Medindo intracelular de Ca

O objetivo geral deste procedimento é medir flutuações intracelulares de cálcio em espermatozoides humanos utilizando corantes fluorescentes. Isso é realizado primeiramente preparando a amostra de espermatozoides pelo método de natação ascendente e, se necessário, promovendo a capacitação. O segundo passo consiste em carregar os espermatozoides com um corante fluorescente de cálcio.

Em seguida, utilizando fluorometria convencional, fluorometria de fluxo interrompido, citometria de fluxo ou imagem individual de células, realize o experimento e registre as medidas de cálcio. Por fim, os resultados são analisados para determinar as alterações nas concentrações intracelulares de cálcio desencadeadas pela progesterona ou durante o processo de capacitação. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que envolvem radioatividade, é que este é um procedimento altamente sensível.

É seguro e fácil de realizar. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização de cálcio por SPR, como a identificação de compostos que induzem o cálcio intracelular, aumentos com alta resolução espacial e temporal e a identificação de diferentes subpopulações celulares em uma amostra de sêmen. As implicações do uso, por exemplo, da técnica de citometria de fluxo estendem-se ao diagnóstico de problemas de fertilidade por meio da análise do estado fisiológico dos gametas masculinos.

Embora este método possa fornecer informações sobre o estudo da mobilização de cálcio em espermatozoides humanos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como gametas masculinos de outras espécies ou diferentes tipos celulares, tais como neurônios ou células musculares. Geralmente, indivíduos que utilizam este método enfrentam dificuldades, pois o manuseio dos espermatozoides não é fácil, e é importante manter condições apropriadas para obter células viáveis e móveis ao longo do experimento. Implementamos o uso dessas técnicas combinando estratégias que utilizam diferentes áreas do conhecimento.

A demonstração visual deste método é importante, pois o preparo e a manipulação da amostra, bem como a adição dos compostos, são difíceis de aprender, já que as células espermáticas podem ser danificadas durante o procedimento e artefatos nas respostas podem ser obtidos durante a edição dos compostos. Para preparar a amostra espermática, um mililitro de meio hams F 10 deve ser cuidadosamente adicionado sobre cada 500 microlitros de sêmen liquefeito. Eloqua, toque a parede do tubo com a ponta da micropipeta e dispense suavemente o meio acima da amostra.

É fundamental fazê-lo lentamente para evitar a mistura das camadas da amostra e do meio. O meio é suplementado com cloreto de cálcio 2 milimolar e BSA 5 miligramas por mililitro. Para promover a capacitação in vitro, incline cuidadosamente os tubos para um ângulo aproximado de 30 graus.

Isso aumentará a área de superfície entre os dois líquidos, aumentando assim o deslocamento ou ascensão dos espermatozoides da amostra para o meio durante a incubação. Em seguida, coloque os tubos de ensaio em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, 95% de ar, por uma hora. Após uma hora.

Utilize uma micropipeta para remover cuidadosamente de cada tubo os 700 microlitros superiores do meio Hams F-10 que agora contém espermatozoides móveis. Reúna todas as amostras coletadas em um único tubo de vidro limpo, evitando a formação de bolhas. Coloque 10 microlitros da amostra em pool sobre o vidro óptico plano da base de uma câmara de contagem macular e posicione o cubre-objetos.

Certifique-se de evitar a formação de bolhas dentro da câmara, pois isso resultaria em uma contagem celular imprecisa. Observe sob um microscópio composto equipado com uma objetiva de 20 x. O cubre-objeto da câmara de contagem macular possui um quadrado grande composto por 100 quadrados menores.

Conte as células em qualquer faixa de 10 quadrados. Esse número representa a concentração celular em milhões de células por mililitro. Repita a contagem em mais duas faixas adicionais de 10 quadrados e calcule a média das três contagens para carregar as células com um corante fluorescente.

Combine em um tubo fuge de 1,5 mililitro o volume necessário de suspensão de espermatozoides com quantidade suficiente da solução estoque de flu oh 3:00 AM a um milimolar para obter uma concentração final de dois micromolares de flu oh 3:00 AM. Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius, protegido da luz. Centrifugue o tubo a 750 ×g por cinco minutos. A formação de uma nuvem, em vez de um pellet, indica que as células estão em boas condições. Aspire e descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet no volume apropriado de meio para espermatozoides humanos ou HSM. Para iniciar este experimento, combine em um tubo de vidro com fundo plano 570 microlitros de HSM e 30 microlitros de suspensão de células espermáticas previamente carregadas com flu oh 3:00 AM e re-suspendas em HSM para obter um vezes 10 à oitava células por mililitro.

Coloque uma barra magnética de agitação dentro do tubo de vidro e insira o tubo na câmara de leitura do espectrômetro pré-aquecida a 37 graus Celsius. A amostra deve ser agitada durante todo o tempo de aquisição. Inicie o experimento utilizando o software oli e prossiga com a aquisição dos valores de fluorescência com uma frequência de 0,5 hertz durante 300 segundos.

Após adquirir a fluorescência basal durante 30 segundos, utilize uma seringa Hamilton Micro para injetar o volume apropriado do composto em teste, neste caso progesterona micromolar aos 100 segundos. Adicione 20 micromolar de ionomicina como controle positivo para obter o valor máximo de fluorescência. Neste experimento, as alterações no cálcio intracelular são medidas com alta resolução temporal.

Usando um misturador de fluxo interrompido SFM 20 acoplado a um sistema óptico de cinética rápida, preencha uma das seringas do instrumento com um mililitro de células espermáticas carregadas com flu. 3:00 AM e a segunda seringa com um mililitro do composto a ser testado. Vinte micromolar de progesterona dissolvida em HSM.

Neste exemplo, é crucial evitar a formação de bolhas ao aspirar os líquidos nas seringas. Levante os êmbolos de ambos os instrumentos até que toquem na extremidade das hastes das seringas. Defina o tempo total de amostragem, neste caso, como 50 segundos e a frequência como 10 milissegundos, a fim de minimizar danos celulares; ajuste a vazão ao valor mínimo que proporcione um gatilho de resposta mensurável.

A mistura dos reagentes e o traçado da fluorescência bruta versus tempo serão exibidos na tela do computador. Repita este procedimento substituindo a progesterona por HSM como controle negativo e ionomicina 10 micromolar como controle positivo antes da citometria de fluxo. Prepare as amostras experimentais colocando 500 microlitros de suspensão celular por tubo de citômetro em cada condição a ser testada.

Configure um experimento utilizando o software do equipamento. Primeiro, crie uma nova pasta, espécime do experimento e número de tubos. Em seguida, selecione as configurações apropriadas do citômetro para flu O 3:00 AM. Utilize os filtros de isotiocianato de fluoresceína e iodeto de propídio.

Execute os tubos-controle não corados um e dois no citômetro. Colete os dados de dispersão para frente e dispersão lateral para verificar se as configurações de limiar são adequadas e para criar o respectivo portal, a fim de discriminar detritos das células. Execute os tubos experimentais e colete os dados de fluorescência de 10.000 eventos por amostra.

No final. Exporte todos os dados para o software disponível para análise. Prepare as lamínulas redondas necessárias para este procedimento aplicando uma gota de cinco microlitros de solução de poli-L-lisina no centro de cada lamínula.

Deixe por pelo menos uma hora antes de usar; enxágue a área tratada com água. Isso removerá o excesso de polilisina e permitirá que as células espermáticas aderem à lamínula pela cabeça, enquanto seus flagelos ainda podem se mover. Monte a lamínula dentro da câmara de gravação.

Coloque 10 microlitros de células marcadas com fluoh 3:00 AM, com concentração de um vezes 10 à sétima células por mililitro, no centro do lamínula. Cubra as células com 200 microlitros de HSM pré-aquecido.

Coloque a câmara na platina do microscópio, previamente aquecida a 37 graus Celsius, e visualize as células utilizando contraste de fase. Selecione uma área onde a densidade celular seja apropriada para a aquisição de imagens. Um número excessivo de células dificulta a análise devido à sobreposição de sinais.

As células devem estar firmemente aderidas à lamínula por sua cabeça, mas exibir movimento dos flagelos, o que confirma a viabilidade. Inicie o experimento ativando o software de aquisição de imagens em série temporal. Normalmente, são necessárias quatro imagens por segundo com uma iluminação de dois milissegundos por imagem.

Adquira imagens de fluorescência em modo ao vivo. Ajuste o foco e o brilho. Use uma micropipeta para adicionar cuidadosamente, gota a gota, o composto em teste – progesterona, neste caso – e continue a aquisição de imagens conforme necessário.

Realize duas adições controle sequenciais na mesma câmara. Vinte micromolares de ionomicina para obter fluorescência máxima e cinco milimolares de cloreto de manganês para obter fluorescência mínima. Realize a análise de imagem fora de linha utilizando o software IQ.

Desenhe as regiões de interesse ou ROI ao redor de cada célula ou parte de uma célula. Além disso, selecione uma área livre de células para subtração automática de fundo pelo software. Em seguida, é obtida uma série temporal de intensidade de fluorescência para cada ROI, e esses dados podem ser exportados para o Microsoft Excel para análises adicionais.

A progesterona é um dos indutores conhecidos da reação acrossômica e, como esperado, provoca um aumento transitório na concentração intracelular de cálcio em espermatozoides humanos, conforme medido por fluorometria convencional. O traço de fluorescência vermelha em função do tempo mostra as alterações na concentração intracelular de cálcio provocadas pela adição de quatro micromolares de progesterona; como controle negativo, foi adicionado HSM, o que não causou nenhuma alteração nos níveis de concentração intracelular de cálcio, conforme indicado pelo traço de fluorescência azul. Como controle positivo, é mostrada a alteração induzida por 10 micromolares de ionomicina em cada traço.

A adição desse ionóforo de cálcio provoca o aumento máximo da concentração intracelular de cálcio nas células RA, que não retorna aos níveis basais. Este gráfico de barras mostra a alteração média na fluorescência delta F para cada condição, mais ou menos o erro padrão, onde N é igual a três e o asterisco indica um valor de P menor que 0,001 em comparação com o controle. O aumento da concentração intracelular de cálcio induzido pela progesterona foi medido com maior resolução temporal por fluorometria de fluxo interrompido, e resultados representativos são mostrados aqui.

Os traços brutos são mostrados no painel A; tanto a progesterona, representada pela linha vermelha, quanto o ionomicina, representado pela linha azul, provocaram um aumento rápido na concentração intracelular de cálcio. O traço verde é o controle negativo, no qual as células foram misturadas com HSM. O painel B mostra os traços corrigidos para os sinais induzidos pela progesterona ou pelo ionomicina, obtidos pela subtração do sinal de controle dos respectivos sinais brutos.

A progesterona causou um aumento muito rápido e transitório na concentração intracelular de cálcio, com um valor máximo de fluorescência ocorrendo 2,7 segundos após a adição do indutor. Por outro lado, a CIN causou um aumento rápido e sustentado na concentração intracelular de cálcio ao longo de 50 segundos. O quadro no painel B mostra uma visão ampliada dos primeiros 500 milissegundos de cada resposta.

A ausência de um atraso no aumento da concentração intracelular de cálcio induzido pela progesterona é consistente com relatos anteriores que sugerem que a progesterona ativa diretamente o canal de cálcio cat spuro sem sinalização intermediária. A concentração intracelular de cálcio também foi medida em espermatozoides humanos capacitados e não capacitados utilizando citometria de fluxo. Nestes gráficos representativos de dispersão anterior e lateral.

As células capacitadas estão em azul e as células não capacitadas estão em vermelho. O portão selecionado é indicado pela linha azul e apenas as células dentro dessa área foram utilizadas para análises posteriores. O painel B mostra o histograma de fluorescência no canal Fitzy das amostras não coradas, espermatozoides, e o painel D mostra o histograma de fluorescência no canal FZ dos espermatozoides corados com flu oh 3:00 AM, conforme observado no painel D. A distribuição dos valores de fluorescência para espermatozoides capacitados, representada pelo traçado azul, está deslocada para valores mais altos em comparação com os espermatozoides não capacitados, representados pelo traçado vermelho.

O painel C mostra o histograma de fluorescência no canal de PI de células não coradas e o painel E mostra o histograma de fluorescência no canal de PI de células mortas. Os valores de fluorescência de cada célula individual podem ser observados nos gráficos de pontos de fluorescência bidimensionais mostrados aqui. Para células não coradas e células coradas duplamente com flu oh 3:00 AM e pi, a porcentagem de células registradas em cada quadrante é indicada pelo número vermelho.

É importante destacar que o sinal proveniente de células mortas pode ser eliminado. Por fim, a alteração na concentração intracelular de cálcio induzida pela progesterona foi medida em células espermáticas individuais por meio de imagens; essas imagens representativas em pseudocores mostram células visualizadas no início e após as adições de progesterona, CIN e cloreto de manganês. A adição de progesterona provoca um aumento na concentração intracelular de cálcio, tanto na cabeça espermática quanto na cauda; o cloreto de manganês é utilizado para diminuir a flu.

Às 3:00 da manhã, a fluorescência por extinção é representada por traços de fluorescência normalizados de nove células individuais do experimento, mostrados nesta figura. Como observado em experimentos com populações, a análise em célula única revelou um aumento transitório para a progesterona e um aumento sustentado para a ionomicina, respectivamente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a viabilidade das células e de realizar os controles apropriados após seguir este protocolo. Outros métodos, como a eletrofisiologia, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identificação de canais iônicos específicos envolvidos nos aumentos de cálcio, utilizando soluções adequadas e protocolos de simulação após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de fisiologia celular explorarem a dinâmica de cálcio em células vivas com alta resolução espacial e temporal.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como selecionar a técnica mais apropriada para medir aumentos de cálcio intracelular utilizando corantes fluorescentes em qualquer tipo de célula, dependendo da questão específica que deseja responder. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de sêmen humano pode ser perigoso e de que precauções, como o uso de doadores de saúde comprovada, devem ser tomadas. O uso de luvas de látex durante o procedimento e a eliminação adequada de soluções e materiais devem sempre ser observados ao realizar este procedimento.