Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar uma bactéria por meio da análise da sequência de DNA ribossômico de 16 s usando a metodologia de pirosequenciamento. Isso é obtido primeiro amplificando o DNA alvo por meio de uma reação em cadeia da polimerase usando um primer biotinilado. O amplicon biotinilado é então imobilizado usando esferas de esferas revestidas com estreptavidina e purificado usando tampões de lavagem.

Em seguida, o amplicon é desnaturado e os primers de sequenciamento ribossômico de 16 s são ELL para as fitas simples de DNA. O objetivo desta etapa é preparar o DNA para o sequenciamento. Finalmente, a reação de sequenciamento de DNA ocorre por pirosequenciamento, um método rápido e preciso para sequenciar ácidos nucléicos com base no princípio do sequenciamento por síntese.

O alicon biotinilado é usado como molde pela DNA polimerase para incorporar DN TPS uma base de cada vez, levando à geração de pirofosfato. Uma Urease TP Sul converte proporcionalmente pirofosfato em A-T-P-A-T-P catalisa a conversão mediada por luciferase de Lúcifer em Lúcifer, que gera luz proporcional à quantidade de um TP. A luz é registrada como um pico no traço pirotécnico e indica a incorporação de nucleotídeos. Os NTPs DN não incorporados são degradados por apras antes que o próximo DNTP seja adicionado para continuação da síntese.

O sinal quimioluminescente registrado no rogram permite que a sequência de DNA seja determinada. Os resultados obtidos são 16 sequências ribossômicas de SDNA, que são usadas para identificar a bactéria por comparação com um banco de dados de referência de DNA ribossômico. O pirosequenciamento é uma técnica versátil que facilita o sequenciamento do genoma microbiano e pode ser usado para identificar espécies bacterianas, discriminar cepas bacterianas e detectar mutações genéticas que conferem resistência a agentes antimicrobianos.

Neste vídeo, será demonstrado o procedimento para geração de amplicon bacteriano, sequenciamento piro de amplicon e análise de sequência de DNA Para iniciar o procedimento de amplificação do modelo, descongele todas as soluções necessárias e misture cada uma completamente. Todo o trabalho pode ser feito à temperatura ambiente. Configure a reação de PCR de acordo com esta tabela.

Observe que uma concentração final de cloreto de magnésio de 1,5 milimolar fornecerá resultados satisfatórios na maioria dos casos. No entanto, se uma concentração mais alta de magnésio for necessária até 3,5 microlitros de 25 milimolares, o cloreto de magnésio pode ser adicionado a uma reação. Um primer deve ser biotinilado em suas cinco extremidades principais, e recomenda-se que o primer seja purificado por HPLC completamente.

Misture a mistura de reação pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, distribua os volumes apropriados em tubos de PCR. Em seguida, adicione DNA molde a cada tubo de PCR. Recomenda-se 10 nanogramas de DNA genômico por reação.

Coloque os tubos de PCR em um ciclador e inicie este programa de ciclagem antes de fazer a mistura principal. Agite a garrafa de contas de seros ávidos e revestidos para garantir uma suspensão homogênea. Faça uma mistura mestre de acordo com este fluxograma.

Combinando grânulos, tampão de ligação e água de alta pureza em um tubo de microcentrífuga. Dependendo do volume de produto de PCR usado, dispensou de 60 a 75 microlitros de master mix em cada poço de uma placa de PCR para que o volume total seja de 80 microlitros por poço. Adicione cinco a 20 microlitros de produto de PCR biotinilado a cada poço.

O volume por poço agora deve ser de 80 microlitros. Sele os poços com tampas de tira e agite a placa de PCR a 1.400 RPM por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente usando um agitador orbital. Comece este procedimento diluindo os primers de sequenciamento a 0,3 micromolar com um tampão ajoelhado e dispensando 25 microlitros em cada poço da placa de reação.

Posicione a placa na estação de trabalho a vácuo. Encha as calhas da estação de trabalho de acordo com este diagrama. 50 mililitros de etanol a 70% na calha, 40 mililitros de solução de desnaturação na calha, dois 50 mililitros de tampão de lavagem na calha três, 50 mililitros de água de alta pureza na calha quatro e 70 mililitros de água de alta pureza na calha cinco.

Ligue a bomba de vácuo e certifique-se de que o interruptor da ferramenta de vácuo esteja na posição de enxaguar as sondas do filtro com água de alta pureza. Na calha cinco, posicione a placa PCR com esferas na estação de trabalho, garantindo que as placas PCR e de reação estejam na mesma orientação. Abaixe a ferramenta de vácuo nos poços da placa de PCR.

Por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado, as esferas serão capturadas pela ferramenta de vácuo com o vácuo ainda ligado. Lave a ferramenta com etanol a 70% por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado. Em seguida, lave a ferramenta com solução de desnaturação por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado.

Depois disso, lave a ferramenta com tampão de lavagem por 20 segundos ou até que todo o volume tenha sido aspirado com o aspirador ainda ligado. Levante a ferramenta de vácuo para além de 90 graus na vertical por cinco segundos para permitir que todo o líquido escorra para fora da ferramenta de vácuo. Agora desligue a bomba e alinhe a ferramenta de vácuo com três placas de reação.

Abaixe a ferramenta de vácuo nos poços. Em seguida, agite suavemente de um lado para o outro por aproximadamente 10 segundos para liberar as esferas nos poços contendo o primer de sequenciamento. Coloque a ferramenta de vácuo no bebedouro para limpeza do primer de sequenciamento ao DNA.

Coloque a placa de reação em um suporte de placa pré-aquecido. Aqueça o prato a 80 graus Celsius por dois minutos. Retire a placa do suporte e coloque-a no balcão para esfriar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Comece este procedimento ligando o instrumento usando o botão liga/desliga localizado acima do cabo de alimentação para determinar os volumes necessários. Configure um arquivo de execução no software do instrumento e, no menu de ferramentas, selecione as informações de pré-execução. Encha um cartucho de acordo com as instruções fornecidas na página de informações de pré-execução.

Coloque a ponta da pipeta no canto de cada poço o mais baixo possível, certificando-se de que não haja bolhas de ar. Abra a porta do cartucho e insira o cartucho com a etiqueta voltada para a frente. Certifique-se de que o cartucho esteja inserido corretamente e feche o portão.

Abra a estrutura de suporte da placa e posicione a placa de reação dentro do instrumento. Feche a estrutura de suporte da placa e a tampa do instrumento. Insira o pendrive com os arquivos de execução criados com o software do instrumento na porta USB na frente da prensa de instrumentos.

Ok, para ver o menu de arquivos de execução desejados. Use as setas de rolagem para selecionar o arquivo de execução desejado e pressione selecionar. Quando todos os níveis predefinidos de pressão e temperatura forem atingidos, o instrumento começará a dispensar reagentes durante uma execução.

A tela do instrumento exibe o piro do poço selecionado em tempo real. Use as setas de rolagem para ver os pyros de outros poços. Quando o instrumento confirmar que a execução foi concluída e o arquivo de execução foi salvo no pendrive, pressione fechar.

Remova o pendrive. Os resultados de uma execução típica de sequenciamento pirotécnico são mostrados aqui. Os primers de PCR direto e reverso são projetados para regiões conservadas do molde de DNA, que é a sequência ribossômica de 16 s.

Neste exemplo, o primer de sequenciamento é posicionado imediatamente a montante de uma sequência de DNA hipervariável de identificação bem caracterizada dentro do amplicon mostrado em azul. Esta sequência hipervariável permite a identificação bacteriana de um grande número de espécies bacterianas usando o primer de sequenciamento conservado como um controle de qualidade interno, a sequência de DNA que coloca a região variável entre parênteses pode ser verificada para garantir que a região correta do DNA foi analisada. O software de pirosequenciamento permite a comparação e o alinhamento da sequência gerada com um banco de dados interno de sequências ribossômicas bacterianas para identificação bacteriana.

Além disso, uma sequência pode ser analisada para determinar mutações que conferem resistência a antibióticos. Por exemplo, a análise de mutações nos genes ribossômicos de 23 s do helicobacter pylori revela dois padrões de mutação, GAA ou GA, que conferem resistência a antibióticos. O sequenciamento pirotécnico é uma técnica versátil que facilita o sequenciamento do genoma microbiano.

As vantagens do pirosequenciamento de aplicações microbiológicas incluem triagem rápida e confiável de alto rendimento e identificação precisa de micróbios e mutações do genoma microbiano. Além disso, a metodologia de pirosequenciamento pode analisar toda a diversidade genética da resistência a medicamentos antimicrobianos, incluindo tipagem de mutações pontuais de SNPs, inserções e deleções, bem como quantificação de múltiplas cópias de genes que podem ocorrer em alguns padrões de resistência antimicrobiana. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos de sequenciamento.