Indução de autofagia baseada em ADI em células de câncer de próstata: uma técnica baseada em enzimas para medir a resposta autofágica em células

A autofagia é um processo intracelular que facilita a degradação de componentes citoplasmáticos e organelas indesejados dentro de compartimentos digestivos especializados chamados lisossomos. Para avaliar a autofagia, comece com uma cultura aderente de células de câncer de próstata expressando proteínas marcadoras autofágicas chamadas LC3 acopladas a proteínas fluorescentes verdes.

Inerentemente, as células do câncer de próstata não possuem a enzima argininosuccinato sintase necessária para a síntese de aminoácidos arginina. Essas células são, portanto, dependentes da suplementação externa de arginina por meio de meios para sobrevivência e proliferação.

Em seguida, trate as células com arginina deiminase ou ADI. A ADI hidrolisa a arginina livre no meio, levando à depleção de arginina. Em consequência, as células sofrem estresse metabólico, iniciando uma resposta autofágica internamente. Simultaneamente, trate as células com um corante fluorescente vermelho que rotula os lisossomos dentro das células.

Durante a autofagia, estruturas membranosas em forma de taça chamadas fagóforos se reúnem em torno dos componentes citoplasmáticos danificados. Eventualmente, eles se expandem e selam sua carga enquanto se conjugam com proteínas marcadoras autofágicas LC3 para formar vesículas de membrana dupla ou autofagossomos. As proteínas LC3 também fornecem marcadores fluorescentes para os autofagossomos. As vesículas então se fundem com os lisossomos para formar autolisossomos. As proteases lisossômicas dentro dos autolisossomos degradam os componentes celulares engolfados.

Em tempo real, observe a fluorescência brilhante dos autofagossomos e lisossomos para determinar sua distribuição dentro das células.

Para começar, cultive células de câncer de próstata humano expressando Light Chain 3 acoplada a proteína fluorescente verde em placas de cultura de fundo de vidro revestidas com poli-D-lisina de 35 milímetros, conforme descrito no protocolo de texto.

As células devem ser plaqueadas com densidade suficiente para facilitar a proliferação rápida, mas não tanto que as células estejam crescidas demais e agrupadas no momento da imagem. Trate amostras de células selecionadas com arginina desaminase, ou ADI, em PBS para esgotar as células de arginina livre e induzir estresse metabólico nas células cancerígenas.

Aproximadamente uma hora antes da imagem, dilua 1,5 microlitros de LysoTracker Red com 20 mililitros de RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos. Prepare soluções com ADI para as amostras selecionadas que foram tratadas.

Depois de aquecer todos os meios a 37 graus Celsius, adicione o meio apropriado a cada prato de cultura. Incube células com RPMI contendo LysoTracker Red por 15 a 45 minutos a 37 graus Celsius.

Aproximadamente 30 minutos antes da imagem, ligue o recinto ambiental da estação meteorológica e permita o equilíbrio de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Lave as células com PBS e substitua o meio por RPMI padrão contendo apenas 10% de FBS e 1% de antibióticos.

Adicione ADI às amostras conforme indicado. Monte pratos de cultura com fundo de vidro de cobertura de 35 milímetros em um adaptador personalizado. Use óleo de imersão na ampliação de 60X, lente objetiva de abertura numérica de 1,42 e posicione a placa de cultura montada na platina do microscópio.