Name: Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de pirosequenciamento para identificação de bactérias e detecção de mutações genéticas usando DNA ribossômico 16S. Este método permite sequenciamento rápido e preciso de genomas microbianos.

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Este projeto foi o apoio, em parte, pela Johns Hopkins University, Gabinete do Reitor através da Iniciativa Ciência Gateway e Qiagen Inc.

Introdução: Uma única colónia bacteriana deve ser usada para inocular um meio de cultura adequado que é incubado durante a noite. Um pelete bacteriana é então processado para purificar ADN genómico usando um kit de isolamento genómico disponíveis comercialmente. O ADN genómico purificado deve ter uma proporção de 260/280 (nm)&gt; 1,8 para assegurar que a amostra está isenta de contaminação de proteína. A quantidade de ADN genómico requerido para a geração do modelo pirosequenciamento é de 10-20 ng. A. Ampliação do Modelo de (PyroMark Handbook PCR; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuais</a> 1) Configurando a reação de PCR Nota: Uma cartilha deve ser biotinilado na sua extremidade 5 &#39;, e é recomendado que seja HPLC purificada para elaboração do modelo. Recomendamos o PyroMark Ensaio Projeto Software 2.0 para PCR e sedesenho de primers cia que são otimizados para o seqüenciamento de curto leitura, no entanto, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) do NCBI também pode ser utilizados para o desenho de primers. <ol><li> Descongelar todas as soluções necessárias (listadas na Tabela 1) e misturar completamente cada. Configure a reação de acordo com a Tabela 1. Todo o trabalho pode ser realizado à temperatura ambiente. </li></ol> Nota: A PCR Master Mix contém MgCl2 para uma concentração final de 1,5 mM, o que proporciona resultados satisfatórios, na maioria dos casos. Se um maior Mg 2 + a concentração é necessária, até 3,5 ul de 25 mM de MgCl 2 pode ser adicionado a uma reacção. <ol start="2"><li> Misture a mistura de reacção pipetando suavemente para cima e para baixo, então dispensar volumes adequados em tubos de PCR. </li><li> Adicionar template ADN de cada tubo de PCR. Recomendamos 10 ng de DNA genômico. </li><li> Programar o termociclador de acordo com a Tabela 2. Um porão definitivo a 4 ° C, para conveniência. Se estiver usando um termociclador sem tampa aquecida, reações de sobreposição com 100 mL de óleo mineral. </li><li> Coloque os tubos de PCR no termociclador e iniciar o programa de ciclismo. </li></ol> B. Vacuum Protocolo Workstation Imobilizar os produtos de PCR biotinilados <ol><li> Faça uma mistura mestre de acordo com a Figura 4. </li></ol> Nota: Antes de pipetagem, agite o frasco de contas Sepharose streptavidin revestidos para garantir uma suspensão homogénea. <ol start="2"><li> Dependendo do volume de produto de PCR utilizado, dispensar 60-75 ul mistura principal em cada poço de uma placa de PCR para produzir um volume total de 80 uL por poço. </li><li> Adicionar 5-20 ul do produto de PCR biotinilado a cada poço. </li><li> Selar os poços com tira caps e agitar a placa de PCR a 1.400 rpm durante 5-10 min à temperatura ambiente (15-25 ° C), utilizando um agitador orbital. </li></ol> A desnaturação de ADN e adição de iniciador de sequenciação <ol><li> Dilui-se os iniciadores de sequenciação a 0,3 uM com tampão de recozimento e dispensar 25 ul em cada poço de uma placa de reacção. Posicione a placa na estação de trabalho. </li><li> Preencha os bebedouros de estações de trabalho de acordo com o diagrama da Figura 5. </li><li> Ligue a bomba de vácuo, e verifique se a chave na ferramenta de vácuo é ativada (Figura 6). Lave as sondas do filtro com água de elevada pureza (Milli-Q cm x 18,2 MW ou equivalente) na calha 5 (Figura 5). Encher o cocho com água de alta pureza fresca para uso na etapa 12. </li><li> Trabalhando rapidamente, posicionar a placa de PCR com contas na estação de trabalho. Assegure-se que ambas as placas estão na mesma orientação que quando as amostras foram carregadas. </li><li> Com o interruptor de vácuo ON, diminuir o vácuoferramenta para os poços da placa de PCR de 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. As pérolas serão capturadas pela ferramenta de vácuo (Figura 7). </li><li> Com o vácuo ainda ON, lave a ferramenta com etanol 70% (trough 1) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Com vácuo ON, lave a ferramenta com solução de desnaturação (trough 2) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li></ol> Nota: A solução de desnaturação contém hidróxido de sódio, que é um irritante da pele e dos olhos. Sempre usar um jaleco, luvas e óculos de proteção. <ol start="8"><li> Com vácuo ON, lave a ferramenta com tampão de lavagem (calha 3) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Com vácuo ON, levantar a ferramenta vácuo para além de 90 ° na vertical por 5 segundos, para permitir que todo o líquido escorrer para fora da ferramenta de vácuo. Desligar a bomba, e alinhar a ferramenta de vácuo com a placa de reação. Baixe a ferramenta de vácuo nopoços e agitar suavemente de um lado para outro para liberar as contas nos poços contendo cartilha seqüenciamento. </li><li> De modo a limpar a ferramenta de vácuo, agitar as sondas de filtro com água de elevada pureza (calha 4) durante 10 seg. </li><li> Desligue o vácuo ON e limpar a ferramenta com água de alta pureza (trough 5) por 20 segundos ou até que todo o volume foi aspirado. </li><li> Levante a ferramenta vácuo para além de 90 ° C vertical, por 5 segundos, em seguida, mudar o vácuo OFF e armazenar na posição &quot;Parking&quot;. </li></ol> Recozimento cartilha sequenciamento de cadeias de DNA <ol><li> Colocar a placa de reacção em um suporte da placa pré-aquecida. </li><li> Aquece-se a placa num bloco de aquecimento a 80 ° C durante 2 min. </li><li> Remova a placa do suporte e coloque em cima do balcão para esfriar em temperatura ambiente por 5 min. </li></ol> Pyromark Q24 Operação Nota: Ligue o instrumento usando o interruptor localizado acima do cabo de alimentação. Estrelatup pode levar até 1 min. <ol><li> Encher um cartucho de acordo com as instruções fornecidas no PyroMark Ouro Q24 Reagentes Manual 2. Para determinar volumes necessários, configurar um arquivo executado no software do aparelho, e no menu Ferramentas, selecione Pré Informações Run </li><li> Se o instrumento já estava, verifique se ele não está realizando uma corrida e, em seguida, abra a tampa. Um sinal de aviso sonoro será emitido se a tampa é aberta quando não é seguro para o fazer. </li><li> Abra a porta do cartucho e insira o cartucho com o rótulo virado para a frente (Figura 8). Certifique-se de que o cartucho está inserido corretamente (a linha deve ser visível na parte da frente) e fechar o portão. </li><li> Abra a moldura da placa de retenção e posicionar a placa com as amostras dentro do instrumento. </li><li> Feche a moldura da placa de retenção ea tampa do aparelho (Figura 9). </li></ol> Iniciando uma corrida <ol><li> Insira o pendrive com o arquivo runs criadas com o software do instrumento na porta USB na parte da frente do aparelho. </li><li> Selecione &quot;Run&quot; no menu principal e pressione &quot;OK&quot;. </li><li> Use as setas de rolagem para selecionar o arquivo de execução desejado e pressione &quot;Select&quot;. </li></ol> Nota: O aparelho começará a distribuição de reagentes, quando toda a pressão pré e níveis de temperatura são alcançados (isso pode levar alguns minutos). Durante o funcionamento, o instrumento tela exibe o pyrogram do bem seleccionada em tempo real. Use as setas de rolagem para visualizar o pyrogram de outros poços. Completar uma corrida <ol><li> Quando o instrumento confirma que o prazo terminou eo arquivo de executada, foi salvo no pendrive, clique em &quot;Fechar&quot;. </li><li> Retire o stick USB. Se ele foi removido antes do prazo terminar, insira o stick USB. Selecione &quot;Administração&quot; e depois em &quot;Copy é executado não salvos&quot;. </li><li> O arquivo de correr agora podem ser abertos e analisados ​​usando o software do aparelho e comparadosde uma biblioteca de micróbios conhecidos utilizando o software Identifire. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+PCR+Handbook%22">PyroMark PCR Handbook</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
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</ol>

Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Qiagen. Autores Ahmed, Durocher, Jessen e Vardi são funcionários da Qiagen Inc., que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Vários novos métodos de sequenciamento de próxima geração foram comercializados. Três dos métodos mais utilizados são semicondutores seqüenciamento de íons, única molécula de sequenciamento em tempo real, e seqüenciamento por síntese (SBS). 3-11 Cada um desses métodos depende de seqüenciamento por síntese, mas empregar novas plataformas para a detecção dos nucleotídeos incorporados. No ião semicondutor sequenciação, uma cadeia simples de DNA serve como um molde para a cadeia de sequenciação. Polimerase e 12 nucleótidos são adicionados sequencialmente, tal como no pyrosequencing. Quando um nucleótido é adicionado à crescente cadeia de ADN, um ião de hidrogénio é libertado. O ião de hidrogénio é detectado por um sensor baseado em transistores de efeito de campo. Única molécula de sequenciação em tempo real depende do modo de guia de ondas de zero (ZMW). ZMW 13 A é uma pequena estrutura em que uma única molécula de polimerase é ligado ao fundo do poço. Ele é iluminado de tal maneira que uma floremolécula de perfume pode ser detectado. Cada nucleótido é marcado com uma molécula fluorescente. Como um nucleótido marcado é incorporado por fluorescência, um detector identifica as sequências de nucleótidos. Quando o próximo nucleótido é adicionada, a molécula fluorescente é clivada 14. Sequenciação por síntese (SBS) utiliza um método único para amplificar o DNA alvo de tal modo que os conjuntos de sequências únicas são gerados. De 15 modelos de cadeia simples são geradas e, em seguida, a cadeia complementar é sintetizado. Cada nucleótido é marcado com uma molécula fluorescente e depois de cada adição de base da fluorescência de base adicionada é gravado.

Pyrosequencing é um método rápido e preciso de sequências de ácidos nucleicos que se baseia no princípio de &quot;sequenciação por síntese&quot;. &quot;Sequenciação por síntese&quot; envolve o uso de um único molde de ADN para sintetizar a cadeia complementar uma cadeia de base de cada vez, e detectando a base incorporada (A, T, G ou C) em cada passo, por detecção de um sinal quimioluminescente. A reacção pirosequenciamento inclui ADN molde, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), polimerase de ADN, sulfurilase de ATP, a luciferina, a luciferase e a apirase. A reacção de síntese é iniciada pela adição de um dos quatro dNTPs e DNA polimerase a um único molde de ADN de cadeia simples biotinilado. Polimerase de ADN incorpora o dNTP complementar para o molde, com a subsequente libertação de pirofosfato (Figura 1). Sulfurilase de ATP proporcionalmente converte o pirofosfato de ATP. ATP actua como um catalisador para a conversão mediada pela luciferase de luciferina para oxiluciferina, o qualgera luz (Figura 2). A intensidade da luz é proporcional ao número de nucleótidos incorporados e determina se está presente na cadeia molde sequencialmente (Figura 3) uma ou mais específico do dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Qualquer dNTP não incorporada é degradada pela apirase, antes da adição do próximo dNTP para a continuação da reacção de síntese. Este &quot;sequenciação por síntese&quot; reacção é repetida com a adição de cada um dos quatro dNTP até a sequência de ADN do molde de ADN de cadeia simples é determinado. Para ver uma animação da reação pirosequenciamento <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Concentrado, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, Água sem 978705</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td>Os primers <td>Qiagen</td><td>978776 ou 978777</td><td>devem ser adquiridos de um fabricante de oligonucleotídeos estabelecido (ou seja QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Os primers liofilizados devem ser dissolvidos em TE para fornecer uma solução estoque de 100 &mu;M.</td></tr><tr><td>Reagentes Pyromark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Água de alta pureza (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm ou equivalente)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose Contas de Alto Desempenho</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Recozimento PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Desnaturação PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>Caixa porta-pontas PyroMark Q96 HS</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho a vácuo PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de placa PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pirosequenciamento de identificação microbiana e caracterização

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas e detecção de mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. As vantagens de pirosequenciamento para aplicações de microbiologia incluem high-throughput screening rápido e confiável e correta identificação de micróbios e mutações do genoma microbianas. Pyrosequencing envolve a sequenciação de ADN, sintetizando a cadeia complementar de uma única base de cada vez, enquanto que a determinação do nucleótido específico ser incorporada durante a reacção de síntese. A reacção ocorre em imobilizada único molde de ADN de cadeia simples onde os quatro desoxirribonucleótidos (dNTP) são adicionados sequencialmente e os dNTPs não incorporados são degradados enzimaticamente, antes da adição do próximo dNTP para a reacção de síntese. Detecção da base específica incorporada no molde é monitorizada por geração de chemilumsinais inescent. A ordem dos dNTPs que produzem os sinais quimioluminescentes determina a sequência de ADN do molde. A capacidade de sequenciação em tempo real de pyrosequencing tecnologia permite a identificação microbiana rápido num único ensaio. Além disso, o instrumento pirosequenciamento, pode analisar a diversidade genética completa de resistência às drogas anti-microbianas, incluindo a tipagem de SNPs, mutações pontuais, inserções e deleções, bem como a quantificação de múltiplas cópias do gene que podem ocorrer em alguns resistência anti-microbiana padrões.

Os resultados de uma corrida pyrosequencing típica utilizando o programa mostra a localização dos iniciadores para a frente e reverso usados ​​para a geração do fragmento amplificado, e o iniciador de sequenciação utilizada para a reacção dentro do pyrosequencing 16S ribossomal sequência conservada (Figura 10). Hipervariável A sequência entre o primer locais permite a identificação de bactérias de um grande número de espécies bacterianas utilizando o iniciador de sequenciação conservada (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Como um controlo interno de qualidade, a sequência de variação de ADN da região variável pode ser verificado para assegurar que a região de DNA correcta foi analisado . O software pirosequenciamento permite a comparação e alinhamento da sequência gerada a uma base de dados interna de sequências ribossomais bacterianas para identificação bacteriana. Além disso, uma sequência pode ser analisada para determinar as mutações que conferem resistência ao antibiótico. Por exemplo, a análise de mutações nos genes ribossomais 23S do Helicobpylori acter demonstra dois padrões de mutação (ou AGA GAA) que conferem resistência aos antibióticos (Figura 11). Análise dos vários isolados do mesmo paciente pode ser ensaiada simultaneamente para controlar o aparecimento de resistência a drogas ao longo do tempo para auxiliar em investigações epidemiológicas dos surtos microbianas de resistência a drogas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Produto de PCR biotinilado é usado como um modelo para incorporar dNTPs por polimerase do ADN, conduzindo à geração de pirofosfato (PPi). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. Sulfurilase de ATP proporcionalmente converte pirofosfato de ATP actos ATP. Como um catalisador para a conversão mediada pela luciferase de luciferina para oxiluciferina, o que gera luz que é próproporcional à quantidade de ATP. A luz é registada como o pico do traçado pyrogram e indica a incorporação de nucleótidos. Os dNTPs não incorporados são degradados pela apirase antes do próximo dNTP é adicionado para a continuação da síntese. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. A intensidade de luz gerada indica se foi incorporado um ou mais específico do dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP) na cadeia molde sequencialmente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Figura 4. Fluxograma para preparação de mestre mix para imobilizar o produto PCR biotinilado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark estação de trabalho, com placa de PCR, placa PyroMark e locais da calha. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Figura 6. Localização da chave de vácuo ON e OFF posições. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Ferramenta de vácuo. Tratamento adequado da ferramenta de vácuo. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Cartucho portão se abriu com o cartucho no lugar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Figura 9. Cartucho inserido corretamente com portão fechado. &quot;Fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Figura 10. Pyrosequencing bacterianos baseados em resultados de identificação. Iniciadores de PCR foram concebidos para regiões conservadas do molde de ADN, e o iniciador de sequenciação está posicionado imediatamente a montante de uma sequência de ADN de identificação hipervariável bem caracterizados no âmbito do amplicão (mostrado em azul). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Figura 11. Detecção de resistência aos medicamentos antibióticos em Helicobacter pylori utilizando pyrosequencing. Análise de mutações nos genes 23S que conferem resistência antibacteriana em Helicobacter pylori contendo GAA ou seqüências AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volume por reação </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 mL </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Concentrado CoralLoad, 10x </td><td> 2,5 mL </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM de MgCl 2 (opcional) </td><td> Variável </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opcional) </td><td> 5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variável / Variável </td><td> ΜM/0.2 0,2 ​​mM </td></tr><tr><td> Água RNase </td><td> Variável </td><td> - </td></tr><tr><td> Volume total (após a adição de ADN-alvo) </td><td> 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura de reacção de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Comentários adicionais </td></tr><tr><td> Passo de activação inicial de PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA polimerase é ativado </td></tr><tr><td> 3 etapa de ciclismo: desnaturação </td><td> 30 seg </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Recozimento </td><td> 30 seg </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Para obter ADN genómico Para bisulfite DNA convertido </td></tr><tr><td> Extensão </td><td> 30 seg </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Extensão final </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Especificações do ciclo de PCR.

Pyrosequencing é uma técnica versátil, que facilita a sequenciação do genoma microbiano que pode ser utilizado para identificar espécies bacterianas, discriminar estirpes bacterianas, e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes anti-microbianos. Neste vídeo, o procedimento para a geração microbiana amplicon, amplicon pyrosequencing, e análise da seqüência do DNA será demonstrado.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar uma bactéria por meio da análise da sequência de DNA ribossomal 16S utilizando a metodologia de pirosequenciamento. Isso é alcançado primeiro amplificando o DNA alvo por meio da reação em cadeia da polimerase usando um iniciador biotinilado. O amplicon biotinilado é então imobilizado usando esferas revestidas com estreptavidina e purificado com tampões de lavagem.Em seguida, o amplicon é desnaturado e os iniciadores para sequenciamento ribossomal 16 s são ligados às fitas simples de DNA. O objetivo desta etapa é preparar o DNA para o sequenciamento. Por fim, a reação de sequenciamento do DNA ocorre por pirosequenciamento, um método rápido e preciso para sequenciar ácidos nucleicos com base no princípio do sequenciamento pela síntese.O alicon biotinilado é usado como molde pela DNA polimerase para incorporar dNTPs uma base por vez, levando à geração de pirofosfato. A pirofosfatase converte proporcionalmente o pirofosfato em ATP, que a luciferase catalisa na conversão de luciferina em oxiluciferina, gerando luz proporcional à quantidade de ATP. A luz é registrada como um pico no traçado de pirosequenciamento e indica a incorporação do nucleotídeo. Os dNTPs não incorporados são degradados pela apirase antes que o próximo dNTP seja adicionado, permitindo a continuação da síntese.O sinal quimioluminescente registrado no programa permite que a sequência de DNA seja determinada. Os resultados obtidos são sequências de DNA ribossômico 16S, que são usadas para identificar a bactéria por meio da comparação com uma base de dados de referência de DNA ribossômico. A pirosequenciação é uma técnica versátil que facilita o sequenciamento do genoma microbiano e pode ser utilizada para identificar espécies bacterianas, discriminar cepas bacterianas e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes antimicrobianos.Neste vídeo, será demonstrado o procedimento para geração de amplicons bacterianos, pirosequenciamento de amplicons e análise de sequência de DNA. Para iniciar o procedimento de amplificação do molde, descongele todas as soluções necessárias e misture cada uma delas completamente. Todo o trabalho pode ser realizado à temperatura ambiente. Monte a reação de PCR de acordo com esta tabela.Observe que uma concentração final de cloreto de magnésio de 1,5 milimolar fornecerá resultados satisfatórios na maioria dos casos. No entanto, se for necessária uma concentração mais alta de magnésio, até 3,5 microlitros de cloreto de magnésio 25 milimolar podem ser adicionados à reação. Um dos primers deve ser biotinilado em sua extremidade cinco prima, e recomenda-se que o primer seja purificado por HPLC de forma rigorosa.Homogeneíze a mistura de reação pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, distribua volumes apropriados em tubos de PCR. Em seguida, adicione o DNA molde a cada tubo de PCR. Recomenda-se 10 nanogramas de DNA genôm游戏副本ico por reação.Coloque os tubos de PCR em um termociclador e inicie este programa de ciclagem antes de preparar a mistura mestra. Agite suavemente o frasco de strep avid e de perolas revestidas com soro para garantir uma suspensão homogênea. Prepare uma mistura mestra de acordo com este fluxograma.Combine as esferas, o tampão de ligação e água de alta pureza em um tubo de microcentrífuga. Dependendo do volume do produto de PCR utilizado, adicione de 60 a 75 microlitros do mix mestre em cada poço de uma placa de PCR, de modo que o volume total seja de 80 microlitros por poço. Adicione de 5 a 20 microlitros do produto de PCR biotinilado a cada poço.O volume por poço deve ser agora de 80 microlitros. Selle os poços com tampas em tira e agite a placa de PCR a 1.400 rpm por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente utilizando um agitador orbital. Inicie este procedimento diluindo os iniciadores de sequenciamento até 0,3 micromolar com um tampão adequado e distribuindo 25 microlitros em cada poço da placa de reação.Posicione a placa na estação de vácuo. Preencha as canaletas da estação de acordo com este diagrama. 50 mililitros de etanol 70% na canaleta um, 40 mililitros de solução de desnaturação na canaleta dois, 50 mililitros de tampão de lavagem na canaleta três, 50 mililitros de água de alta pureza na canaleta quatro e 70 mililitros de água de alta pureza na canaleta cinco.Ligue a bomba de vácuo e certifique-se de que a chave na ferramenta de vácuo esteja ajustada para ligar, a fim de enxaguar as sondas do filtro com água de alta pureza. Na cuba cinco, posicione a placa de PCR com as esferas na estação de trabalho, garantindo que tanto a placa de PCR quanto a placa de reação estejam na mesma orientação. Abaixe a ferramenta de vácuo nos poços da placa de PCR.Por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado, as esferas serão capturadas pela ferramenta de vácuo com o vácuo ainda ligado. Lave a ferramenta com etanol 70% por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado. Em seguida, lave a ferramenta com a solução de desnaturação por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado.Depois disso, lave a ferramenta com o tampão de lavagem por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado com o vácuo ainda ligado. Levante a ferramenta de vácuo para além de 90 graus em relação à vertical por cinco segundos para permitir que todo o líquido escorra para fora da ferramenta de vácuo. Agora desligue a bomba e alinhe a ferramenta de vácuo com a placa de reação de três.Introduza a ferramenta de vácuo nos poços. Em seguida, agite suavemente de um lado para o outro por aproximadamente 10 segundos para liberar as esferas nos poços contendo o iniciador de sequenciamento. Coloque a ferramenta de vácuo no recipiente com água para limpeza, a fim de hibridar o iniciador de sequenciamento ao DNA.Coloque a placa de reação em um suporte para placa pré-aquecido. Aqueça a placa a 80 graus Celsius por dois minutos. Remova a placa do suporte e coloque-a sobre a bancada para esfriar à temperatura ambiente por cinco minutos.Inicie este procedimento ligando o instrumento utilizando o interruptor de energia localizado acima do cabo de alimentação para determinar os volumes necessários. Configure um arquivo de execução no software do instrumento e, no menu ferramentas, selecione informações pré-execução. Preencha uma cartela de acordo com as instruções fornecidas na página de informações pré-execução.Coloque a ponta da pipeta no canto de cada poço o mais para baixo possível, garantindo que não haja bolhas de ar. Abra o compartimento e insira o cartucho com o rótulo voltado para frente. Certifique-se de que o cartucho esteja corretamente inserido e feche o compartimento.Abra o suporte da placa e posicione a placa de reação dentro do instrumento. Feche o suporte da placa e a tampa do instrumento. Insira o pendrive com os arquivos de execução criados com o software do instrumento na porta USB na parte frontal do instrumento.Ok para visualizar o menu dos arquivos de execução desejados. Use as setas de rolagem para selecionar o arquivo de execução desejado e pressione selecionar. Quando todos os níveis predefinidos de pressão e temperatura forem alcançados, o instrumento iniciará a dispensação de reagentes durante uma execução.A tela do instrumento exibe em tempo real a pirografia do poço selecionado. Utilize as setas de rolagem para visualizar as pirografias de outros poços. Quando o instrumento confirmar que a execução foi concluída e que o arquivo da execução foi salvo no pendrive, pressione fechar.Remova o pendrive. Os resultados de uma corrida típica de pirosequenciamento são mostrados aqui. Os iniciadores PCR direto e reverso são projetados para regiões conservadas do molde de DNA, que é a sequência ribossomal 16 s.Neste exemplo, o iniciador de sequenciamento está posicionado imediatamente a montante de uma sequência de DNA hipervariável bem caracterizada e identificadora, dentro do amplicon mostrado em azul. Essa sequência hipervariável permite a identificação bacteriana de um grande número de espécies bacterianas utilizando o iniciador de sequenciamento conservado como controle interno de qualidade; a sequência de DNA que delimita a região variável pode ser verificada para assegurar que a região de DNA correta tenha sido analisada. O software de pirosequenciamento permite a comparação e o alinhamento da sequência gerada com uma base de dados interna de sequências ribossomais bacterianas para identificação bacteriana.Além disso, uma sequência pode ser analisada para determinar mutações que conferem resistência a antibióticos. Por exemplo, a análise de mutações nos genes ribossomais 23 s de Helicobacter pylori revela dois padrões de mutação, GAA ou GA, que conferem resistência a antibióticos. A pirosequenciação é uma técnica versátil que facilita o sequenciamento do genoma microbiano.As vantagens do sequenciamento por pirosequenciamento em aplicações de microbiologia incluem triagem rápida e confiável de alto rendimento e identificação precisa de microrganismos e mutações no genoma microbiano. Além disso, a metodologia de pirosequenciamento pode analisar a diversidade genética completa da resistência a fármacos antimicrobianos, incluindo a tipagem de mutações pontuais de SNPs, inserções e deleções, bem como a quantificação de múltiplas cópias gênicas que podem ocorrer em alguns padrões de resistência antimicrobiana. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos de sequenciamento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pyrosequencing (R) é um dos métodos mais completo e simples até à data utilizada para analisar polimorfismos. Este método levou a uma avaliação rápida e eficiente polimorfismo de nucleotídeo único incluindo muitos polimorfismos clinicamente relevantes. A técnica e metodologia de Pyrosequencing é explicado.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

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Aprenda a técnica de pirosequenciamento para identificação de bactérias e detecção de mutações genéticas usando DNA ribossômico 16S. Este método permite sequenciamento rápido e preciso de genomas microbianos.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

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