, não há variação significativa na expressão de DSVP em células diferenciadas entre os grupos DE e OG.

Acabamos de mostrar como isolar células-tronco de partes dentárias humanas usando a dissociação enzimática da polpa ou o crescimento de células-tronco do tecido explan. Então é isso. Desejo-lhe boa sorte para tentar usar este procedimento em seu experimento.

Obrigado.