Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens quantitativas de células tumorais de próstata tratadas para medir o grau e a extensão da autofagia em diferentes momentos. Isso é feito tratando primeiro as células com arginina, dase ou outros reagentes experimentais para induzir a autofagia e/ou a morte celular. O segundo passo é decidir se deve obter imagens de células vivas ou células fixas e preparar as amostras de acordo.

Em seguida, obtenha imagens de fluorescência 3D de células vivas ou fixas usando microscopia de fluorescência de campo amplo, deconvolução ou iluminação estruturada. A etapa final é coletar dados estatísticos sobre a distribuição do tamanho do autofagossomo e a colocalização com outras estruturas intracelulares. Usando um software de análise de imagem digital 3D, essa abordagem pode obter resultados que mostram não apenas que a autoindução de fagos pela arginina dase pode causar a morte de células tumorais da próstata, mas também que essas células exibem alterações estruturais morfologicamente distintas das alterações associadas à apoptose e necrose.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos atualmente existentes é que a imagem 3D quantitativa pode mostrar quando e onde um evento molecular específico ocorre dentro de uma célula viva e, em seguida, apresentá-lo em um formato tridimensional Para começar a cultivar células de câncer de próstata humano expressando proteína fluorescente verde, cadeia leve acoplada três em placas de cultura de fundo de vidro revestidas de poli de licina de 35 milímetros, conforme descrito no protocolo de texto, as células devem ser revestidas com densidade suficiente para facilitar a proliferação rápida, mas não tanto que as células estejam crescidas e agrupadas no momento da imagem. Trate amostras de células selecionadas com arginina dase ou um DI em PBS para esgotar as células de arginina livre e induzir estresse metabólico nas células cancerígenas aproximadamente uma hora antes da imagem diluir 1,5 microlitros de Lyo tracker vermelho com 20 mililitros de RPMI contendo 10% FPS e 1% antibióticos. Prepare soluções com um DI para as amostras selecionadas que foram tratadas após o aquecimento de todos os meios a 37 graus Celsius.

Adicione o meio apropriado a cada placa de cultura, incube as células com RPMI contendo LYO Tracker vermelho por 15 a 45 minutos a 37 graus Celsius, aproximadamente 30 minutos antes da imagem. Ligue o recinto ambiental da estação meteorológica e permita o equilíbrio de 37 graus Celsius e 5% de células de lavagem de dióxido de carbono com PBS e substitua a mídia por RPMI padrão contendo apenas 10% de FBS e 1% de antibióticos. Adicione um DI às amostras conforme indicado.

Monte placas de cultura com fundo de vidro de cobertura de 35 milímetros em um adaptador personalizado. Use óleo de imersão na lente objetiva de abertura numérica de 1,42 com ampliação de seis DX e posicione a placa de cultura montada na platina do microscópio. Neste vídeo, a microscopia 3D é demonstrada usando a posição pessoal de IDV da visão Delta, o microscópio de deconvolução e o conjunto de aplicativos Associated Soft Works.

Para começar, ligue o sistema de microscópio, incluindo a estação de trabalho de aquisição e o controlador do instrumento. Abra o aplicativo de controle de computador resolve 3D para inicializar a platina do microscópio e ligar a fonte de luz de xenônio. Aguarde 10 minutos para que a fonte de luz aqueça e atinja condições estáveis.

Adicione uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de abertura numérica de 1,42 com ampliação de seis DX e centralize a amostra da lâmina com a lamínula voltada para baixo sobre a lente objetiva usando campo claro ou iluminação externa, bem como o foco grosseiro. Botão de ajuste levante lentamente a lente objetiva até que a batida do óleo de imersão entre em contato com a lamínula invertida. A partir deste ponto, a camada de células deve entrar em foco dentro de algumas voltas do botão de ajuste de foco fino.

Ao trabalhar com amostras fixas nas lâminas, é recomendável evitar células dentro ou perto de áreas com bolhas. Ao visualizar com amostras vivas no prato inferior de vidro, evite mover a lente objetiva para fora do limite da lamínula de vidro. Selecione o campo de visão desejado.

Idealmente, as células devem exibir um bom sinal fluorescente em todos os canais apropriados e estar suficientemente conectadas e espalhadas na superfície da lamínula para que o conteúdo intracelular seja fácil de visualizar. Pequenos ajustes no foco lateral X, Y e Z podem ser controlados pelo computador usando a interface 3D de aquisição. Defina Benning para um por um ou dois por dois, dependendo do campo de visão desejado para uma determinada imagem através da seção central de uma célula, defina os parâmetros de exposição de forma que a intensidade máxima de pixels não exceda 3000 contagens.

Geralmente, a porcentagem de transmissão deve ser definida o mais baixo possível, sem aumentar a exposição correspondente. Tempo superior a um segundo. Repita esse procedimento para cada cor de fluorescência a ser fotografada e para cada campo de visão separado.

Para obter imagens da mais alta qualidade, defina os limites superior e inferior do Zack ajustando o foco ligeiramente sobre a parte superior e inferior da amostra de célula, respectivamente. O número total de imagens em uma determinada pilha Z será, portanto, determinado por esses limites e pelo espaçamento entre as camadas. Para minimizar artefatos de movimento durante a aquisição da imagem, o modo de aquisição da imagem pode ser definido como comprimento de onda.

Em seguida, pilha ZS para amostras fixas e pilha ZS e comprimento de onda para amostras vivas. Depois que todos os parâmetros forem definidos, as imagens de fluorescência podem ser adquiridas. As imagens de fluorescência são então devolvidas usando trabalhos suaves e posteriormente analisadas usando velocidade.

A sequência de imagens mostrada aqui mostra as mudanças físicas que ocorrem nas células cwr 22 durante os primeiros 80 minutos de indução da autofagia. Nessas imagens, a linha pontilhada branca representa o contorno da célula e a região sombreada clara representa a posição do núcleo. Ao longo de 80 minutos, as imagens revelam o deslocamento do núcleo para longe do centro da célula, redução dos pontos de adesão focal e translocação geral de autossomos e lisossomos em direção ao centro da célula, exibidos aqui em verde e vermelho, respectivamente, em pontos de tempo posteriores.

Um pequeno aumento na colocalização também foi observado entre autossomos e lisossomos, conforme indicado pela cor amarela. O conjunto de aplicativos de imagem digital de velocidade foi então usado para identificar, contar e coletar dados estatísticos sobre autossomos e lisossomos marcados nas imagens das células CWR 22. Mostrado aqui, o número e o tamanho dos autossomos após sua formação inicial no aparecimento variam com o tempo.

Após 80 minutos de indução da autofagia, houve uma diminuição gradual do número de autossomos com um aumento correspondente no tamanho médio dos autossomos. Além disso, houve um aumento mensurável na colocalização dos autossomos e lisossomos com base na análise do coeficiente de correlação de Pearson. Juntos, esses achados sugeriram que, após a estimulação da autofagia, vários autossomos pequenos se transformaram em autossomos maiores ao longo do tempo.

Aqui é mostrada uma comparação lado a lado de imagens adquiridas e reconstruídas no modo DV, deconvolução de campo amplo simulada versus modo de iluminação estruturada. Usando o microscópio OMX, a resolução lateral foi melhorada para até 120 nanômetros, duas vezes a resolução da microscopia limitada por difração convencional. A colocalização em pequena escala de autossomos e lisossomos foi claramente aparente com microscopia de super-resolução, enquanto dificilmente foi evidente com imagens de fluorescência convencionais.

Uma das vantagens de usar a microscopia de deconvolução é reconstruir todas as imagens em um modelo 3D que revelará informações espaciais mais precisas entre diferentes moléculas. Aqui é mostrada uma imagem geral de uma célula Cwr 22 RV uma em autofagia em um ponto de tempo posterior, onde uma quantidade significativa de colocalização entre autossomos e lisossomos começa a ocorrer. A coloração coerente e indicada na cor branca, revela o contorno da célula-alvo neste filme.

O modelo reconstruído em 3D fornece mais detalhes espaciais da fusão entre autossomos e lisossomos. Conforme indicado na cor amarela, a interação entre os sinais da cadeia de luz verde três e os sinais vermelhos do lisossomo é evidente na presença dos sinais mesclados para produzir amarelo. Portanto, essa abordagem abordará dois grandes desafios para pesquisadores com estudos de autofagia.

Em primeiro lugar, queremos manter um ambiente livre de estresse usando microfluido, a câmara de profusão para manter sua condição fisiológica original nos estágios do microscópio. O segundo desafio é coletar dados de imagem quantitativos estatisticamente relevantes e, para as células fixas, geralmente pegamos muitas imagens de diferentes células e as compilamos em informações úteis. No entanto, com a célula de vida, seguimos apenas uma célula ao longo do tempo para adquirir informações equivalentes.

Portanto, acreditamos que essa técnica permitirá que outros pesquisadores estudem a função e o papel da autofagia em diferentes órgãos e diferentes doenças.