Medindo intracelular de Ca ^{2 +} Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

O objetivo geral deste procedimento é medir as flutuações de cálcio intracelular em espermatozoides humanos com corantes fluorescentes. Isso é feito preparando primeiro a amostra de esperma pelo método swim up e, se necessário, promovendo a capacitação. O segundo passo é carregar o esperma com um corante fluorescente de cálcio.

Em seguida, usando fluorometria convencional fluorometria de fluxo interrompido, citometria de fluxo ou imagem de célula única, realizar o experimento e registrar as medições de cálcio. Em última análise, os resultados são analisados para determinar as alterações nas concentrações intracelulares de cálcio desencadeadas pela progesterona ou durante o processo de capacitação. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os que envolvem radioatividade, é que este é um procedimento muito sensível.

É seguro e fácil de executar. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização de cálcio SPR, como identificação de compostos que induzem cálcio intracelular, aumentos com alta resolução espacial e temporal e identificação de diferentes subpopulações celulares em uma amostra de siêmen. As implicações do uso, por exemplo, da técnica de citometria de fluxo se estendem ao diagnóstico de problemas de fertilidade por meio da análise do estado fisiológico das gamas masculinas.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o estudo da mobilização de cálcio do esperma humano, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como gamas masculinas de outras espécies ou diferentes tipos de células, como neurônios ou células musculares. Geralmente, os indivíduos que usam esse método terão dificuldades porque o manuseio do esperma não é fácil e é importante manter condições adequadas para obter células viáveis e motoras durante o experimento. Implementamos o uso dessas técnicas combinando estratégias usando diferentes campos.

A demonstração visual deste método é importante, pois a preparação e o manuseio da amostra, bem como a adição dos compostos, são difíceis de aprender, pois os espermatozoides podem ser danificados durante o procedimento e artefatos nas respostas podem ser obtidos durante a edição dos compostos. Para preparar a amostra de esperma, um mililitro de presunto F 10 médio deve ser cuidadosamente colocado em camadas sobre cada sêmen liquefeito de 500 microlitros. Eloqua, toque a parede do tubo com a ponta da micropipeta e dispense suavemente o meio acima da amostra.

É crucial fazê-lo lentamente para evitar misturar a amostra e as camadas médias. O meio é suplementado com dois milimolares de cloreto de cálcio e cinco miligramas por mililitro de BSA. Para promover a capacitação in vitro, incline cuidadosamente os tubos para um ângulo de aproximadamente 30 graus.

Isso aumentará a área de superfície entre os dois líquidos, aumentando assim o deslocamento ou natação dos espermatozoides da amostra para o meio durante a incubação. Em seguida, coloque os tubos de ensaio magros dentro de uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 95% de ar por uma hora após uma hora.

Use uma micropipeta para remover cuidadosamente de cada tubo os 700 microlitros superiores do meio de presunto F 10 que agora contém espermatozóides motílicos. Agrupe todas as amostras coletadas em um único tubo de vidro limpo, evitando a formação de bolhas. Coloque 10 microlitros de amostra agrupada no vidro plano óptico de uma base de câmara de contagem macular e coloque a lamínula.

Certifique-se de evitar a formação de bolhas dentro da câmara, pois isso resultaria em uma contagem imprecisa de células. Observe sob um microscópio composto equipado com uma objetiva de 20 x. A lamínula da câmara de contagem macular tem um grande quadrado composto por 100 quadrados menores.

Conte as células em qualquer faixa de 10 quadrados. Este número representa a concentração celular em milhões de células por mililitro. Repita a contagem em duas tiras quadradas adicionais de 10 e calcule a média das três contagens para carregar as células com um corante fluorescente.

Combine em um tubo de fuga de 1,5 mililitro, o volume necessário de suspensão de esperma com uma solução estoque suficiente de um milimolar para obter uma concentração final de dois micromolares de gripe oh 3:00 da manhã, incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius e proteger da luz centrifugar o tubo a 750 G por cinco minutos. A formação de uma nuvem em vez de um pellet indica que as células estão em boas condições, aspiram e descartam o sobrenadante e ressuspendem o pellet no volume apropriado de meio de esperma humano ou HSM. Para iniciar este experimento, combine em um tubo de vidro de fundo plano, 570 microlitros de HSM e 30 microlitros de suspensão de espermatozóides previamente carregados com gripe oh 3:00 AM e ressuspensos em HSM para obter uma vez 10 elevado a oitavo células por mililitro.

Coloque uma barra de agitação magnética dentro do tubo de vidro e insira o tubo na câmara de leitura do espectômetro pré-aquecido a 37 graus Celsius. A amostra deve ser agitada durante todo o tempo de aquisição. Inicie o experimento usando o software oli e prossiga para adquirir valores de fluorescência a uma frequência de 0,5 hertz durante 300 segundos.

Depois de adquirir fluorescência basal por 30 segundos, use uma seringa Hamilton Micro para injetar o volume apropriado de composto de teste, neste caso para progesterona micromolar em 100 segundos. A 20 micromolares de íon micina como controle positivo para obter o valor máximo de fluorescência. Neste experimento, as alterações intracelulares de cálcio são medidas com alta resolução temporal.

Usando um misturador de fluxo interrompido SFM 20 acoplado a um sistema óptico de cinética raivosa, encha uma das seringas do instrumento com um mililitro de gripe. 3:00 AM carregaram espermatozóides e a segunda seringa com um mililitro do composto a ser testado. 20 micromolar progesterona dissolvida em HSM.

Neste exemplo, é crucial evitar a formação de bolhas ao puxar os líquidos para as seringas. Levante os dois pistões do instrumento até que toquem na ponta dos êmbolos da seringa. Defina o tempo total de amostragem neste caso para 50 segundos e a frequência para 10 milissegundos para minimizar os danos às células, defina a taxa de fluxo para o valor mínimo que fornecerá um gatilho de resposta mensurável.

A mistura de reagentes, o traço de fluorescência bruta versus tomilho será exibido na tela do computador. Repita este procedimento substituindo a progesterona por HSM como controle negativo e micina de íons 10 micromolares como controle positivo antes da citometria de fluxo. Preparar as amostras experimentais colocando 500 microlitros de suspensão celular por tubo citómetro em cada condição a ensaiar.

Configure um experimento usando o software do equipamento. Primeiro, crie uma nova pasta, amostra de experimento e número de tubos. Em seguida, selecione as configurações apropriadas do citômetro para gripe O 3:00 AM. Use os filtros de isotiocianato de fluoresceína e iodeto de propídio.

Execute os tubos de controle não corados um e dois no citômetro. Colete dados de dispersão direta e lateral para verificar se as configurações de limite são apropriadas e para criar a porta correspondente para discriminar detritos das células. Execute os tubos experimentais e colete dados de fluorescência de 10.000 eventos por amostra.

No final. Exporte todos os dados para o software disponível para análise. Prepare as lamínulas redondas necessárias para este procedimento aplicando uma gota de cinco microlitros de solução de poli L lisina no centro de cada lamínula.

Deixe por pelo menos uma hora antes de usar e enxágue a área tratada com água. Isso removerá o excesso de polilisina e permitirá que os espermatozoides adiram à lamínula de sua cabeça enquanto seus flagelos ainda podem se mover. Monte a lamínula dentro da câmara de gravação.

Coloque 10 microlitros de células carregadas de gripe oh 3:00 AM a uma concentração de uma vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro. No centro da lamínula. Cubra as células com 200 microlitros de HSM pré-pré-aquecido.

Coloque a câmara no palco do microscópio, pré-aquecido a 37 graus Celsius, e visualize as células usando contraste de fase. Selecione uma área onde a densidade celular seja apropriada para a geração de imagens. Muitas células dificultam a análise devido à sobreposição de sinais.

As células devem estar firmemente presas à lamínula pela cabeça, mas exibem movimento de flagelos, o que confirma a viabilidade. Inicie o experimento ativando o software de aquisição de imagem de série temporal. Normalmente, são necessárias quatro imagens por segundo, com uma iluminação de dois milissegundos por imagem.

Adquira imagens de fluorescência no modo ao vivo. Para ajustar o foco e o brilho. Use uma micropipeta para adicionar cuidadosamente gota a gota o composto de teste progesterona neste caso e continue a aquisição da imagem conforme necessário.

Execute duas adições de controle sequencial na mesma câmara. 20 micina de íons micromolares para obter fluorescência máxima e cinco cloreto de manganês milimolar para obter fluorescência mínima. Realize análises de imagens offline usando o software IQ.

Desenhe as regiões de interesse ou ROIs ao redor de cada célula ou parte de uma célula. Além disso, selecione uma área livre de células para subtração automática do fundo pelo software. Uma série de intensidade de fluorescência de tempo é então obtida para cada ROI e esses dados podem ser exportados para o Microsoft Excel para análise posterior.

A progesterona é um dos indutores de reação acrossômica conhecidos e, como esperado, provoca um aumento transitório da concentração intracelular de cálcio no esperma humano, medido por fluorometria convencional. O traço de fluorescência vermelho versus tempo mostra alterações na concentração de cálcio intracelular causadas pela adição de quatro progesteronas micromolares como controle negativo HSM foi adicionado, o que não causou nenhuma alteração nos níveis de concentração de cálcio intracelular conforme indicado pelo traço de fluorescência azul como controle positivo. A alteração induzida pela micina do íon 10 micromolar é mostrada para cada traço.

A adição desse ionóforo de cálcio causa o aumento máximo da concentração de cálcio celular do RA, que não retorna aos níveis basais. Este gráfico de barras mostrou a mudança média na fluorescência delta F de cada condição, mais ou menos erro padrão onde N é igual a três e o asterisco indica um valor de P inferior a 0,001 em comparação com o controle. O aumento da concentração de cálcio intracelular induzido pela progesterona foi medido com maior resolução temporal por fluorometria de fluxo interrompido e resultados representativos são mostrados aqui.

Os traços brutos são mostrados no painel A, tanto a progesterona representada pela linha vermelha quanto a micina iônica representada pela linha azul causaram um rápido aumento da concentração de cálcio intracelular. O traço verde é o controle negativo onde as células foram misturadas com HSM. O painel B mostra traços corrigidos para os sinais induzidos com progesterona ou com micina de íons obtidos subtraindo o sinal de controle de seus sinais brutos correspondentes.

A progesterona causou um aumento muito rápido e transitório da concentração de cálcio intracelular, com um valor máximo de fluorescência ocorrendo 2,7 segundos após a adição do indutor. Por outro lado, a NIC causou um aumento rápido e sustentado da concentração intracelular de cálcio ao longo de 50 segundos. A inserção no painel B mostra uma visão expandida dos primeiros 500 milissegundos para cada resposta.

A ausência de atraso no aumento da concentração de cálcio intracelular induzida pela progesterona é consistente com relatos anteriores que sugerem que a progesterona ativa diretamente o esporão de gato do canal de cálcio sem sinalização intermediária. A concentração intracelular de cálcio também foi medida em espermatozoides humanos capacitados e não capacitados usando citometria de fluxo. Nesses gráficos de dispersão representativos para frente e para os lados.

As células capacitadas estão em azul e as células não capacitadas estão em vermelho. A porta selecionada é indicada com a linha azul e apenas as células dentro dessa área foram usadas para análise posterior. O painel B mostra o histograma de fluorescência no canal Fitzy de espermatozóides não corados, e o painel D mostra o histograma de fluorescência no canal FZ de espermatozóides corados com gripe oh 3:00 AM, conforme observado no Painel D. A distribuição dos valores de fluorescência para espermatozóides capacitados representados pelo traço azul é deslocada para valores mais altos em comparação com espermatozóides não capacitados representados pelo traço vermelho.

O painel C mostra o histograma de fluorescência no canal PI de células não coradas e o painel E mostra o histograma de fluorescência no canal PI de células mortas. Os valores de fluorescência para cada célula individual podem ser observados nos gráficos de pontos de fluorescência bidimensionais mostrados aqui. Para células não coradas e células duplamente coradas com gripe oh 3:00 AM e pi, a porcentagem de células registradas em cada quadrante é indicada pelo número vermelho.

É importante ressaltar que o sinal proveniente das células mortas pode ser eliminado. Por fim, a alteração da concentração de cálcio intracelular induzida pela progesterona foi medida em espermatozóides individuais por meio de imagens que mostram as células visualizadas no início e após as adições de progesterona, NIC e cloreto de manganês. A adição de progesterona causa um aumento na concentração de cálcio intracelular, tanto na cabeça do esperma quanto no cloreto de manganês lum é usado para diminuir a gripe.

Oh 3:00 AM fluorescência por extinção de traços de fluorescência normalizados representativos de nove células individuais do experimento são mostrados nesta figura. Conforme observado em experimentos populacionais, a análise de célula única revelou um aumento transitório e sustentado de progesterona e micina iônica, respectivamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a viabilidade das células e realizar os controles apropriados após este procedimento. Outros métodos, como eletrofisiologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identificação de canais iônicos específicos envolvidos nos aumentos de cálcio, usando soluções de proppe e protocolos de simulação após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia celular explorarem a dinâmica do cálcio em células vivas com alta resolução espacial e temporal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como selecionar a técnica mais adequada para medir os aumentos de cálcio intracelular usando dy fluorescente em qualquer tipo de célula, dependendo da pergunta específica que você gostaria de responder. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de siemen humano pode ser perigoso e precauções como o uso de doadores de saúde comprovada. O uso de globos de látex durante o procedimento e o descarte adequado da solução e dos materiais devem sempre ser tomados durante a execução deste procedimento.