Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens quantitativas de células tumorais de próstata tratadas para medir o grau e a extensão da autofagia em diferentes pontos temporais. Isso é realizado primeiramente tratando as células com arginina, dase ou outros reagentes experimentais para induzir autofagia e/ou morte celular. O segundo passo é decidir se as células vivas ou fixadas serão submetidas à análise de imagem e preparar as amostras de acordo.

Em seguida, obtenha imagens de fluorescência 3D de células vivas ou fixadas utilizando microscopia de fluorescência em campo amplo, desconvolução ou iluminação estruturada. O passo final é coletar dados estatísticos sobre a distribuição do tamanho dos autofagossomos e sua colocalização com outras estruturas intracelulares. Utilizando software digital de análise de imagens 3D, esta abordagem pode gerar resultados que demonstram não apenas a indução de autofagia pela arginina dase capaz de causar morte celular em tumores de próstata, mas também que essas células exibem alterações estruturais morfologicamente distintas das alterações associadas à apoptose e à necrose.

A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos atualmente existentes é que a imagem 3D quantitativa pode mostrar quando e onde um evento molecular específico ocorre dentro de uma célula viva e, em seguida, apresentá-lo em um formato tridimensional. Para começar, cultive células de câncer de próstata humano que expressam proteína verde fluorescente, acoplada à cadeia leve três, em placas de cultura de 35 milímetros com fundo de vidro revestido com poli-l-lisina, conforme descrito no protocolo do texto. As células devem ser semeadas em densidade suficiente para facilitar a proliferação rápida, mas não em excesso, de modo que as células não fiquem superconfluentes e agrupadas no momento da aquisição de imagens. Trate amostras selecionadas de células com arginase ou DI em PBS para esgotar as células de arginina livre e induzir estresse metabólico nas células cancerígenas aproximadamente uma hora antes da aquisição de imagens. Dilua 1,5 µL de LysoTracker Red com 20 mL de RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos. Prepare soluções com DI para as amostras selecionadas que foram tratadas após aquecer todos os meios a 37 °C.

Adicione o meio apropriado a cada placa de cultura e incube as células com RPMI contendo LYO Tracker vermelho por 15 a 45 minutos a 37 graus Celsius, aproximadamente 30 minutos antes da aquisição de imagens. Ligue a estação meteorológica com recinto ambiental e permita a equilibração a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, lave as células com PBS e substitua o meio por RPMI padrão contendo apenas 10% de FBS e 1% de antibióticos. Adicione um DI às amostras conforme indicado.

Monte placas de cultura com fundo de disco de vidro de cobertura de 35 milímetros em um adaptador personalizado. Utilize óleo de imersão na objetiva de aumento seis DX e abertura numérica 1,42 e posicione a placa de cultura montada na platina do microscópio. Neste vídeo, a microscopia 3D é demonstrada utilizando o microscópio de desconvolução Delta Vision Personal DV e o pacote de aplicativos Associated Soft Works.

Para começar, ligue o sistema do microscópio, incluindo a estação de aquisição e o controlador do instrumento. Abra o aplicativo de controle computadorizado do resolve 3D para inicializar a platina do microscópio e ligar a fonte de luz de xenônio. Aguarde 10 minutos para que a fonte de luz aqueça e atinja condições estáveis.

Adicione uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de ampliação DX seis, com abertura numérica de 1,42, e centralize o espécime do lâmina com a lamínula voltada para baixo sobre a lente objetiva utilizando iluminação de campo claro ou externa, bem como o foco grosseiro. Ajuste o botão lentamente para elevar a lente objetiva até que a gota de óleo de imersão entre em contato com a lamínula invertida. A partir desse ponto, a camada celular deverá entrar em foco em algumas voltas do botão de ajuste de foco fino.

Ao trabalhar com amostras fixadas nas lâminas, recomenda-se evitar células dentro ou próximas a áreas com bolhas. Ao observar amostras vivas no prato com fundo de vidro, evite mover a lente objetiva para fora dos limites da lamínula de vidro. Selecione o campo de visão desejado.

Teoricamente, as células devem apresentar um bom sinal fluorescente em todos os canais apropriados e estar suficientemente aderidas e espalhadas sobre a superfície do lamínula, de modo que o conteúdo intracelular seja fácil de visualizar. Pequenos ajustes laterais nos eixos X, Y e Z podem ser controlados pelo computador utilizando a interface de aquisição 3D. Configure o binning para um por um ou dois por dois, dependendo do campo de visão desejado para uma determinada imagem através da seção mediana de uma célula, e defina os parâmetros de exposição de forma que a intensidade máxima do pixel não exceda 3000 contagens.

Em geral, a porcentagem de transmissão deve ser definida tão baixa quanto possível sem aumentar o tempo de exposição correspondente. Tempo acima de um segundo. Repita este procedimento para cada cor de fluorescência a ser imageada e para cada campo de visão separado.

Para obter imagens da mais alta qualidade, defina os limites superior e inferior do Zack ajustando o foco ligeiramente acima e abaixo da amostra celular, respectivamente. O número total de imagens em uma determinada pilha Z será, portanto, determinado por esses limites e pelo espaçamento entre as camadas. Para minimizar artefatos de movimento durante a aquisição de imagens, o modo de aquisição de imagens pode ser definido por comprimento de onda.

Em seguida, pilha ZS para amostras fixadas e pilha ZS seguida de comprimento de onda para amostras vivas. Após todos os parâmetros serem definidos, as imagens de fluorescência podem ser adquiridas. As imagens de fluorescência são então desconvoluídas usando o SoftWorx e posteriormente analisadas usando o Velocity.

A sequência de imagens mostrada aqui demonstra as alterações físicas que ocorrem nas células cwr 22 durante os primeiros 80 minutos da indução da autofagia. Nessas imagens, a linha pontilhada branca representa o contorno da célula e a região levemente sombreada indica a posição do núcleo. Ao longo de 80 minutos, as imagens revelam o deslocamento do núcleo para longe do centro da célula, a redução dos pontos de adesão focal e a translocação geral de autossomos e lisossomos em direção ao centro da célula, exibidos aqui em verde e vermelho, respectivamente, em pontos temporais posteriores.

Um pequeno aumento na colocalização também foi observado entre autossomos e lisossomos, indicado pela cor amarela. O pacote de aplicativos de imagem digital Velocity foi então utilizado para identificar, contar e coletar dados estatísticos sobre autossomos e lisossomos marcados nas imagens das células CWR 22. Aqui mostrado, o número e o tamanho dos autossomos após sua formação inicial variam com o tempo.

Após 80 minutos de indução da autofagia, observou-se uma diminuição gradual e líquida no número de autofagossomos, com um aumento correspondente no tamanho médio dos autofagossomos. Além disso, houve um aumento mensurável na colocalização dos autofagossomos e lisossomos, com base na análise do coeficiente de correlação de Pearson. Em conjunto, esses achados sugerem que, após a estimulação da autofagia, numerosos autofagossomos pequenos se fundiram para formar autofagossomos maiores ao longo do tempo.

É mostrada aqui uma comparação lado a lado de imagens adquiridas e reconstruídas no modo DV, desconvolução simulada de campo amplo versus modo de iluminação estruturada. Utilizando o microscópio OMX, a resolução lateral foi melhorada até 120 nanômetros, o dobro da resolução da microscopia convencional limitada pela difração. A colocalização em pequena escala de autossomos e lisossomos ficou claramente aparente com a microscopia de super-resolução, enquanto era quase imperceptível com a imagem de fluorescência convencional.

Uma das vantagens do uso da microscopia de desconvolução é reconstruir todas as imagens em um modelo 3D que revelará informações espaciais mais precisas entre diferentes moléculas. É mostrada aqui uma visão geral de uma célula Cwr 22 RV submetida à autofagia em um ponto temporal posterior, no qual começa a ocorrer uma quantidade significativa de colocalização entre autofagossomos e lisossomos. A coloração coerente, indicada na cor branca, revela o contorno da célula-alvo neste filme.

O modelo reconstruído em 3D fornece mais detalhes espaciais da fusão entre autossomos e lisossomos. Como indicado na cor amarela, a interação entre os sinais verdes da cadeia leve três e os sinais vermelhos dos lisossomos é evidente pela presença de sinais sobrepostos que produzem a cor amarela. Assim, esta abordagem abordará dois grandes desafios para pesquisadores que estudam autofagia.

Primeiramente, queremos manter um ambiente livre de estresse utilizando fluido microfluídico e a câmara de perfusão para manter a condição fisiológica original sobre as platinas do microscópio. O segundo desafio é coletar dados de imagem quantitativos com relevância estatística; para células fixadas, normalmente tiramos muitas imagens de diferentes células e as compilamos em informações úteis. No entanto, com células vivas, acompanhamos apenas uma célula ao longo do tempo para adquirir informações equivalentes.

Portanto, acreditamos que esta técnica permitirá que outros pesquisadores estudem a função e o papel da autofagia em diferentes órgãos e doenças.