Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

O objetivo geral do experimento a seguir é ilustrar o uso da glicosidase para a desglicosilação enzimática e análise da glicosilação N e O ligada em uma glicoproteína modelo. Isso é alcançado tratando uma glicoproteína com PGA's F ou com a mistura de desglicosilação proteica. Além disso, a mistura de desglicosilação proteica foi suplementada com uma mistura de exoglicosidases adicionais, que às vezes ajudam a remover açúcares resistentes.

Ilustramos este método utilizando uma proteína recombinante modelo, a gonadotrofina coriônica humana beta glicoproteica, ou HCG beta, seguida de SDS-PAGE, coloração com Kumasi blue e um método de coloração específica para açúcares. O Pro Q Emerald 300 é utilizado para analisar a glicosilação D. São obtidos resultados da amostra de HCG beta, que demonstram que a HCG beta é heterogeneamente glicosilada e contém múltiplas glicoformas, com base nas diferenças na migração proteica com e sem tratamento glicosídico e no sinal reduzido na coloração ProQ à medida que os glicanos são sucessivamente removidos.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise por espectrometria de massa, é que ela é simples, utiliza equipamentos de laboratório comuns e é adequada para o pesquisador novato em glicobiologia. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da glicobiologia, como se minha proteína está glicosilada. Para iniciar a desglicosilação enzimática, descongele os tampões fornecidos no kit de desglicosilação proteica.

Misture bem os tubos e mantenha-os em temperatura ambiente. Coloque os frascos contendo a enzima sobre gelo, dissolva o conteúdo do frasco de beta HCG em 600 microlitros de água destilada e mantenha sobre gelo. Após preparar um mililitro de tampão 1 XG sete diluindo o estoque 10 x em água destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.

Prepare a mistura de glicosídeo exo combinando dois microlitros de cada um dos quatro glicosídeos exo. Em seguida, adicione beta-HCG e tampão desnaturante de glicoproteína 10x a sete tubos PCR numerados conforme indicado no protocolo escrito, tampe os tubos e misture suavemente. Desnature as proteínas no termociclador incubando por 10 minutos a 94 graus Celsius, seguido por uma pausa a quatro graus Celsius. Após remover os tubos do termociclador, centrifugue para eliminar qualquer condensação visível. A cada tubo de reação, adicione os reagentes restantes de acordo com o protocolo escrito. Feche os tubos PCR usando tampas novas.

Em seguida, misture os tubos batendo suavemente quatro vezes após centrifugar os conteúdos, coloque os tubos no termociclador e incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Prossiga resfriando as amostras a quatro graus Celsius. Para preparar o gel de SDS-PAGE, prepare tampão de carga SDS redutor a 3x fresco.

Com DTT, adicione 12,5 microlitros do tampão de carga SDS redutor três vezes preparado a cada amostra, feche os tubos com tampas novas e agite suavemente os tubos para misturar. Incube os tubos em um termociclador a 94 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie a quatro graus Celsius. Após a incubação, carregue 30 microlitros de cada amostra e 10 microlitros do marcador de proteína em um gel tri-glicina 10 a 20%. Guarde o restante de cada amostra.

Eletroforese o gel a 130 volts até que a frente de D esteja próxima à base do gel. Quando a eletroforese terminar, remova o gel do molde e coloque-o em uma caixa plástica pequena com quantidade suficiente de corante azul de kumasi para cobrir o gel. Incube o gel por uma hora com agitação suave após a coloração do gel.

Lave três vezes durante 30 minutos. Em 50 mililitros de solução de retenção, registre as imagens utilizando um transiluminador de luz branca ou um scanner. Alternativamente, o gel pode ser seco entre folhas de celofane.

Em uma cuba, execute o restante de cada amostra e um marcador proteico em um gel de Tri glicina de 10 a 20% enquanto o gel estiver em funcionamento. Dissolva o reagente ProQ Emerald em DMF e prepare as soluções estoque de fixação, lavagem e oxidação para a coloração, seguindo o manual do produto fornecido com o kit. Quando a eletroforese estiver concluída, remova o gel da placa e coloque-o em uma caixa de plástico.

Fixe o gel adicionando 100 mililitros da solução fixadora preparada. Deixe o gel durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave no dia seguinte. Lave o gel com 100 mililitros da solução de lavagem preparada por 10 a 20 minutos à temperatura ambiente com agitação suave, repetindo a lavagem uma segunda vez com solução de lavagem fresca.

Em seguida, oxide os carboidratos incubando o gel com agitação suave por 30 minutos em 25 mililitros da solução oxidante preparada, seguindo a incubação com duas lavagens adicionais enquanto o gel estiver sendo lavado. Prepare a coloração ProQ Emerald 300 fresca adicionando 500 microlitros da solução do reagente ProQ Emerald 300 a 25 mililitros do tampão de coloração fornecido no kit. Colore o gel incubando-o na coloração preparada em condições escuras com agitação suave por 90 a 120 minutos após a coloração do gel.

Repita os dois passos de lavagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, registre as imagens com um transiluminador UV a 300 nanômetros. Como etapa final, compare as imagens do gel corado com kumasi com as do gel corado com ProQ emerald.

As alterações na migração proteica após a desglicosilação enzimática podem ser observadas ao comparar a amostra controle com o tratamento F da PGA. Para remover os glicanos N e com o tratamento com mistura de desglicosilação para remover os glicanos N e O, nenhuma redução adicional no tamanho é observada após a digestão com glicosidase adicional. Além da mudança na massa, as bandas tornam-se mais nítidas à medida que os glicanos são removidos.

Uma faixa que se desloca abaixo do marcador de 17 quilodaltons provavelmente representa o polipeptídeo beta da HCG completamente desglicosilado. As pistas cinco a sete mostram as faixas correspondentes à glico. Outras faixas podem derivar de desglicosilação incompleta ou de múltiplas proteínas não identificadas presentes na amostra do beta da HCG.

O reagente verde esmeralda oxida e cora todos os glicanos presentes em uma molécula proteica. Portanto, a intensidade do sinal diminui à medida que a beta-HCG é desglicosilada enzimaticamente. O sinal residual nas pistas três e quatro indica a presença de motivos de glicanos resistentes às enzimas utilizadas.

O glicosídeo adicional é utilizado na faixa quatro. Remova alguns resíduos de açúcar extras. A migração da proteína é a mesma, mas pode-se observar uma ligeira redução na intensidade da coloração.

Moiras de açúcar resistentes não estavam presentes em todas as espécies proteicas. Algumas bandas não foram detectadas pela Emerald Green, indicando que foram extensivamente desglicosiladas. Dados adicionais apoiam a conclusão de que o HCG beta é heterogeneamente glicosilado. A banda inferior na trilha dois é fraca na imagem Emerald Green.

Embora a faixa superior na pista dois seja brilhante, indicando que muitos grupos GLYCAN ainda estão presentes, esses dados apoiam a conclusão de que a HCG beta recombinante expressa em células de camundongo contém múltiplas formas glicossiladas devido à heterogeneidade inerente da glicosilação. Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como: qual é a taxa de ocupação? Qual é o grau de glicosilação ou qual é a estrutura fina dos glicanos?

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a glicosilação para a desglicosilação enzimática e análise de glicanos ligados por NNO em glicoproteínas. A escolha da detecção pode ser difícil porque as regiões de coloração proteica são úteis apenas se a desglicosilação resultar em uma mudança significativa na massa molecular de outras proteínas.

Observamos migrações anormais após a desglicosilação e descobrimos que qualquer alteração na migração é evidência de que a proteína foi desglicosilada.