Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

O objetivo geral deste procedimento é isolar cardiomiócitos viáveis de espécimes ventriculares humanos da doença e caracterizar suas alterações funcionais. Isso é feito primeiro coletando e picando rapidamente amostras ventriculares frescas em solução cardioplégica gelada para evitar degradação excessiva do tecido e danos celulares. O segundo passo é realizar uma digestão gradual dos pedaços do miocárdio usando um dispositivo de digestão personalizado e soluções enzimáticas.

Em seis ciclos, a célula contendo tampão é coletada em um tubo a cada ciclo e diluída com uma solução de preservação celular. A etapa final é ressuspender as células contidas nos seis tubos em um volume menor de solução fisiológica padrão com concentrações normais de cálcio para realizar a caracterização funcional. Em última análise, o registro de potenciais de ação com patch clamp e a avaliação simultânea do cálcio intercelular usando corantes fluorescentes são usados para mostrar as alterações de ação, duração do potencial e ciclagem de cálcio intracelular em cardiomiócitos de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica.

A principal vantagem do DYS único em relação a um método 16, como o método padrão de desânimo de pedaços, é que, em associação com a solução enzimática, usamos um dispositivo de digestão feito sob medida, que permite uma associação conjunta de citos variáveis graças aos seus arranhões de silício. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cardiologia, como a forma como o conhecido remodelamento molecular e estrutural associado às doenças cardíacas reflete na alteração de cardiomiócitos únicos que podem ser analisados pelo nosso método e direcionados por medicamentos específicos. Portanto, a implicação dessa técnica se estende à terapia de doenças cardíacas genéticas, como a cardiomiopatia hipertrófica.

De fato, esse método pode ser usado para testar novas abordagens neuropáticas em cardiomiócitos ventriculares de pacientes com doenças cardíacas hipertróficas ou isquêmicas submetidas a cirurgia cardíaca. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez ao comparar a analogia entre espécimes de artérias humanas e biópsias ventriculares obtidas durante cirurgia cardíaca. Comece este procedimento despejando 40 mililitros de solução cardioplégica em um tubo de 50 mililitros e armazene-o em gelo para transporte de amostras da sala de cirurgia para o laboratório de isolamento de células, transfira rapidamente a amostra para a área de laboratório e inicie o processamento da amostra dentro de 10 minutos após a excisão da amostra.

Próxima amostra miocárdica ventricular coletiva da sala de cirurgia imediatamente após a excisão. Lave-o com solução de CP gelada e guarde-o no tubo, mantendo a amostra em tampão de CP gelado. Remova cuidadosamente a camada fibrótica endocárdica usando uma tesoura fina depois.

Corte o tecido miocárdico em pequenos pedaços de dois a três milímetros de comprimento com a quantidade total de miocárdio ventricular entre 100 miligramas e um grama para cada isolamento. Depois que os pedaços forem transferidos para a câmara de raspagem do dispositivo de digestão, troque o tampão CP na câmara com tampão de dissociação livre de cálcio frio. Em seguida, coloque o dispositivo de digestão em um banho termostático.

Defina o banho para 37,5 graus Celsius e ligue-o. Em seguida, ligue o motor do dispositivo de digestão e ajuste a velocidade de rotação para uma revolução por segundo. Execute três ciclos de lavagem com DB e troque a solução na câmara com DB limpo saturado de oxigênio a 37 graus Celsius a cada oito minutos.

Depois disso, prepare o tampão enzimático um adicionando 250 unidades por mililitro de colagenase tipo cinco e quatro unidades por mililitro de protease. Digite 24 para a solução de banco de dados. Em seguida, prepare o tampão enzimático dois adicionando 250 unidades por mililitro de colagenase.

Digite cinco para a solução DB oxigenar EB um e aquecê-lo até 37 graus Celsius. Em seguida, execute dois ciclos de digestão de 12 minutos no dispositivo de digestão rotativo com três mililitros de EB 100% oxigenado a 37 graus Celsius. Remova a solução por aspiração de pipeta e descarte-a após cada ciclo.

Em seguida, prepare seis tubos de 15 mililitros para coleta de células e 80 mililitros de solução de fermentação artesanal de quatro graus Celsius para iludir os tampões oxigenados EB dois e trabalhá-lo até 37 graus Celsius. Em seguida, execute um primeiro ciclo de digestão de 15 minutos com três mililitros de EB 100% oxigenado dois a 37 graus Celsius. Após o ciclo de digestão, recolher a solução contendo os primeiros miócitos associados num tubo de 15 mililitros e diluir a suspensão celular com 12 mililitros de solução KB fria.

Armazene o tubo à temperatura ambiente, execute cinco outros ciclos de digestão de 12 minutos com três mililitros de EB dois a 37 graus Celsius e colete o miócito contendo tampão em cada ciclo em um tubo cônico de 15 mililitros. Lembre-se também de diluir o tampão coletado de três mililitros com 12 mililitros de solução KB em cada ciclo. No final, armazene as seis células contendo os tubos em temperatura ambiente.

Nesta etapa, adicione um miligrama por mililitro de albumina de soro bovino a 20 mililitros de tampão tiroscópio livre de cálcio. Em seguida, filtrar a solução em seguida, centrifugar os seis miócitos contendo tubos cónicos a 100 queijo durante cinco minutos. Para forçar os miócitos a se assentarem, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em cada tubo com uma quantidade variável de BSA contendo TB à temperatura ambiente.

Aumente gradualmente a concentração de cálcio na célula contendo tampão adicionando pequenos OTTs de 100 milimolares por litro de solução de cloreto de cálcio na primeira e segunda etapas. A concentração de cálcio é elevada para 50 micromolares por litro e 100 micromolares por litro, respectivamente. As etapas de adição de cálcio a seguir são realizadas a cada cinco minutos, e a concentração é aumentada em 100 micromolares por litro em cada etapa até uma concentração final de 0,9 milimolar por litro.

Para avaliar o rendimento do procedimento de isolamento, transfira 0,5 mililitros de solução contendo miócitos para a câmara de fundo de vidro de um microscópio. Avalie 15 campos de microscópio com ampliação objetiva de 10 x e calcule a porcentagem de miócitos saudáveis, como as células em forma de bastonete, com estrias claras e sem inclusões significativas. Os rendimentos esperados devem ser em torno de 20% para demonstrar a avaliação funcional dos cardiomiócitos humanos, incluindo registros simultâneos de potenciais de ação e fluxos de cálcio intracelular.

Primeiro, prepare a solução de pipeta para experimentos de patch clamp na configuração de patch perfurado. Em seguida, adicione 1,8 milimolar de cloreto de cálcio à tb livre de cálcio. Use a solução para superfusão de cardiomiócitos durante experimentos de fluorescência de patch clamp.

Em seguida, transfira um mililitro de suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 10 micromolares por litro de gripe forte e 10 microlitros de carga de energia. Concentrar-se incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente na posição horizontal. Em seguida, coloque o tubo na posição vertical e deixe as células repousarem por cinco minutos.

Em seguida, pipete o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cálcio contendo tb. Ponto de transferência de 25 mililitros de suspensão celular para uma pequena câmara de gravação montada em microscópio com temperatura controlada. Super fundido pela gravidade com um sistema de micro fuer aquecido a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto a 37 graus Celsius.

Usando um extrator de micropipetas, prepare pipetas de patch clamp com um diâmetro de ponta de três a cinco micrômetros e uma resistência de três a 4,5 mega ohm quando preenchidas com ps. Depois disso, adicione anfotericina B ao PS a 250 microgramas por mililitro e use-a para encher os eletrodos e, em seguida, monte o eletrodo no porta-pipeta. Em seguida, selecione a célula em forma de Ron com estrias claras e desprovida de inclusões.

Forme a vedação giga e aguarde de cinco a 10 minutos até que a resistência de acesso caia abaixo de 20 ohm. Posteriormente, elimine potenciais de ação no modo de pinça de corrente usando pulsos curtos em diferentes frequências de estimulação. Durante a fase de gravação, ligue a iluminação de campo brilhante em 492 nanômetros e detecte a fluorescência do forte de flúor em 505 a 520 nanômetros.

Em seguida, adquira os sinais de fluorescência e potencial de membrana. Esta figura mostra as alterações dos potenciais de ação nos cardiomiócitos ventriculares das amostras de CMH. Aqui estão os potenciais de ação sobrepostos representativos obtidos em 0,2 hertz, 0,5 hertz e um hertz de um miócito de controle e um miócito de CMH.

Os potenciais de ação sobrepostos a 0,5 hertz de um miócito de controle. Na ausência e presença de 10 a sete molares, o isoproterenol é mostrado, e aqui está o traço representativo do potencial de membrana de um cardiomiócito de um paciente com CMH, que exibiu várias despolarizações espontâneas logo após as despolarizações. A figura mostra as alterações transitórias de cálcio em cardiomiócitos ventriculares das amostras de CMH.

Aqui estão os transientes de cálcio sobrepostos representativos provocados durante a estimulação a 0,2 hertz por meio da pipeta de adesivo em um miócito de controle e uma célula HCM. A cinética dos transientes de cálcio na CMH e nos cardiomiócitos de controle em diferentes momentos é mostrada, e aqui estão os traços longos representativos mostrando cálcio intracelular durante a estimulação em três frequências diferentes, o que destaca o aumento do cálcio diastólico em altas taxas de estimulação no miócito da CMH. Esta figura mostra as aplicações experimentais adicionais usando miócitos ventriculares humanos.

Os traços representativos sobrepostos mostrando a corrente de cálcio do tipo L registrada em diferentes tensões de membrana são mostrados à esquerda, e a densidade média de pico de corrente de cálcio do tipo L de 18 células isoladas de amostras de HCM em diferentes voltagens de membrana é mostrada à direita e aqui é mostrado o traço de cálcio intracelular registrado de um miócito ventricular durante a estimulação do campo elétrico em um hertz. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciar o procedimento logo após a coleta da amostra na sala de cirurgia, a fim de garantir ses Após este procedimento para isolar cardiomiócitos ventriculares humanos. Outros métodos podem ser realizados, como microscopia confocal de estilo de vida ou imunoquímica, e isso será crucial para responder a questões fundamentais, como, por exemplo, como a localização subcelular de estruturas de membrana e unidades de liberação de cálcio é alterada em doenças cardíacas após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho na cardiologia celular para estudar as anormalidades funcionais nos cardiomiócitos ventriculares e testar a utilidade potencial de novas opções terapêuticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar cardiomiócitos únicos viáveis de amostras humanas e como caracterizar a função celular em diferentes condições.