Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

O objetivo geral deste procedimento é isolar cardiomiócitos viáveis de espécimes ventriculares humanos com doença e caracterizar suas alterações funcionais. Isso é realizado primeiramente coletando e picando rapidamente amostras ventriculares frescas em solução cardióplica gelada, a fim de evitar degradação excessiva do tecido e danos celulares. O segundo passo consiste em realizar uma digestão escalonada dos fragmentos miocárdicos utilizando um dispositivo de digestão personalizado e soluções enzimáticas.

Em seis ciclos, a célula contendo tampão é coletada em um tubo a cada ciclo e diluída com uma solução conservante de células. O passo final consiste em ressuspender as células contidas nos seis tubos em um volume menor de solução fisiológica padrão com concentrações normais de cálcio, a fim de realizar a caracterização funcional. Por fim, utiliza-se gravação por patch clamp de potenciais de ação e avaliação simultânea do cálcio intercelular por meio de corantes fluorescentes para demonstrar as alterações no potencial de ação, na duração do potencial e no ciclo de cálcio intracelular em cardiomiócitos de pacientes com miocardiopatia hipertrófica.

A principal vantagem do método DYS único em comparação com um método de 16 passos, como o método padrão de rejeição de fragmentos, é que, em conjunto com a solução enzimática, utilizamos um dispositivo de digestão personalizado, que permite a dissociação conjunta de citos variáveis graças às suas lâminas de silicone. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da cardiologia, como a forma pela qual a remodelação molecular e estrutural bem conhecida, associada às doenças cardíacas, se reflete em alterações de cardiomiócitos individuais, que podem ser analisadas por nosso método e alvo de fármacos específicos. Assim, as implicações desta técnica estendem-se para a terapia de doenças cardíacas genéticas, como a miocardiopatia hipertrófica.

Na verdade, este método pode ser utilizado para testar novas abordagens neuropáticas em cardiomiócitos ventriculares de pacientes com doenças cardíacas hipertróficas ou isquêmicas que se submeteram a cirurgia cardíaca. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao comparar a analogia entre espécimes de artérias humanas e biópsias ventriculares obtidas durante cirurgia cardíaca. Inicie este procedimento despejando 40 mililitros de solução cardioplégica em um tubo de 50 mililitros e armazene-o em gelo para o transporte rápido do espécime da sala operatória até o laboratório de isolamento celular; transfira imediatamente o espécime para a área do laboratório e inicie o processamento do espécime dentro de 10 minutos após a excisão do tecido.

Próximo espécime coletivo de miocárdio ventricular do centro cirúrgico imediatamente após a excisão. Lave-o com solução CP fria e armazene-o no tubo, mantendo o espécime em tampão CP frio. Remova cuidadosamente a camada fibrosa endocárdica usando tesoura fina posteriormente.

Corte o tecido miocárdico em pequenos pedaços de dois a três milímetros de comprimento, com uma quantidade total de miocárdio ventricular entre 100 miligramas e um grama para cada isolamento. Após a transferência dos fragmentos para a câmara de raspagem do dispositivo de digestão, substitua o tampão CP na câmara por tampão de dissociação sem cálcio e frio. Em seguida, coloque o dispositivo de digestão em um banho termostático.

Acerte o banho a 37,5 graus Celsius e ligue-o. Em seguida, ligue o motor do dispositivo de digestão e ajuste a velocidade de rotação para uma rotação por segundo. Realize três ciclos de lavagem com DB e troque a solução na câmara por DB limpo saturado com oxigênio a 37 graus Celsius a cada oito minutos.

Em seguida, prepare o tampão enzimático um adicionando 250 unidades por mililitro de colagenase tipo cinco e quatro unidades por mililitro de protease. Adicione 24 ao meio DB. Em seguida, prepare o tampão enzimático dois adicionando 250 unidades por mililitro de colagenase.

Adicione cinco na solução de DB para oxigenar o EB um e aqueça até 37 graus Celsius. Em seguida, realize dois ciclos de 12 minutos de digestão no dispositivo de digestão rotativo com três mililitros de EB um 100% oxigenado a 37 graus Celsius. Remova a solução por aspiração com pipeta e descarte-a após cada ciclo.

Em seguida, prepare seis tubos de 15 mililitros para coleta celular e 80 mililitros de solução nutritiva refrigerada a quatro graus Celsius para eliminar os tampões oxigenados EB dois e aqueça-a até 37 graus Celsius. Posteriormente, realize um primeiro ciclo de digestão de 15 minutos com três mililitros de EB dois 100% oxigenado a 37 graus Celsius. Após o ciclo de digestão, colete a solução contendo os primeiros miócitos associados em um tubo de 15 mililitros e dilua a suspensão celular com 12 mililitros de solução KB fria.

Armazene o tubo na posição horizontal à temperatura ambiente, realize cinco outros ciclos de digestão de 12 minutos com três mililitros de EB dois a 37 graus Celsius e colete o tampão contendo miócitos em cada ciclo em um tubo cônico de 15 mililitros. Lembre-se também de diluir o tampão coletado de três mililitros com 12 mililitros de solução KB em cada ciclo. Ao final, armazene os seis tubos contendo células à temperatura ambiente.

Nesta etapa, adicione albumina sérica bovina de um miligrama por mililitro a 20 mililitros de tampão Tyro sem cálcio. Em seguida, filtre a solução e centrifugue os seis tubos cónicos contendo miócitos a 100 ×g durante cinco minutos. Para forçar a sedimentação dos miócitos, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em cada tubo com uma quantidade variável de TB contendo BSA à temperatura ambiente.

Aumente gradualmente a concentração de cálcio no tampão contido no recipiente, adicionando pequenas quantidades de solução de cloreto de cálcio a 100 milimolares por litro nos primeiro e segundo passos. A concentração de cálcio é elevada para 50 micromolares por litro e 100 micromolares por litro, respectivamente. Os seguintes passos de adição de cálcio são realizados a cada cinco minutos, e a concentração é aumentada em 100 micromolares por litro em cada etapa, até uma concentração final de 0,9 milimolar por litro.

Para avaliar o rendimento do procedimento de isolamento, transfira 0,5 mililitros da solução contendo miócitos para a câmara com fundo de vidro de um microscópio. Avalie 15 campos microscópicos com aumento objetivo de 10 x e calcule a porcentagem de miócitos saudáveis, como as células em forma de bastão com estriações nítidas e sem inclusões significativas. Os rendimentos esperados devem ser de aproximadamente 20% para demonstrar a avaliação funcional de cardiomiócitos humanos, incluindo gravações simultâneas de potenciais de ação e fluxos intracelulares de cálcio.

Primeiro, prepare a solução para pipeta para experimentos de patch clamp em configuração de patch perfurado. Em seguida, adicione 1,8 milimolar de cloreto de cálcio ao tb livre de cálcio. Utilize a solução para superfusão de cardiomiócitos durante experimentos de fluorescência de patch clamp.

Em seguida, transfira um mililitro da suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e adicione flu fort a 10 micromolar por litro e 10 microlitros de power load. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente com o tubo na posição horizontal. Posteriormente, coloque o tubo na posição vertical e deixe as células sedimentarem por cinco minutos.

Em seguida, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em tampão contendo cálcio. Transfira 0,25 mililitros da suspensão celular para uma pequena câmara de gravação montada no microscópio com controle de temperatura. Superfusão por gravidade com um sistema microfusor aquecido a uma vazão de 0,3 mililitros por minuto a 37 graus Celsius.

Usando um puxador de micropipetas, prepare pipetas para grampo de membrana com diâmetro de ponta de três a cinco micrômetros e resistência de três a 4,5 megaohms quando preenchidas com ps. Em seguida, adicione anfotericina B ao PS na concentração de 250 microgramas por mililitro e use essa solução para preencher os eletrodos, depois monte o eletrodo no suporte de pipeta. Em seguida, selecione a célula com formato de Ron, com estriações nítidas e isenta de inclusões.

Forme o selo giga e aguarde de cinco a 10 minutos até que a resistência de acesso caia abaixo de 20 ohms. Em seguida, induza potenciais de ação no modo de fixação de corrente utilizando pulsos curtos em diferentes frequências de estimulação. Durante a fase de gravação, ligue a iluminação em campo claro em 492 nanômetros e detecte a fluorescência do Fluor fort entre 505 e 520 nanômetros.

Em seguida, adquira os sinais de fluorescência e potencial de membrana. Esta figura mostra as alterações dos potenciais de ação em cardiomiócitos ventriculares das amostras de HCM. Abaixo estão os potenciais de ação representativos sobrepostos, evocados em 0,2 hertz, 0,5 hertz e um hertz, provenientes de um miócito controle e um miócito HCM.

Os potenciais de ação sobrepostos a 0,5 hertz de um miócito controle. Na ausência e na presença de 10⁻⁷ molar de isoproterenol são mostrados, e aqui está o traçado representativo do potencial de membrana de um cardiomiócito de um paciente com MCH, que exibiu várias despolarizações espontâneas precoces após a despolarização. A figura mostra as alterações do transiente de cálcio em cardiomiócitos ventriculares das amostras de MCH.

Aqui estão os transientes de cálcio representativos sobrepostos, elicitados durante a estimulação a 0,2 hertz por meio da pipeta de patch, em um miócito controle e em uma célula com miocardiopatia hipertrófica (HCM). São mostradas as cinéticas dos transientes de cálcio em cardiomiócitos com HCM e controles em diferentes momentos, e aqui estão traçados representativos prolongados mostrando o cálcio intracelular durante a estimulação em três frequências diferentes, o que destaca o aumento do cálcio diastólico em altas taxas de estimulação no miócito com HCM. Esta figura mostra aplicações experimentais adicionais utilizando miócitos ventriculares humanos.

Os traços representativos sobrepostos mostrando a corrente de cálcio do tipo L registrada em diferentes voltagens da membrana estão mostrados à esquerda, e a densidade média do pico da corrente de cálcio do tipo L proveniente de 18 células isoladas de amostras de miocárdio hipertrófico em diferentes voltagens da membrana está mostrada à direita, sendo apresentado aqui o traçado do cálcio intracelular registrado de um miócito ventricular durante estimulação elétrica por campo a um hertz. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciá-lo logo após a coleta da amostra da sala de operações, a fim de garantir a viabilidade. Após seguir este procedimento para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos, outros métodos podem ser realizados, como microscopia confocal com varredura a laser ou imunoquímica, o que será crucial para responder perguntas fundamentais, como, por exemplo, como a localização subcelular das estruturas da membrana e das unidades de liberação de cálcio é alterada nas doenças cardíacas após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho na cardiologia celular para estudar as anormalidades funcionais em cardiomiócitos ventriculares e testar a utilidade potencial de novas opções terapêuticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar cardiomiócitos únicos viáveis a partir de espécimes humanos e como caracterizar a função celular em diferentes condições.