Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Este vídeo apresenta um conjunto de quatro experimentos usados para identificar motivos funcionais de HIV e proteína NPH e para desenvolver inibidores baseados em peptídeos. Peptídeos curtos específicos derivados de motivos encontrados em proteínas de comprimento total, ambos mantêm sua função biológica e inibem competitivamente a função da proteína de comprimento total para identificar motivos apoptóticos. No HIV, uma célula de gato nerd NEF é exposta a peptídeos de varredura NEF e um ensaio apoptótico em túnel é realizado para identificar peptídeos que induzem a apoptose.

Um segundo conjunto de peptídeos contendo variações em um motivo de secreção de NEF. A região de modificação da secreção ou SMR é transfectada para as células junto com a perda de função da NPH GFP devido à inibição competitiva indicada pela diminuição da secreção de nph. A GFP é avaliada por fluorometria para identificar fatores celulares que interagem com a região de modificação da secreção ou SMR de nef.

As precipitações de Coun são realizadas usando SMR tipo selvagem NPH como isca. Finalmente, para testar se essas interações afetam a secreção, anticorpos contra parceiros de ligação identificados são transfectados para as células. Para avaliar se eles antagonizam a secreção do motivo NF, os resultados obtidos identificam dois motivos apoptóticos funcionais no NEF e um peptídeo inibidor que antagoniza um motivo de secreção funcional do NEF, bem como seus parceiros de ligação celular necessários para a secreção.

O objetivo geral deste conjunto de quatro experimentos é acelerar a identificação de motivos funcionais em proteínas-alvo e, em seguida, usar esses dados para desenvolver inibidores de base peptídica desses motivos funcionais. Este conjunto de protocolos tem sido útil para o nosso grupo para nos ajudar a responder a questões-chave relacionadas à patogênese do HIV, como entender o papel da secreção impulsionada por neph na patogênese e decifrar os mecanismos subjacentes à capacidade de neff de manipular a via do tráfico exossomal. Hoje, demonstrando os procedimentos, estará o Dr. Ming Bo Huang, que é instrutor de pesquisa em meu laboratório.

Comece este procedimento com um conjunto de peptídeos examinando a região de interesse para este experimento. 20 peptídeos mer com uma sobreposição de 10 aminoácidos abrangendo toda a proteína HIV uma NPH foram obtidos do programa de reagentes da AIDS. Para identificar motivos apoptóticos NPH, realize um ensaio de apoptose usando os peptídeos de varredura NEF individualmente da seguinte forma, adicione um mililitro de meio de cultura contendo 10 nanogramas por mililitro de peptídeo por placa de 35 milímetros de jerk hat, culturas de células e incube culturas por 24 horas a 37 graus Celsius.

Após a incubação, execute um DUTP mediado por desoxinucleotídeo transferase terminal, nick de biotina e marcação ou ensaio de túnel para avaliar a apoptose. Para fazer isso, primeiro lave as células com PBS, aspire o PBS e adicione 4% de aldeído paraforme em PBS, incube por 30 minutos em temperatura ambiente para fixar as células após a fixação das células, lave-as com PBS e adicione Triton X 100, incube por 10 minutos em temperatura ambiente para permeá-las. Após a fixação e permeável das células, adicione o reagente do túnel e incube as células por uma hora a 37 graus Celsius após permeável.

Enxágue as células duas vezes com PBS. Em seguida, determine a porcentagem de células coradas por epifluorescência em um sistema de microscopia controlado por computador. Depois de cruzar células jca com NPH, plasmídeo GFP e diferentes variações do peptídeo SMR usando o kit de reagente de entrega de proteína de carruagem, conforme descrito no documento anexo, colha o meio para determinar a eficiência da transfecção por microscopia fluorescente.

Capture imagens fluorescentes e de campo claro e determine a porcentagem de células. Transfectado então para avaliar a inibição da secreção de NPH GFP, transfira 100 microlitros do meio condicionado livre de células para poços individuais de uma placa de microtitulação preta de 96 poços. Use um fluorímetro com comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 515 nanômetros para medir a fluorescência GFP no meio em unidades de fluorescência relativa.

Após a conclusão da leitura, transfira os dados para um PC. Defina o nível de fluorescência GFP no meio de controle em 100% Em seguida, compare isso com o nível de fluorescência GFP no meio de células cotransfectadas com vários peptídeos SMR para determinar alterações na secreção de NPH GFP. O co IP para isolar parceiros de ligação de motivos é um passo difícil.

Certifique-se de que as esferas estejam devidamente agitadas durante as incubações e que o máximo de líquido possível seja removido das esferas durante cada etapa de lavagem. Cultive células de chapéu jerk hat em meio RPMI 1640 contendo 10% FBS a 37 graus Celsius em um frasco de cultura de tecidos T 75 por centrifugação a 1000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Gire a 1000 vezes G por um minuto. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de lise Anti-Flag. Tampão por pipetagem suave diferencialmente micro centrífuga.

As suspensões em 2000 vezes G por cinco minutos e em 13.000 vezes G por 10 minutos. Para peletizar os detritos celulares e o DNA, respectivamente, colete o sobrenadante doravante referido como lisado. Depois de determinar a concentração de proteína, adicione um miligrama de proteína lisada e um micrograma do tipo selvagem SMR ou peptídeo mutante SMR a 20 microlitros de gel de afinidade Anti-Flag M two.

Este gel de afinidade é doravante referido como a resina que leva a mistura a um volume final de um mililitro em tampão co-IP. Preparar também um controlo negativo em que o lisado é combinado com resina na ausência de qualquer um dos peptídeos. Incube as misturas a quatro graus Celsius durante a noite com rotação de ponta a ponta.

No dia seguinte, a resina por microcentrifugação é de 5.000 a 8.000 vezes G por 30 segundos. Após a centrifugação, aguarde um a dois minutos antes de manusear as amostras para permitir que a resina se deposite no tubo. Remova o sobrenadante com uma ponta de pipeta de extremidade estreita ou uma seringa Hamilton, tomando cuidado para não transferir nenhuma resina.

Lave a resina quatro vezes por resus, suspendendo-a em 500 microlitros de tampão de lavagem, seguida de microcentrifugação. Para eluir as proteínas celulares ligadas. Adicione 15 microgramas de excesso de três peptídeos x bandeira ao tubo em 50 microlitros de tampão de lavagem e incube em um agitador basculante por 30 minutos em temperatura ambiente após a centrífuga de incubação a 5.000 a 8.000 vezes G por 30 segundos.

Depois de deixar os tubos assentarem por dois minutos, colete e guarde o sobrenadante contendo as proteínas iludidas. Depois de concentrar os EITs por precipitação de acetona, ferva as amostras em tampão de amostra laly. Em seguida, separe as proteínas por página SDS em um 40 a 20% triss, HCL critério gel pré-moldado manchar o gel com kumasi azul brilhante R dois 50.

Para avaliar a inibição de anticorpos em células JCA transfectadas com NGFP e tubulina Antifa ou anticorpo antimortalidade usando o kit de reagente de entrega de proteína de carruagem, conforme descrito no documento anexo, colete o meio condicionado livre de células das células colhidas. Transfira 100 microlitros para poços individuais de uma placa de microtitulação preta de 96 poços. Em seguida, meça a fluorescência GFP no meio usando um fluorímetro com comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 515 nanômetros em unidades fluorescentes relativas.

Depois de ler a placa, transfira os dados para um PC e defina o nível de fluorescência GFP no controle da tubulina anti-gordura em 100% Compare isso com o nível de fluorescência GFP no meio de células cot transfectado com anticorpo antimortalidade para determinar mudanças na secreção de NEF GFP para mapear motivos apoptóticos do HIV uma análise de varredura de peptídeo de proteínas NPH foi realizada conforme descrito neste vídeo. O eixo Y mostra a porcentagem de células que são marcadas com túnel e o eixo x denota a condição de tratamento como mostrado aqui, duas regiões separadas do HIV e um NEF foram identificadas que induzem a apoptose. Estes são indicados pelo aumento da marcação em túnel das células expostas aos peptídeos neph.

Os picos de apoptose são denotados pelo motivo um e motivo dois para avaliar a inibição competitiva da secreção de neph por meio de cultura de peptídeos de tipo selvagem SMR de células T CAT jerk transeccionadas com um clone de NPH GFP e vários peptídeos SMR foram testados para secreção exo de NPH como mostrado pela fluorescência de GFP no meio peptídeos contendo um ou mais motivos de sequência NPH SMR de tipo selvagem inibiram a secreção de NEF exo omal enquanto a reposição de alanina de qualquer aminoácido dentro desta região reduziu muito a eficácia dos peptídeos. Isso sugere que o peptídeo do tipo selvagem SM R inibe o nph exomal, uma versão embaralhada de 11 aminoácidos do motivo apoptótico do neff. Um SM previamente descrito e obtido do Sigma Genesis foi usado como controle negativo e não teve efeito sobre a secreção exo omal de NEP.

Esta imagem do gel de página SDS corado com kumasi mostra a co-imunoprecipitação de quatro proteínas pelo peptídeo do tipo selvagem SMR com tamanhos de 60, 65, 75 e 250 kilodalton. O peptídeo mutante SMR de controle negativo não capturou essas proteínas, e essas proteínas não interagiram de forma não específica com a resina de afinidade. Na ausência do peptídeo do tipo selvagem SMR, esses resultados sugerem que as proteínas precipitadas estavam interagindo especificamente com os motivos SMR do peptídeo do tipo selvagem SMR.

O ensaio do leitor de placas mostra que a transfecção do anticorpo antimortal com o plasmídeo de expressão neph aboliu completamente a secreção exo omal de NPH. O anticorpo não relacionado não teve efeito na secreção exomal ne. Esses resultados sugerem que uma interação intacta do talento NM é necessária para a secreção de neph exo omal.

Em conclusão, depois de assistir a este vídeo, você deve ter desenvolvido uma boa compreensão de como usar as técnicas de descrição para identificar motivos funcionais em proteínas-alvo e usar esses dados para desenvolver inibidores de bases peptídicas desses motivos funcionais. Ao tentar o procedimento co IP, será fundamental lembrar de dar muita atenção na execução das lavagens de incubação, certificando-se de que os grânulos estejam devidamente agitados durante as incubações e que o máximo de líquido possível seja removido dos grânulos durante cada etapa de lavagem. Além disso, durante as lavagens da célula e da resina lisada, sempre permita que a resina assente após a centrifugação.

Use as pontas da pipeta de extremidade estreita e faça quatro lavagens para reduzir adequadamente o fundo a níveis aceitáveis.