Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

O objetivo geral do experimento a seguir é ilustrar o uso de glicosato para a desglicosilação enzimática e análise de glicosilação ligada a n e O em uma glicoproteína modelo. Isso é conseguido tratando uma glicoproteína com F de PGA ou com a mistura de desglicosilação de proteínas. Além disso, a mistura de desglicosilação de proteínas foi suplementada com uma mistura de exo glyco ass adicionais, que às vezes ajudam a remover açúcares resistentes.

Ilustramos este método usando um modelo de gonadotrofina coriônica humana recombinante de glicoproteína beta, ou HCG beta na próxima página do SDS, seguido por coloração com azul de Kumasi e um método de coloração específico para açúcar. Pro Q Emerald 300 são utilizados para analisar o D glicosilado. Os resultados da amostra de HCG beta são obtidos, que mostram que o HCG beta é heterogeneamente glicosilado e contém múltiplas formas de glico com base nas diferenças na migração de proteínas com e sem tratamento com glicosato e no sinal diminuído na coloração ProQ à medida que os glicanos são removidos sucessivamente.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a análise por espectrometria de massa, é que ela é simples, usa equipamentos de laboratório comuns e é boa para o biólogo de glico novato. Este método pode responder a perguntas-chave no campo do glico, como é minha proteína glicosilada. Para iniciar a desglicosilação enzimática, descongele os tampões fornecidos do kit de desglicosilação de proteínas.

Misture bem os tubos e mantenha-os em temperatura ambiente. Coloque a enzima contendo frascos para injetáveis no gelo, dissolva o conteúdo do frasco para injetáveis de HCG beta em 600 microlitros de água destilada e mantenha no gelo. Depois de preparar um mililitro de um tampão XG sete diluindo o estoque de 10 x em água destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.

Prepare a mistura de exo glicosato combinando dois microlitros, cada uma das quatro doenças do exo glico. Em seguida, adicione HCG beta e 10 x tampão de desnaturação de glicoproteína a sete tubos de PCR numerados, conforme indicado no protocolo escrito, tampe os tubos e misture suavemente as proteínas no termociclador incubando 10 minutos a 94 graus Celsius, seguido por uma retenção de quatro graus Celsius Depois de remover os tubos da centrífuga termocicladora para remover qualquer condensação visível em cada tubo de reação, Adicione os reagentes restantes de acordo com o protocolo escrito. Feche os tubos de PCR usando novas tampas.

Em seguida, misture os tubos batendo suavemente quatro vezes depois de girar o conteúdo, coloque os tubos na incubação do termociclador a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, resfrie as amostras a quatro graus Celsius. Para configurar a página SDS, prepare um novo buffer de carregamento SDS de três x redutor.

Com TDT, adicione 12,5 microlitros do tampão de carga SDS redutor de três x preparado Para cada amostra, feche os tubos com novas tampas e bata suavemente nos tubos para misturar. Incube os tubos em um termociclador a 94 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie a quatro graus Celsius Após a carga de incubação, 30 microlitros de cada amostra e 10 microlitros do marcador de proteína em um gel de triglicina de 10 a 20%. Salvando o restante de cada amostra.

Eletros o gel a 130 volts até que a frente D esteja perto do fundo do gel. Quando o gel terminar de escorrer, remova o gel do gesso e coloque-o em uma pequena caixa de plástico com mancha azul kumasi suficiente para cobrir a mancha de gel. O gel por uma hora com agitação suave Depois que o gel estiver manchado.

Lave três vezes por 30 minutos. Em 50 mililitros de solução de detenção, grave as imagens usando um transiluminador ou scanner de luz branca. Alternativamente, o gel pode ser seco entre folhas de celofane.

Em um quadro, passe o restante de cada amostra e um marcador de proteína em um gel de triglicina de 10 a 20% enquanto o gel estiver funcionando. Dissolva o reagente esmeralda ProQ com DMF e prepare as soluções de correção, lavagem e oxidação para a mancha seguindo o manual do produto fornecido com o kit. Quando a eletroforese estiver concluída, remova o gel do molde e coloque-o em uma caixa de plástico.

Fixe o gel adicionando 100 mililitros da solução fixa preparada. Deixe o gel durante a noite em temperatura ambiente com agitação suave no dia seguinte. Lave o gel com 100 mililitros da solução de lavagem preparada por 10 a 20 minutos em temperatura ambiente com agitação suave, repetindo a lavagem uma segunda vez com a solução de lavagem fresca.

Em seguida, oxide os carboidratos incubando o gel com agitação suave por 30 minutos em 25 mililitros da solução oxidante preparada, siga a incubação com duas lavagens adicionais enquanto o gel está lavando. Prepare a coloração ProQ emerald 300 fresca adicionando 500 microlitros da solução reagente ProQ Emerald 300 a 25 mililitros de tampão de coloração fornecido no kit. Manchar o gel incubando na mancha preparada em condições escuras com agitação suave durante 90 a 120 minutos após a coloração do gel.

Repita as duas etapas de lavagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, grave as imagens com um iluminador UV trans a 300 nanômetros. Como etapa final, compare as imagens do gel corado kumasi com o gel corante esmeralda ProQ.

As mudanças na migração de proteínas após a desglicosilação enzimática podem ser vistas quando a amostra controle é comparada com o tratamento F do PGA. Para remover n glicanos e para o tratamento de mistura de desglicosilação para remover n e O glicanos, nenhuma redução adicional no tamanho é observada após a digestão com glicosato adicional. Além de uma mudança na massa, as bandas tornam-se mais nítidas à medida que os glicanos são removidos.

Uma banda correndo sob o marcador de 17 kilodalton provavelmente representa o polipeptídeo beta HCG totalmente desglicosilato. As pistas cinco a sete mostram as bandas correspondentes ao Glico. Outras bandas podem derivar de desglicosilação incompleta ou de várias proteínas não identificadas presentes na amostra beta de HCG.

O reagente verde-esmeralda oxida e mancha todos os glicanos presentes em uma molécula de proteína. Portanto, a intensidade do sinal diminui à medida que o HCG beta é enzimaticamente d glicosilado. O sinal residual nas raias três e quatro indica a presença de motivos glicanos, que são resistentes às enzimas utilizadas.

O glicosato adicional é usado na pista quatro. Remova alguns resíduos extras de açúcar. A migração de proteínas é a mesma, mas uma ligeira redução na intensidade da coloração pode ser observada.

Porções de açúcar resistentes não estavam presentes em todas as espécies de proteínas. Algumas bandas não foram detectadas pelo verde esmeralda, indicando que eram extensivamente glicosiladas Dados adicionais apóiam a conclusão de que o HCG beta é heterogeneamente glicosilado. A faixa inferior na pista dois é fraca na imagem verde esmeralda.

Embora a banda superior na pista dois seja brilhante, indicando que muitos grupos GLYCAN ainda estão presentes, esses dados apóiam a conclusão de que o HCG beta recombinante expresso em células de camundongo contém múltiplas formas de glico devido à heterogeneidade inerente da glicosilação. Seguindo este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: qual é a taxa de ocupação? Qual é a extensão da glicosilação ou qual é a estrutura fina dos glicanos?

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar glicosilato para a desglicosilação enzimática e análise de glicanos ligados a NNO. Sobre glicoproteínas. A escolha da detecção pode ser difícil porque as regiões de coloração de proteínas são úteis apenas se a glicosilação resultar em uma mudança significativa na massa molecular de outras proteínas.

Vimos migrações anormais após a glicosilação e descobrimos que qualquer mudança na migração é evidência de que a proteína foi desglicosilada.