Name: Medindo intracelular de Ca 2 + Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Aprenda a medir flutuações de cálcio intracelular em esperma humano usando corantes fluorescentes e técnicas de fluorometria, citometria de fluxo e imagem de célula única. Este método sensível permite estudar a capacitação espermática.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem a José Luis De la Vega, Erika Melchy e Dr. Takuya Nishigaki para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-México) (99.333 e 128.566 para CT); Dirección General de Asuntos del Pessoal Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 para CT).

<ol><li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule%3A+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li>
<li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+in+the+development%2C+maturation%2C+and+function+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li>
<li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li>
<li>Carlson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+native+CatSper+channels+reveals+a+required+role+in+maintenance+of+sperm+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation.</a> PLoS ONE. 4, e6844(2009).</li>
<li>Brokaw, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+flagellar+response+during+the+chemotaxis+of+bracken+spermatozoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids.</a> J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121, 1139-1150 (1995).</li>
<li>Svahn, H. A., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+or+large+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Single cells or large populations.</a> Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li>
<li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li>
<li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+progesterone%3A+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BSA-induced+Ca2%2B+influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119(2009).</li>
<li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+sperm+capacitation%3A+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li>
<li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Sinalização intracelular é vital para a maioria das atividades celulares; Ca2 + é um mensageiro ubíquo que acompanha células de mamífero ao longo de toda a sua vida útil, a partir da sua origem no momento da fertilização, ao fim do seu ciclo de vida. Em resposta a diferentes estímulos, [Ca 2 +] i aumenta, oscila e diminui com a codificação espaço-temporal e, consequentemente, diversos processos são ativados, modulados ou denunciado por Ca 2 + mensagens codificadas. Ca 2 + intr...

Ca2 + é um segundo mensageiro universal das vias de transdução de sinal em células eucarióticas. Intracelular de Ca2 + (Ca2 + i) participa na regulação de vários processos fisiológicos fundamentais tanto em células excitáveis ​​e não excitáveis. A importância e da universalidade da Ca2 + como segundo mensageiro durante eventos de transdução de sinal é obtido a partir da sua versatilidade espácio-temporal, na transmissão de informação no interior da célula. Enquanto Ca2 + não podem ser sintetizados de novo ou degradada no interior da célula, a sua concentração intracelular ([Ca 2 +] i) é mantida dentro de limites muito restritos por diferentes mecanismos celulares que tampão continuamente, sequestram, compartimentar, e / ou acumular Ca2 +. As alterações na concentração do ião pode ocorrer em regiões altamente localizadas dentro da célula 1, e decifrar tais flutuações é essencial para a obtenção de umeper compreensão de (1) a sua função no mecanismo de sinalização (2), o seu significado fisiológico, e (3) mecanismos gerais de sinalização celular. Ca 2 + sinalização mediada é de particular importância na fisiologia esperma 2. A motilidade espermática é uma das funções mais importantes para o sucesso de fertilização, e, de fato, vários defeitos motilidade dos espermatozóides pode causar esterilidade 3-5. A importância de Ca 2 + em circulação flagelar tem sido reconhecida 6, no entanto, o mecanismo de como Ca 2 + controla a forma específica de flagelar flexão não é totalmente compreendido. Antes da fusão com o ovo, os espermatozóides devem sofrer capacitação, um processo complexo que depende de residência de esperma dentro do trato genital feminino. Durante a capacitação, arquitetura lipídica da membrana de esperma e de organização são modificados, principalmente como um resultado da remoção do colesterol a partir da membrana plasmática. Além disso, várias proteínas são tirosina-fósforoylated 7. Importante, durante capacitação há um aumento do pH intracelular (pH I) e na [Ca 2 +] i, e o potencial de membrana em algumas espécies hiperpolariza 2. Capacitação só ocorre em uma subpopulação de espermatozóides (20-40%), e os mecanismos envolvidos em todas estas alterações celulares estão longe de ser clara. É geralmente aceite que apenas uma sub-população de esperma capacitada sofrer a reacção do acrossoma (AR), quando exposto a indutores fisiológicas. A AR é também um evento de Ca 2 +-regulada necessária para a fertilização em todas as espécies que possuem um acrossoma (organela especializada, com membranas externas e internas). Durante este processo, os fusíveis da membrana acrossomal exteriores com a membrana plasmática do espermatozóide, libertando enzimas hidrolíticas que permitem que a célula de esperma para penetrar na matriz de glico-proteico que rodeia o óvulo (zona pelúcida, ou ZP). A AR também expõe uma nova superfície de células de esperma, que interage com fusogénicoa membrana plasmática do ovo para que a fusão final de ambos os gâmetas. Existem vários ligandos celulares que induzem o AR, progesterona a ser uma das mais estudadas entre eles. Neste trabalho, apresentamos quatro diferentes técnicas que envolvem o uso de um corante fluorescente Ca 2 + sensível para medir [Ca 2 +] i alterações no esperma humano provocado pela progesterona (com exceção de citometria de fluxo, no qual medimos a [Ca 2 + ] i induzida aumentam durante o processo de capacitação in vitro). Neste caso específico utilizou-Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), um corante de membrana permeável com um K d = 325 nm. In vitro foi monitorada alterações de fluorescência como uma função do tempo com três das metodologias, e com a quarta técnica medimos valores de fluorescência a um único ponto no tempo. Estas diferentes abordagens se complementam, uma vez que eles fornecem completamente res espaciais e temporaislução em ambos os níveis de população de células de uma única célula e. População celular ou Experimentos em massa Técnicas de massa são amplamente utilizados, não só porque os instrumentos que requerem estão facilmente disponíveis, mas também porque são simples e bem estabelecido, e para permitir o cálculo da média da informação a partir de medições feitas em milhões de células numa única experiência. Técnica n º 1. Fluorometria convencional Esta técnica monitoriza as alterações na fluorescência como uma função do tempo, as experiências são realizadas em cuvetes de vidro, com volumes de amostra variam de 200 a 1000 ul. A mistura adequada de reagentes adicionados requer agitação magnética, e por conseguinte a resolução temporal obtida é da ordem de segundos. O intervalo de concentração típica de células das amostras analisadas é de 10 5 -10 8 células / ml. Técnica n º 2. Parado Fluorometria Fluxo Ta técnica também monitoriza as alterações na fluorescência como uma função de tempo, mas os reagentes são misturados rapidamente (através de pressão) numa cuvete de gravação que contém um volume de amostra muito pequena (variando 25-100 ul). Portanto, a homogeneização dos reagentes é instantânea, permitindo uma resolução temporal maior, na ordem de milissegundos. Análise da fluorescência vs tempo vestígios resultantes são adequados para a determinação da taxa de reacção, a elucidação da complexidade do mecanismo de reacção, obtendo-se informações sobre a vida curta intermediários da reacção, etc A gama de concentração de células comum das amostras analisadas é de 10 5 a 10 7 células / mL. Experiências de uma única célula Experimentos Granel relatar o comportamento médio de um grande número de células, no entanto, uma população podem frequentemente exibem propriedades que são heterogéneos negligenciado durante este tipo de medições. Técnicas de células individuais são então usadas para complementar thinformações e obtidos com as experiências da população de células. Técnica # 3. Citometria de Fluxo Apesar da importância da informação resultante a partir de medições de célula única, que é importante para analisar um grande número de células, a fim de impedir que a extrapolação errónea de propriedades específicas de células de uma população inteira. Por esta razão, as técnicas de alto rendimento são favorecidos e o método mais popular é a citometria de fluxo, em que 10.000 células por condição, são convencionalmente analisados. Este método permite uma análise multi-paramétricos de populações heterogêneas, uma vez que categoriza as células de acordo com seu tamanho (dispersão frontal (FSC)), granularidade (dispersão lateral (SSC)) e intensidade de fluorescência (rotulagem específico com um anticorpo, marcador de viabilidade, etc) , fornecendo assim informação sobre a distribuição dos parâmetros para um grupo de células. A citometria de fluxo fornece informações instantâneas ao invés de dependente do tempo 8. Para a frente e de lado valores dispersão arE também útil para a selecção de um portão que inclui células, mas discrimina os detritos celulares, a poeira, etc, para medições de fluorescência, fluorescência de controlos negativos e positivos devem também ser incluídos. Se mais de um canal de fluorescência é usada, um processo conhecido como a compensação deve ser realizada (ver detalhes <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensação permite a sobreposição espectral discriminação entre fluoróforos. A citometria de fluxo também permite a discriminação de células mortas, geralmente por meio de coloração com iodeto de propídio. Técnica n º 4. Única célula de imagem Microscopia é outro método comum para estudar o comportamento de célula única, que é bem adequado para estudos dependentes do tempo e também fornece uma resolução espacial. A principal desvantagem é que a análise de alto rendimento é de apenas incipiente no momento presente <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado aprox. 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Makler</td><td>SEFI Medical Insruments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 frascos/50 &mu; g cada</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagentes para esperma humano meio (HSM)</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>L-lactato de sódio (aprox. 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Reagentes para meio de esperma humano (HSM)</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Componente B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>Solução de 2,4 mM em água </td></tr><tr><td>lamínula redonda </td><td>VWR</td><td>48380 080</td> Solução de <td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina </td> de 25 mm de diâmetro <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Câmara celular, para microscopia</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

medindo intracelular de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, parado fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Os espermatozóides são células reprodutoras masculinas, especialmente concebidos para alcançar, reconhecer e fundir-se com o ovo. Para executar essas tarefas, os espermatozóides precisam estar preparados para enfrentar um ambiente em constante mudança e superar várias barreiras físicas. Sendo na sua essência transcriptionally e translação em silêncio, estas células móveis dependem profundamente sobre diversos mecanismos de sinalização para orientar-se e nadar de forma dirigida, e de lidar com difíceis condições ambientais durante a sua jornada para encontrar o óvulo. Em particular, o Ca 2 + sinalização mediada é essencial para várias funções do esperma: activação de motilidade, capacitação (um processo complexo, que se prepara de esperma para a reacção do acrossoma), e a reacção do acrossoma (um evento exocitótica que permite a fusão espermatozóide-ovo). A utilização de corantes fluorescentes para controlar flutuações intracelulares deste ião é de extraordinária importância, devido à sua facilidade de aplicação, a sensibilidade, e versatilidade de detexão. Usando um único protocolo corante de carregamento de nós utilizamos quatro técnicas fluorométricos diferentes para monitorar esperma Ca 2 + dinâmica. Cada técnica fornece informações distintas que permite a resolução espacial e / ou temporal, gerando dados, tanto a nível da população de células de uma única célula e.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do protocolo experimental para a preparação de amostras de espermatozóides pelo método aquático. Os principais passos para a separação de espermatozóides móveis e para ajustamento da sua concentração são ilustrados. O último passo de incubação é realizado apenas quando a capacitação é nece...

Intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinâmica são muito importantes na fisiologia do esperma e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensíveis corantes fluorescentes constituem uma ferramenta versátil para estudá-los. Experiências da população (fluorometria e parou fluorometria fluxo) e experimentos com células individuais (citometria de fluxo e de imagem única célula) são usados ​​para rastrear espaço-temporal [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Alterações nas células de espermatozóides humanos.

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

O objetivo geral deste procedimento é medir flutuações intracelulares de cálcio em espermatozoides humanos utilizando corantes fluorescentes. Isso é realizado primeiramente preparando a amostra de espermatozoides pelo método de natação ascendente e, se necessário, promovendo a capacitação. O segundo passo consiste em carregar os espermatozoides com um corante fluorescente de cálcio.Em seguida, utilizando fluorometria convencional, fluorometria de fluxo interrompido, citometria de fluxo ou imagem individual de células, realize o experimento e registre as medidas de cálcio. Por fim, os resultados são analisados para determinar as alterações nas concentrações intracelulares de cálcio desencadeadas pela progesterona ou durante o processo de capacitação. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que envolvem radioatividade, é que este é um procedimento altamente sensível.É seguro e fácil de realizar. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização de cálcio por SPR, como a identificação de compostos que induzem o cálcio intracelular, aumentos com alta resolução espacial e temporal e a identificação de diferentes

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Aqui, dois ensaios de rendimento médio para avaliação dos efeitos de Ca2 +-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano são descritos. Estes ensaios podem ser usados para facilmente e rapidamente grandes quantidades de compostos para efeitos na Ca2 +de tela-reação do acrossoma e sinalização no esperma humano.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Este protocolo descreve como realizar registros elétricos de espermatozóides de mamíferos em uma configuração de célula inteira, com o objetivo de registrar diretamente a atividade do canal iônico. O método tem sido fundamental na descrição dos perfis eletrofisiológicos de vários canais iônicos do esperma e ajudou a revelar sua identidade e regulação molecular.

Registro de correntes elétricas através da membrana plasmática de espermatozóides de mamíferos

O presente protocolo fornece uma solução prática que permite a medição de apoptose, potencial de membrana mitocondrial e danos ao DNA em espermatozoides humanos com um único citômetro.

Análise por Citometria de Fluxo de Biomarcadores para Detecção de Defeitos Funcionais do Espermatozoide Humano

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

Aprenda a medir flutuações de cálcio intracelular em esperma humano usando corantes fluorescentes e técnicas de fluorometria, citometria de fluxo e imagem de célula única. Este método sensível permite estudar a capacitação espermática.

Medindo intracelular de Ca 2 + Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem (Vídeo) | JoVE Journal

Medindo intracelular de Ca

Explorar mais vídeos