Name: Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprenda a isolar cardiomiócitos ventriculares humanos viáveis de amostras cirúrgicas frescas para estudos eletrofisiológicos e testes de fármacos. Este método permite caracterizar alterações funcionais em cardiomiopatia hipertrófica.

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Este trabalho foi apoiado pela UE (STREP Projeto 241577 &quot;grande coração,&quot; 7 º Programa-Quadro Europeu, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (PB) e Gilead Sciences (AM).

Os protocolos experimentais sobre o tecido humano foram aprovados pelo comitê de ética do Careggi Hospital Universitário (2006/0024713; renovada Maio de 2009). Cada paciente deu consentimento informado por escrito. 1. Soluções e Equipamentos Preparação As soluções são descritas na Tabela 1. Um fluxograma simplificado do processo de isolamento de células encontra-se na Figura 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Solução </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> Tuberculose </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> Reagente (mM) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 50 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> adenosina </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> glicose </td><td> 140 </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> manitol </td><td> 100 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> taurina </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0,6 </td><td> 30 </td><td></td><td></td><td> 0,6 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0,6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0,6 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Na-piruvato </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ácido succínico </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K 2-ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ácido pirúvico </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> creatina </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Enzimas (U / ml) </td><td> Colagenase tipo V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ Td&gt; <td> 250 </td></tr><tr><td> Protease Tipo XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> NaOH 7,3 </td><td> 7.1 KOH </td><td> NaOH 7,35 </td><td> 7.2 KOH </td><td> NaOH 7,3 </td><td> NaOH 7,3 </td></tr></tbody></table> . Tabela 1 Soluções utilizadas para a coleta de amostras, isolamento de células e caracterização funcional de miócitos CP = solução cardioplégica.; DB = tampão de dissociação; KB = solução Kraft-Brühe; TB = tampão Tyrode; PS = solução da pipeta; EB1 = tampão de enzima 1; EB2 = tampão de enzima 2. <ol><li> Solução cardioplégica (CP) Preparar. CP solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até 1 semana. </li><li> Prepare Ca 2 tampão de dissociação livre de + (DB). Esta solução deve ser usado durante o dia. </li><li> Preparar a solução Kraft-Brühe (KB). KB solução pode ser armazenada a 4 ° C durante até uma pequeninak. </li><li> Prepare Ca tampão Tyrode livre de + 2 (TB). Esta solução deve ser usado durante o dia. </li><li> Filtrar todas as soluções usando filtros de seringa, antes da utilização. </li><li> Preparar o aparelho de digestão (Figura 2), um recipiente de raspagem feita de duas escovas de frente de elastómero de silicone, um dos quais rodados por um motor eléctrico. O dispositivo digestão é feito sob encomenda. Detalhes sobre o dispositivo de digestão são na Figura 8; imagens do dispositivo estão nas Figuras 2 C e 2D. Lava-se a câmara de tecido com 70% de etanol e água. </li></ol> 2. Coleta e Processamento de Amostras do miocárdio <ol><li> Verter 40 ml da solução cardiplegic (CP) num tubo de 50 ml e armazena-o em gelo durante o transporte da amostra a partir do quarto dispositivo para o isolamento de células de laboratório. </li><li> Colete a amostra do miocárdio ventricular da sala operatória imediatamente após a excisão, lave-o com gelo frioSolução CP e armazená-lo no tubo. Use espécimes endocárdio excisadas do septo ventricular, entre superior durante a cirurgia de coração aberto, ponderação&gt; 100 mg. </li><li> Rapidamente transferir a amostra para a área do laboratório; iniciar o processamento da amostra dentro de 10 minutos a partir de amostra de excisão. </li><li> Enquanto mantém a amostra em tampão gelado CP, retire cuidadosamente a camada fibrosa endocárdica usando tesoura fina sob estereomicroscópio; depois, cortar o tecido do miocárdio para pequenas peças (2-3 mm de comprimento). Dependendo do tamanho da amostra de tecido, cortar uma quantidade total de miocárdio ventricular entre 100 mg e 1 g para cada isolamento. </li><li> Após a conclusão da picagem tecido, transfira os pedaços do miocárdio no dispositivo digestão, com gelo limpo solução CP frio. Evitar preenchendo todo o volume entre as duas escovas de silício (3-4 ml) com os pedaços do miocárdio, utilizando-se não mais do que 1 g de tecido total. </li></ol> 3. Lavar e digestão de miocárdio Pedaços <ol><li> À réer os pedaços são transferidos para a câmara de raspagem do dispositivo digestão, mudar o tampão CP na câmara de frio Ca 2 + tampão de dissociação-free (DB). </li><li> Colocar o dispositivo de digestão num banho termostático, de modo para a câmara de estar em contacto com a água aquecida no banho (Figura 1). Definir o banho a 37,5 ° C e ligá-lo, a fim de aumentar lentamente a temperatura da câmara de tecido. Ligar o motor do dispositivo de digestão, a definição da velocidade de rotação de 1 volta / segundo. </li><li> Realizar 3 ciclos de lavagem com DB, mudando a solução na câmara de limpeza com DB a cada 8 minutos. A DB é aquecido (37 ° C) e oxigênio saturado antes de entrar em contato com os pedaços do miocárdio. </li><li> Preparar tampão de enzima 1 (EB1) por adição de 250 U / ml de colagenase de tipo V e 4 U / mL de protease do tipo XXIV solução DB. Prepare tampão da enzima 2 (EB2), adicionando 250 U / ml de colagenase tipo V a solução DB. Aquecimento (37 ° C) e oxygenate EB1 e EB2. </li><li> Realizar dois ciclos de 12 min de digestão no dispositivo de digestão rotativo com 100% EB1 oxigenado (a 37 ° C). Em cada ciclo, utilizar ~ 3 ml de EB1. Remover a solução com uma pipeta de aspiração e descartá-lo após cada ciclo. </li><li> Prepare a 6 tubos de 15 ml para recolha de células, e ~ 80 mL de água fria (4 ° C) solução KB para a eluição dos tampões. </li><li> Realizar um primeiro ciclo de digestão de 15 minutos com 3 ml de 100% EB2 oxigenada a 37 ° C. Após o ciclo de digestão, recolher a solução contendo os primeiros miócitos dissociadas num tubo de 15 ml e dilui-se a suspensão de células com 12 ml de solução fria KB. Guarde o apartamento tubo à temperatura ambiente. </li><li> Diluir a solução EB2 restante com uma quantidade igual de DB, a fim de reduzir pela metade a concentração de colagenase V para os seguintes ciclos de digestão. </li><li> Realizar outras cinco ciclos de 12 min de digestão com 3 ml EB2 a 37 ° C; depois de cada um deles recolher de miócitos contendo tampão, num tubo cónico de 15 ml ediluir com 12 ml de solução KB. Armazenar as 6 células contendo os tubos à temperatura ambiente durante 30 min. </li></ol> 4. Resuspensão Celular e Ca 2 + Readaptação <ol><li> Adicionar 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) a 20 ml de tampão de Ca 2 +-Tyrode livre (TB). Filtrar a solução. </li><li> Centrifugar os seis miócitos contendo tubos cônicos a 100 xg por 5 min para forçar miócitos para resolver. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em cada um dos tubos com uma quantidade variável (1-3 ml, dependendo do rendimento) de BSA contendo TB, à TA. </li><li> Aumentar gradualmente a concentração de Ca2 + na célula contendo tampão através da adição de pequenas alíquotas de 100 mmol / L de solução de CaCl 2. Na primeira e na segunda etapas concentração de Ca2 + é elevado até 50 pmol / L e 100 pmol / L, respectivamente. Os seguintes passos de Ca 2 + de adição são realizadas a cada 5 min e a concentração é aumentada em 100 mmol / L em cada passo toa concentração final de 0,9 mmol / L. </li><li> Avaliar o rendimento do processo de isolamento. Transferir 0,5 ml de solução contendo miócitos para a câmara de fundo de vidro de microscópio. Avaliar 15 campos do microscópio em 10x objetivo e calcular a percentagem de miócitos saudáveis ​​(por exemplo, em forma de bastonetes com estrias claras e sem inclusões significativas, Figura 2). O rendimento previsto é de cerca de 20%. </li></ol> 5. Avaliação Funcional de isolado cardiomiócitos. O protocolo a seguir é um exemplo de avaliação funcional cardiomiócitos humano, incluindo gravações simultâneas de potenciais de ação e Ca 2 + intracelular fluxos. <ol><li> Preparar a solução de pipeta (PS) para experimentos de patch clamp na configuração de patch perfurado. A solução pode ser armazenada a -20 ° C durante até 3 meses. </li><li> Adicionar 1,8 mmol / L de CaCl 2 a 2 Ca tampão Tyrode + livre (TB). Use esta solução para superfusão de cardiomiócitos durante as experiências braçadeira patch / fluorescência. </li><li> Transferir 1 ml de suspensão de células para um tubo de 1,5 ml e adicionam-se 10 mmol / L e 10 ul Fluoforte Concentrado carga de potência. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, defina o tubo na posição vertical e deixar a célula de se contentar com 5 min; ressuspender as células em Ca 2 + contendo TB. </li><li> Transferir 0,25 ml de suspensão de células para um pequeno (0,5 ml), temperatura controlada microscópio montado câmara de registo, superfundidas por gravidade com um sistema microperfusor aquecido a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C). </li><li> Usando um puxador de micropipeta, preparar pipetas de fixação de membranas com um diâmetro de ponta de 3-5 um e uma resistência de 3 a 4,5 M, quando cheio com o PS. </li><li> Adicionar anfotericina B para um lote de PS (250 ug / ml) e usá-lo para preencher os eléctrodos. </li><li> Selecione uma célula em forma de haste com estrias claras, desprovido de inclusões, form o selo giga e esperar de 5 a 10 min, até que a resistência de acesso for inferior a 20 mohms. </li><li> Provocar potenciais de ação no modo de fixação de corrente usando pulsos de curta duração (&lt;3 ms) em diferentes frequências de estimulação (0,2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz, 1 min em cada freqüência). Durante a fase de gravação, ligar a iluminação de campo claro a 492 ± 3 nm e detectar Fluoforte fluorescência em 505-520 nm. Adquirir fluorescência e potencial de membrana usando sinais Digidata 1440A e 10,0 software pClamp. Repita a seqüência de gravação várias vezes, se necessário; no entanto, manter o tempo total de gravação inferior a 15 min, para cada célula. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos e validado um método para isolar os miócitos viáveis ​​a partir de amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. A partir de protocolos descritos anteriormente que tinham sido usados ​​com sucesso para células isoladas a partir de amostras cirúrgicas atriais, a técnica para permitir a separação de miócitos viáveis ​​individuais de miocárdio ventricular doente foi desenvolvido e afinado. Os primeiros relatos mostraram que o isolamento dos cardiomiócitos individuais de pedaços de tecido atrial e ven...

Dissecção das propriedades eletrofisiológicas do miocárdio progrediu acentuadamente após o desenvolvimento de técnicas para o isolamento individual dos miócitos cardíacos. Os recentes avanços na compreensão da excitação cardíaca Contração Coupling (EC-acoplamento) também têm sido possível graças à capacidade de isolar cardiomiócitos únicos viáveis ​​que conservam todas as propriedades fisiológicas do tecido intacto. Métodos de patch clamp são rotineiramente utilizados para estudar a função e modulação farmacológica de correntes iônicas sarcolemais cardíaca. Gravações da dinâmica de cálcio intracelular com Ca 2 + corantes sensíveis também são realizados regularmente em miócitos cardíacos individuais a partir de uma variedade de modelos saudáveis ​​e doentes, fornecendo dados vitais sobre a fisiologia da EC-acoplamento, bem como sobre as alterações patológicas de Ca 2 + intracelular homeostase levando a prejuízo mecânica e aumento da carga arritmogênica em doenças cardíacas. Informação a partir desses estudos é fundamental para a compreensão dos efeitos eletrofisiológicos e mecânicas de drogas no ambiente clínico. No entanto, existem diferenças específicas de espécies nas correntes transmembrana e nas proteínas EC-de acoplamento que são responsáveis ​​por características específicas do potencial de ação cardíaco e mecânica cardíaca. Assim, enquanto os estudos de miócitos isolados de mamíferos não humanos elucidaram as propriedades biofísicas e as funções fisiológicas dos canais iônicos transmembrana específicos e proteínas EC-acoplamento, eles não fornecem necessariamente modelos relevantes de miócitos cardíacos humanos. Isolamento de miócitos viáveis ​​do miocárdio humano é, portanto, essencial para compreender plenamente a fisiopatologia das doenças cardíacas e validar novas abordagens terapêuticas. Tecido atrial humano está prontamente disponível como apêndices atriais estão muitas vezes descartados durante os procedimentos cirúrgicos. Estudos quantitativos iniciais do potencial de ação cardíaco humanos adultos e cu iônicarrents empregada células atriais enzimaticamente isolados 1-4. Gravações de potenciais de ação ou correntes a partir de células humanas adultas ventriculares isoladas foram posteriormente relatado 3,5-10. A maioria destes estudos utilizaram células obtidas a partir de corações de explante e utilizados ou de perfusão com colagenase de um segmento da artéria coronária ou a exposição de quantidades relativamente grandes de tecido excisado de colagenase para obter células isoladas. Esses estudos permitiram uma caracterização detalhada de uma série de correntes de íons transmembrana de cardiomiócitos do ventrículo humanos de corações saudáveis ​​e de pacientes com insuficiência cardíaca terminal. As gravações de tipo-L de Ca 2 + de corrente (I Ca-L) 5-7, a corrente de potássio para fora transitórias (I) 8, para dentro de potássio rectificador de corrente (I κ1) 8, os diferentes componentes da corrente de potássio rectificador retardado (I κ ) 9 foram relatados. Avanços e refino deo procedimento de isolamento 10, permitiu uma caracterização clara da base iônica do aumento do potencial arritmogênico na insuficiência cardíaca terminal, compreendendo acção potencial prolongamento 11, adiada após despolarizações 12 e aumentou engraçado atual 13 levando a despolarização diastólica e batimentos prematuros. Miócitos cardíacos adultos são normalmente isolados a partir de pequenos animais por perfusão retrógrada do coração com toda a várias misturas de enzimas, uma técnica que produz rendimentos elevados de Ca 2 + as células tolerantes a 14. Isolamento de miócitos cardíacos de fragmentos de tecido é inerentemente menos bem sucedida, provavelmente devido ao acesso limitado de enzimas de miócitos individuais em comparação com a obtida por perfusão das artérias coronárias. Por causa da disponibilidade muito limitada de corações doados não utilizados, a única maneira prática de obter células ventriculares humanos normais em uma base regular é de digestio enzimátican dos fragmentos de tecido, muitas vezes muito pequenas excisadas durante procedimentos cirúrgicos eletivos. O único modelo de doença humana, que foi completamente caracterizada a nível celular é a insuficiência cardíaca terminal, devido à acessibilidade aos corações transplantados. No entanto, insuficiência cardíaca terminal ocorre numa minoria de pacientes e muitas vezes envolve uma via comum de remodelação grave de células do miocárdio, que é relativamente independente da causa subjacente 15. A capacidade de avaliar a função dos cardiomiócitos individuais de pacientes em um estágio não falha precoce da doença é fundamental para entender a fisiopatologia específica de diferentes condições hereditárias ou adquiridas. A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é um bom exemplo. HCM é uma comum (1/500 indivíduos) condição cardíaca hereditária caracterizada por hipertrofia cardíaca, aumento do risco e alterações contráteis arritmogénicos devido à obstrução da via de saída e disfunção diastólica 16. Cardiomiócitos de HCM corações undergo um processo de remodelação complexa, envolvendo mudanças na estrutura celular (hipertrofia, desarranjo miofibrilar) e EC-Coupling 17. No entanto, a maioria das informações de disfunção dos miócitos na CMH vem de modelos animais transgênicos. Uma vez que apenas uma minoria dos pacientes com CMH evolui para insuficiência cardíaca terminal e requer transplante cardíaco, HCM corações estão muito raramente disponíveis para o isolamento de células com métodos padrão. No entanto, pelo menos 30% dos portadores de CMH desenvolver sintomas obstrutivos, devido ao enorme fluxo de sangue do trato hipertrofia septal alterando fluxo durante a sístole (HCM) 18. A opção terapêutica disponível mais eficaz para o alívio da obstrução na CMH é a miectomia septal cirúrgica: durante o procedimento cirúrgico, uma parcela variável tamanho do septo superior é removido por abordagem da aorta trans. Esta porção do septo hipertrofiado é, por conseguinte, disponível para o isolamento de células a partir de tecido fresco. Um método para o isolamento de ventricula humanor miócitos de, pequenas amostras de biópsia endomiocárdica transvenous único previamente desenvolvido e publicado em 19. Implementamos um método para isolar miócitos septo individuais a partir de amostras do miocárdio ventricular de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca, incluindo pacientes com CMH submetidos a miectomia septal e pacientes submetidos a procedimentos de substituição de válvulas. Para além de uma descrição detalhada do protocolo de isolamento, electrofisiológico representativa e Ca 2 + de fluorescência as medições são apresentados, demonstrando a viabilidade dos isolados miócitos ventriculares humanos e a viabilidade de patch-clamp e intracelulares de Ca 2 + estudos.

<table><tbody><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp; região = IT">P9791 </a></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado(MgSO4*7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp; região=IT">M1880 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp; região=IT">H3375 </a></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp; região=IT">A9251 </a></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp; região=IT">G8270 </a>Manitol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp; region=IT">M4125 </a></td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp; região = IT">S7653</a></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp; região=IT">P9333 </a></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp; região=IT">S7907 </a></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp; região=IT">S6297 </a></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de potássio (KHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp; região=IT">237205</a></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp; região=IT">P2256 </a></td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanodiona monóxima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp; região=IT">B0753 </a></td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp; região = IT">S8045 < / a></td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido glutâmico sal monopotássico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp; região=IT">49601</a></td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp; região=IT">107360</a></td><td></td></tr><tr><td>ácido 3-hidroxibutírico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp; região=IT">166898</a></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sal dipotássico di-hidratado (K2-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp; região=IT">A8937</a></td><td></td></tr><tr><td>Creatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp; região=IT">C0780 </a></td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp; região=IT">S3674 </a></td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp; região=IT">E0396 </a></td><td></td></tr><tr><td>Albumina do soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp; região=IT">A0281</a></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp; região=IT">M8266 </a></td><td></td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum, Tipo V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp; region=IT">C9263 </a></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase, Bacteriana, Tipo XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de cálcio, ~1 M em H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp; região=IT">21115</a></td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de cálcio 0,1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp; região=IT">53704</a></td><td></td></tr><tr><td>Metanossulfonato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp; região=IT">83000</a></td><td></td></tr><tr><td>FluoForte Reagente</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>Concentrado de carga de potência, 100X</td><td>Sistema de</td> passo rápido de perfusão <td>Life Technologies P10020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B solubilizada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp; region=IT">A9528 </a></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B amplificador patch-clamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&nbsp;</td>Dispositivo de Digestão de <td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PERSONALIZADO</td><td>O</td><td>dispositivo é feito sob medida em nosso laboratório usando tubos de plástico, Sylgard fundido e um motor; é descrito em detalhes na Figura 1C-1D e na Figura 7. Podemos fornecer mais detalhes, se solicitado.</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone para escovas do dispositivo de digestão</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Motor rotativo de velocidade variável para o dispositivo de digestão</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>Molde para escovas fundidas</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>O molde é feito sob medida a partir de hastes padrão de PTFE de 2,5 cm de diâmetro.</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização funcional de ventricular humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomiócitos de corações doentes são submetidos a processos de remodelação complexas que envolvem mudanças na estrutura celular, acoplamento excitação contração e correntes de íons de membrana. Essas mudanças tendem a ser responsáveis ​​pelo aumento do risco arritmogênica e as alterações contráteis levando à disfunção sistólica e diastólica em pacientes cardíacos. No entanto, a maior parte da informação sobre as alterações da função dos miócitos em doenças cardíacas veio a partir de modelos animais. Aqui vamos descrever e validar um protocolo para isolar miócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular de pacientes submetidos a operações de cirurgia cardíaca. O protocolo está descrito em detalhe. Medições de cálcio e eletrofisiológicos intracelulares são relatados para demonstrar a viabilidade de uma série de medições de células individuais em cardiomiócitos ventriculares humanos obtidos com este método. O protocolo relatado elere pode ser útil para futuras investigações de base celular e molecular das alterações funcionais do coração humano, na presença de doenças cardíacas diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para identificar novos alvos terapêuticos a nível celular e para testar a eficácia de novos compostos em cardiomiócitos humanos, com valor de translação directa.

O método descrito acima foi utilizado para caracterizar as anormalidades funcionais de cardiomiócitos isolados do septo interventricular de pacientes com cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que se submeteram à operação miectomia, em comparação com pacientes não falhando não hipertróficas cirúrgicos 21. Os resultados contidos nesta secção são derivados de trabalho 21 e que são mostrados aqui como um exemplo de como esta técnica pode ser utilizada para caracterizar as alterações da função das células d...

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar cardiomiócitos viáveis de espécimes ventriculares humanos com doença e caracterizar suas alterações funcionais. Isso é realizado primeiramente coletando e picando rapidamente amostras ventriculares frescas em solução cardióplica gelada, a fim de evitar degradação excessiva do tecido e danos celulares. O segundo passo consiste em realizar uma digestão escalonada dos fragmentos miocárdicos utilizando um dispositivo de digestão personalizado e soluções enzimáticas.Em seis ciclos, a célula contendo tampão é coletada em um tubo a cada ciclo e diluída com uma solução conservante de células. O passo final consiste em ressuspender as células contidas nos seis tubos em um volume menor de solução fisiológica padrão com concentrações normais de cálcio, a fim de realizar a caracterização funcional. Por fim, utiliza-se gravação por patch clamp de potenciais de ação e avaliação simultânea do cálcio intercelular por meio de corantes fluorescentes para demonstrar as alterações no potencial de ação, na duração do potencial e no ciclo de cálcio intracelular em cardiomiócitos de pacientes com miocardiopatia hipertrófica.A principal vantagem do método DYS ú

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Descrevemos o isolamento de miócitos atriais humanos, que podem ser utilizados para a intracelular de...

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

Neste artigo, é fornecido um método para isolar cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica bioptic amostras de pacientes de cardiomiopatia arrhythmogenic. Sua caracterização e o protocolo para impulsionar sua diferenciação de adipogenic são descritos.

Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (&lt;50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Aprenda a isolar cardiomiócitos ventriculares humanos viáveis de amostras cirúrgicas frescas para estudos eletrofisiológicos e testes de fármacos. Este método permite caracterizar alterações funcionais em cardiomiopatia hipertrófica.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

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