Name: Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar células-tronco da polpa dentária humana de dentes permanentes usando dois métodos diferentes. Este protocolo compara dissociação enzimática e crescimento direto para diferenciação odontoblástica.

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Agradecemos Dra. Leila Shakeri &amp; Dr. Aref Dournaei para sua discussão crítica e Mohammad Reza Sr. Khadem Sharif por seus apoios técnicos.

1. Prepare a solução de enzima e meio de proliferação (PM) <ol><li> Fazer colagenase tipo I Solução: Pesar colagenase tipo I (12 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário. </li><li> Solução fazer dispase: Pesar dispase (16 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e manter a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Fazer a solução de enzima: Adicione 1 ml de colagenase tipo I de soluções (12 mg / ml) e 1 ml de soluções de dispase (16 mg / ml) na 2 ml de PBS estéril, contendo 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. Concentração total de colagenase e dispase I em volume final deve ser de 4 mg / ml e 3 mg / ml, receptivamente. Em seguida, este volume da alíquota para quatro tubos de 15 ml, contendo cada um deles uma solução de enzima ml. Cada tubo podia ser usado para uma digestão de celulose. </li><li> Fazer a solução de lavagem: Adicionam-se 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina em PBS. </li><li> Fazer meio básico: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10% e 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> Fazer a mídia Proliferação (PM): Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B. </li><li> Fazer media odontogênicos: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 uM dexametasona, 5 mM de fosfato de glicerol β-, 1,8 mM de fosfato monopotássico. </li></ol> 2. Prepare polpa dental humano para Dental Isolatio celular Pulp Stemn <ol><li> Normais terceiros molares humanos foram coletados de adultos (21-29 anos de idade) na Clínica de Odontologia da Imam Ali, sob aprovado Institutional Review Board (IRB). </li><li> Os dentes foram colocados em meio básico (α-MEM suplementado com FBS 10%) e foram transferidos em laboratório, a 4 ° C. </li><li> Sob a condição estéril, trabalhando dentro de um capuz de risco biológico de fluxo laminar, set-up foi feita uma placas de 100 mm de Petri para cada dente a ser processado. Superfícies dos dentes foram limpos por etanol 70%. </li><li> Enquanto trabalha em um dos pratos de Petri-, dente foi mantido por meio de fórceps dentais e uma lâmina de bisturi foi utilizada para limpar os detritos e do ligamento periodontal, nas raízes. </li><li> Cemento-esmalte junção foi lentamente cortar usando esterilizados disco dental para revelar a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte tem de ser realizada lentamente para reduzir o sobreaquecimento do tecido dental. </li><li> Tecido pulpar foi gentilmente separada da coroa e raiz. </li&gt; <li> Polpa foi cortada em pequenos pedaços, com o auxílio de uma lâmina de bisturi. </li></ol> 3. Isolamento Pulp humana Dental <ol><li> Tecidos pulpares foi submetido a dissociação enzimática do tecido pulpar ou conseqüência direta de células a partir de explantes de polpa de tecidos para isolamento de hDPSCs. </li><li> Dissociação enzimática do tecido pulpar: <ol><li> Pequenos pedaços de tecidos de polpa foram transferidos para solução de enzimas, durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ajudar a romper o tecido. </li><li> Depois, os agregados celulares grandes foram removidos e as suspensões unicelulares foram obtidos pela passagem de células através de um coador de células de 70 | iM. </li><li> Unicelulares suspensões foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Os sobrenadantes foram cuidadosamente pipetado fora e pelete foi re-suspenso em 1 ml de meio de proliferação (PM). (Nota: FBS em meio de proliferação encerrar enzimática disassociação.) </li><li> Unicelulares suspensões de polpa dentária foi semeada em frasco de cultura de 25 cm 2 com AM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> O meio de cultura foi mudado de três em três dias até a confluência celular foi alcançada. </li></ol></li><li> Conseqüência direta de células a partir de explantes de tecido de celulose: <ol><li> Polpa foi picada em 1-2 mm de fragmentos, e cada peça foi colocada em 25-cm 2 frascos de cultura com PM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2. Deve-se considerar que o volume total da PM para crescimento de célula deve apoiar a fixação de peças de celulose para crescimento celular ainda (2-3 ml por frasco). </li><li> O meio foi mudado após crescimento foi observado. </li><li> As células crescido em confluência foram sub-cultivadas a uma razão de 1:4 (passagem 1). </li></ol></li></ol> 4. Imunofenotipagem <ol><li> 250.000 células /tubo de ambos os tipos de células na passagem 3 foram incubadas por PE ou FITC-conjugado anti-humano com anticorpos com os seus isotipos durante 30 min a 4 ° C num local escuro. (Nota:. Da concentração de anticorpos foi aplicada de acordo com o protocolo de fabricação) </li><li> Após o tempo de incubação, 100 uL de PBS ou de FACS solução de diluição foi adicionada a cada tubo e centrifugou-se a 1200 rpm durante 5 min, em local escuro. </li><li> Os sobrenadantes foram removidos e pelotas foram re-suspensas em 100 ul de PBS ou de diluição FACS em local escuro. </li><li> Marcadores de superfície alvo (marcadores CD) foram avaliados por BD FACSCalibur. </li></ol> 5. A indução da diferenciação de células em DPSCs mineralizadas e quantificada Ensaio Vermelho de alizarina S <ol><li> DPSCs que foram obtidos por um ou outro dissociação enzimática do tecido pulpar (conhecido como DPSC-ED) ou excrescência celular directa a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) foram sub-cultivadas durante 3 passagens. </li><li> At A passagem 3, as células foram de semente em uma placa de 6 poços a 5000 células / poço. </li><li> Na confluência de 60%, o meio foi substituído por odontogênico PM convencional. Três cavidades foram permaneceu como um controlo negativo pela adição de meio de crescimento. </li><li> Médio mudam a cada 3 dias até o dia 21. </li><li> No dia 21, as células foram lavadas com PBS e foram fixadas em 1 ml / poço de 10% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Em seguida, foram pipetados paraformaldeído fora, com cuidado e as células foram lavadas 3 vezes (5-10 min para cada vez) com água destilada H 2 O. (Nota: Evite perturbar a monocamada.) </li><li> Após a lavagem, 1 ml / poço de vermelho de alizarina S foram adicionados durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> As células foram lavadas por desionizada H 2 O (quatro vezes 5 min de cada vez, com agitação suave), para remover qualquer vermelho de alizarina adicional. </li><li> 1 ml / poço de H 2 O foram adicionados para evitar que as células de secagem. </li><li> As placas foram assumidos como ins visuaispection e / ou aquisição de imagem. </li><li> Para o ensaio com vermelho de alizarina S quantificação, H 2 O foram substituídos por 1 ml de ácido acético a 10% a cada poço da placa de 6 poços e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação. </li><li> Então, monocamada de células / poço foram scrape &amp; tanto o ácido acético e as células foram transferidas para as separar de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos. (Nota:. Cada poço deve ser transferido para um tubo separado ou seja, três poços de teste e três poços de controle para cada grupo de ED &amp; OG) </li><li> Os tubos foram agitados vigorosamente durante 30 sec. </li><li> Aquece-se a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar a evaporação, os tubos foram selados com parafilme.) </li><li> Após o aquecimento, os tubos foram transferidos para gelo, durante 5 min. (Nota: Os tubos não deve ser aberta até que se esfriou.) </li><li> As suspensões foram centrifugadas a 20.000 xg durante 15 min. Embora a centrifugação, as normas de vermelho de alizarina foram feitas-se. </li></ol> Padrão vermelho de alizarina S foram preparadas por diluição da primeira tampão de diluição e usado para fazer duas diluições em série com base na tabela. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> Gama Alta concentração de corante </td><td colspan="7"> Gama Baixa concentração de corante </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> 1 mM </td><td> 500 uM </td><td> 250 uM </td><td> 125 uM </td><td> 62,5 mM </td><td> 31,3 mM </td><td> 15,6 mM </td><td> 7,8 mM </td><td> 3,9 mM </td><td> 1,9 mM </td><td> 0,9 mM </td><td> 0,4 uM </td><td> Em branco </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> Após a centrifugação, 1 ml de sobrenadante / tubo foram transferidas para novos separados de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos. </li><li> O pH foi neutralizado com 375 ul ~ 10Hidróxido de amónio% por tubo. (Nota: a raiva pH deve ser 4,1-4,5). </li><li> 150 ul de padrão e amostras (inclui testes separados e controlos) foram adicionados a um opaco de parede de fundo transparente, de 96 poços da placa. </li><li> A absorvância foi lida a 405 nm e os valores de OD das amostras foram comparadas com o lote padrão para análise posterior. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve o processo de isolamento e caracterização de hDPSCs da polpa dentária através de dois métodos, dissociação enzimática e excrescência directa de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose. Além disso, a diferenciação in vitro destas células em odontoblastos, foi avaliada por ensaio quantitativo Vermelho de alizarina S &amp; QPCR. Os protocolos existentes para o isolamento de tecido de polpa de dentes humanos foram utilizados difere...

As células-tronco são células que possuem clonogénicos duas características marcantes, conhecidos como multi-potência e auto-renovação 15. Entre todas as células estaminais com potências diferentes replicativas, as células estaminais dentários como as células-tronco pós-natais têm chamado a atenção nos últimos anos por causa da sua acessibilidade, plasticidade e capacidade proliferativa elevada em comparação com as células estaminais adultas outros 16. Caracteristicamente, semelhante para as células estaminais mesenquimais, as células estaminais da polpa dentária são células aderentes clonogénicas que têm a capacidade de diferenciação em múltiplas mesênquima e / ou não-mesênquima linhagens, tanto in vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs são identificados pela a sua expressão negativa de antigénios hematopoiéticas (por exemplo, CD45, CD34, CD14), e da expressão de CD90 positivas, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1, 19,20. Potencial obtida fácil com o mínimo de dor e morbidade fazer DPSCs humanos como um valiosofonte capaz de MSCs em comparação com as fontes comuns, tais como a da medula óssea as células estaminais mesenquimais 21. Em geral, DPSCs ter sido isolada por qualquer método outgrowth, isto é, a migração de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) 22-24, e / ou por digestão enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudos anteriores têm mostrado que o método de isolamento e as condições de cultura podem induzir diferentes populações ou linhagens sob passagens in vitro 26,27. No caso dos dentes permanentes (pDPSCs), Huang et al mostraram que enzimáticas pDPSCs digeridos têm um maior potencial de proliferação em comparação com os DPSCs crescido. 26 Por outro lado, no caso dos dentes de leite (dDPSCs), demonstrou-se que STRO-1 e CD34 marcadores expressa mais em dDPSC-ED em comparação com dDPSC-OG. Além disso, dDPSC-ED apresentado maior taxa de mineralização em meio definido osteo / odonto. 27 Portanto, devido ao excelente potencial de DPSCs em regenerative medicina, mais estudos serão necessários para uma melhor compreensão das possíveis várias populações que são derivadas de diferentes métodos de isolamento. Aqui, ela foi a tentativa de introduzir de maneira fácil a extracção da polpa, utilizando-se um passo de disco de diamante dental para facilitar o processo de extracção da polpa. Além disso, após o isolamento de células-tronco derivadas de celulose, aplicando métodos de ED ou OG, propriedades gerais e capacidade de diferenciação entre os dois grupos também foram investigados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catálogo ou Lot. número </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-100mg </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> A anfotericina B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de bovino fetal definido (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico 2-fosfato </td><td> Sigma </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β glicerol-fosfato de hidrato de sal de dissódio, BioUltra </td><td> Sigma </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogênese Ensaio Kit </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> Rato IgG2b-PE isotipo controle </td><td> BD Pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC rato IgG2b isotipo controle </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC rato IgG1 κ isotipo </td><td> BD Pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE de murganho anti-humano CD34/CD45 </td><td> BD Pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE CD146 anti-humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonal de rato anti-humano CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE rato anti-CD73 humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-h CD105/Endoglin PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE rato CD11b/Mac1 anti-humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE rato anti humano </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> Solução tampão de fosfato (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mícrons coador celular </td><td> Falcão </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0,2 um filtro de seringa </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25 centímetros frasco de cultura de 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> multiskan microplaca espectrofotômetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Fleurcense </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluindo versão de software 2.3.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, caracterização e comparativa diferenciação de células-tronco da polpa dentária derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"&gt; Dentes do siso em desenvolvimento são de fácil acesso fonte de células-tronco durante a idade adulta, que pode ser obtido por rotina tratamentos ortodônticos. As células-tronco derivadas de celulose (hDPSCs) possuem potencial de proliferação elevado com multi-linhagem capacidade de diferenciação comparar com a fonte normal de células-tronco adultas<sup&gt; 1-8</sup&gt; E, portanto, hDPSCs poderiam ser os bons candidatos para transplante autólogo em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Juntamente com estas vantagens, possuindo as células estaminais mesenquimais (MSC), tais como as características immunolodulatory efeito, fazer hDPSCs mais valioso, mesmo no caso de transplante de aloenxerto<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. Por conseguinte, o primeiro passo para a utilização dessa fonte de células estaminais é seleccionar o melhor protocolo para o isolamento de hDPSCs de tecido de celulose. A fim de atingir esse objetivo, é fundamental para investigar o efeito de diferentes condições de isolamento em diferentes comportamentos celulares, como os seus marcadores de superfície comuns e também a sua capacidade de diferenciação.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Assim, aqui nós separar tecido pulpar humano de terceira impactados dentes molares, e depois usou ambos os protocolos existentes com base na literatura, para hDPSCs isolamento,<sup&gt; 11-13</sup&gt;<em&gt; Ie</em&gt; Dissociação enzimática do tecido pulpar (DPSC-ED) ou conseqüência a partir de explantes de tecido (DPSC-GO). Nesta matéria, tentamos facilitar os métodos de isolamento, utilizando disco de diamante dental. Em seguida, estas células caracterizadas em termos de estroma associadas Marcadores (CD73, CD90, CD105 e CD44), marcadores hematopoiéticas / endotelial (CD34, CD45 e CD11b), marcador perivascular, como CD146 e também STRO-1. Em seguida, estes dois protocolos foram comparadas com base na potência de diferenciação em odontoblastos tanto pela reacção em cadeia da polimerase quantitativa (QPCR) e coloração alizarina vermelha. QPCR foram utilizados para a avaliação da expressão de genes relacionados com a mineralização (fosfatase alcalina; ALP, matriz extracelular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentina sialophosphoprotein; DSPP).<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> DPSCs que foram obtidos por dissociação enzimática (DPSC-ED) são mostrados aqui no dia 10, 15,18 (Figura 1). As colónias iniciadas de modo a formar em quase 3 a 5 dias após o isolamento. </li><li> DPSCs outgrown (DPSC-OG) são mostrados na Figura 2, no dia 5, 10, 13 &amp; 18. Fibroblast-como as células começaram a migrar a partir do tecido da polpa para o balão através paralelo ordenação por cerca de 5 dias após a semeadura. </li><li> DPSCs a passagem 3, utilizando os dois métodos estão apresent...

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs) usando<strong&gt; Dissociação enzimática da celulose (DPSC-ED)</strong&gt; Ou<strong&gt; Conseqüência direta de células-tronco a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-GO). Seguido por</strong&gt;<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação comparativa dos dois tipos de hDPSCs em odontoblastos.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Dentes do siso em desenvolvimento são uma fonte de fácil acesso de células-tronco durante a idade adulta, que podem ser obtidas por meio de tratamentos ortodônticos rotineiros. Humanos...

O objetivo geral deste procedimento é isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco da polpa dentária humana de dentes permanentes utilizando dois métodos. Isso é realizado coletando dentes do siso impactados saudáveis e seccionando-os ao redor da junção cemento-esmalte no início. As células-tronco da polpa dentária (D PSCs) são isoladas por dois métodos diferentes.No primeiro método, os tecidos de pólipo são digeridos enzimaticamente mediante incubação em colagenase tipo um mais solução do espaço discal. Aqui, chamamo-los de ed. Considerando o método de isolamento no segundo método, os tecidos de pálpebra são apenas colocados no frasco sem qualquer digestão.Dessa forma, as dpss começam a migrar do tecido para o frasco. Essas células denominadas OG referem-se ao método de isolamento por crescimento periférico. O segundo passo do procedimento é a identificação de células-tronco utilizando citometria de fluxo.O terceiro passo do procedimento é a indução da diferenciação de odontoblastos, e o passo final é a avaliação comparativa da diferenciação de odontoblastos entre dois grupos por meio da coloração em vermelho e QBCR. Sou RA Kde, do Departamento de Células-Tronco e Biologia do Desenvolvimento do Instituto Rian. Hoje vou mostrar a vocês o isolamento, a caracterização e a diferenciação comparativa de células-tronco mesenquimais humanas utilizando dois métodos.Olá, sou o Dr. Rezaian do Instituto Rio. Estamos trabalhando em um projeto relacionado a células-tronco da polpa dentária humana. Essas células são um tipo de células-tronco mesenquimatosas, que são fáceis de obter com mínima dor e morbidade.Células-tronco mesenquimais especificam-se pela capacidade plástica de formar colônias e por sua capacidade de diferenciação múltipla. Olá, sou a Dra. Ami do Departamento de Células-tronco. No instituto, utilizamos este procedimento em nosso laboratório para isolar células-tronco com finalidades de estudos de pesquisa e aplicações futuras.Na medicina regenerativa, o primeiro passo para utilizar essa fonte de células-tronco em futuras terapias baseadas em células-tronco é escolher o melhor protocolo para o isolamento de células-tronco a partir de tecido pulpar humano. Para alcançar esse objetivo, é fundamental investigar certos aspectos do comportamento celular sob diferentes condições de isolamento de células-tronco. Primeiramente, vou isolar células-tronco da polpa dental humana utilizando dissociação enzimática da polpa ou o crescimento exógeno de células-tronco a partir de implantes teciduais.Em seguida, caracterize e diferencie-os em blastocisto. Então, vamos começar. Primeiro, espaço e colagenase tipo um dissolvidos em PBS.Em seguida, filtre-os usando um filtro de seringa de 0,2 mícrons. Transfira ambos para um tubo cônico. Em seguida, adicione pener e PBS para obter a concentração final.Transfira dentes do siso saudáveis para o laboratório em meio básico frio, sob condição estéril. Limpe a superfície do dente com etanol 70% antes do estudo. Certifique-se de remover completamente qualquer resíduo da superfície do dente.Corte o dente ao redor da junção cemento-esmalte utilizando um disco dentário esterilizado para expor a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte deve ser realizado lentamente para reduzir o superaquecimento do tecido dentário. Em seguida, separe suavemente o tecido pulpar da coroa, ou seja, corte o tecido pulpar em pedaços de um a dois milímetros com a lâmina de Scarpa.Transfira pequenos fragmentos de tecidos da polpa para um mililitro de solução enzimática durante uma hora a 37 graus Celsius, agitando em vórtex a cada 30 minutos para ajudar na dissociação dos tecidos da polpa. Em seguida, remova os agregados maiores passando-os por uma peneira celular de 70 mícrons. Depois, adicione PBS contendo PENER e centrifugue a 1.200 RPM por cinco minutos.Remova o sobrenadante com cuidado. Em seguida, suspendemos a placa no meio de proliferação, transferimos para o frasco de cultura e adicionamos meio. Em seguida, incubamos.Substitua o meio a cada três dias até que a confluência celular seja alcançada para o método de explante. Repita o processo de corte. Após o corte, fragmente os tecidos em pedaços de um a dois milímetros.Em seguida, coloque-os na cultura. Incube com meio de proliferação e mantenha em incubação. Deve-se considerar que o volume total do meio de proliferação deve ser suficiente para suportar a adesão de todos os fragmentos para o posterior crescimento celular.Troque o meio após observar o crescimento celular e, em seguida, a cada três dias até que seja alcançada a confluência celular. Para imunofenotipagem, incube ambos os tipos de DPSCs com anticorpos conjugados a PE ou FITC por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, adicione PBS e centrifugue a 1.200 rpm por cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda, suspenda a placa em PBS e, finalmente, avalie os marcadores de superfície utilizando citômetro de fluxo em subcultura, ambos os tipos de DPCs por três passagens. Em seguida, trate com tripsina em gelo e transfira-os para seis placas de cultura vermelhas com 60% de confluência, substituindo o meio de manutenção (PM) pelo meio odontogênico. Três poços permanecem como controle negativo, adicionando PM.Troque o meio a cada três dias. No 21º dia, lave as células com PBS. Em seguida, fixe-as com um mililitro por poço de gel de formal a 10% durante 15 minutos à temperatura ambiente.Após 15 minutos, remova cuidadosamente o fixador e lave as células três vezes com água destilada. Em seguida, substitua a água por um mililitro por red alza em solução corante vermelha. Após 20 minutos, removemos o corante em excesso e lavamos as células quatro vezes com água deionizada.Em seguida, adicione um mililitro de água por poço para evitar que as células sequem. Após a coloração, é possível observar três trilhos superiores ficarem vermelhos em comparação com os controles ao microscópio; com ampliação maior, é possível visualizar a absorção da coloração ao redor da célula para quantificação da coloração vermelha. Após a remoção da água, adicione um mililitro por poço de ácido acético a 10%, e incube por 30 minutos sob agitação.Em seguida, desprenda suavemente as células da placa utilizando um espátula para células. Depois, transfira-as para tubos separados. VOR por 30 segundos vigorosamente.Em seguida, aqueça-os a 85 graus Celsius por 10 minutos. Para evitar evaporação, feche os tubos com ParaView e transfira-os para gelo por cinco minutos; depois, centrifugue-os a 20.000 G por 15 minutos. Enquanto isso, prepare uma diluição seriada padrão de vermelho de Alzheimer de acordo com o protocolo da região.Após a centrifugação, remova o sobrenadante e transfira para tubos novos. Neutralize o pH com hidróxido de amônio a 10%. Em seguida, adicione os padrões e as amostras também à placa de 96 poços.Plaqueie bem a placa, então meça a absorbância em 405 nanômetros e analise os dados de acordo com a diluição seriada padrão. Aqui você pode observar DPCs, que são isoladas por dissociação enzimática no 10º, 15º e 18º dia, bem como DPCs expandidas nos 5º, 10º, 13º e 18º dias. Ambos os tipos de DPSCs no meio três estão praticamente com o mesmo tamanho e morfologia. Os resultados de imunofenotipagem mostram a presença de marcadores de células-tronco mesenquimais, como CD44, CD73 e CD19, e a ausência de marcadores hematopoiéticos e endoteliais, como CD34, CD45 e CD11B. Curiosamente, as expressões de CD105 e CD146 são maiores em DPSCs expandidas em comparação com as DPSCs isoladas por dissociação enzimática. A quantificação da coloração enzimática com vermelho de alizarina no 21º dia de diferenciação em odontoblastos mostra maior deposição de cálcio nas DPSCs isoladas por dissociação enzimática em comparação com as células-tronco dentárias sem indução.Os resultados de QPCR também indicam expressões significativamente mais altas de MEP e A LP como marcadores de mineralização em D-P-S-C-D em comparação com as células-tronco dentárias em fase de saída. Enquanto isso, ambos os genes são regulados durante a diferenciação, e a expressão de DSPP, como marcador odontogênico, aumenta durante esse processo. No entanto, não há variação significativa na expressão de DSVP em células diferenciadas entre os grupos ED e OG.Acabamos de mostrar como isolar células-tronco de partes dentárias humanas utilizando a dissociação enzimática da polpa ou o crescimento de células-tronco a partir de explantes teciduais. É isso aí. Desejamos boa sorte para tentar utilizar este procedimento em seu experimento.Obrigado.

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Medicine

Medicina

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Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

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