Name: Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a usar glicosidases para desglicosilação enzimática de glicoproteínas, analisando padrões de glicosilação N e O ligada em HCG beta por SDS-PAGE e coloração específica. Este método simples auxilia pesquisadores iniciantes em glicobiologia.

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<html> 1. Deglycosylation enzimática <ol><li> Use tubos de PCR para minimizar a perda de água devido à evaporação. Um conjunto de etiquetas de tubos de 1-7. </li><li> Descongele o buffer 10X G7, o buffer de glicoproteína 10X de desnaturação, e os 10% NP-40 e bata suavemente os tubos para misturar o conteúdo. Mantenha em temperatura ambiente. </li><li> Coloque os frascos contendo enzima no gelo. Tentar minimizar descongelar / congelar ciclos. </li><li> Dissolva o conteúdo do frasco hCGβ (150 mg) em 600 mL de dH 2 O e manter em gelo. </li><li> Prepare 1 ml de 1X tampão G7 diluindo o estoque de 10X em dH 2 O. </li><li> Diluir 0,5 mL de PNGase F em 25 mL tampão 1X G7 e manter em gelo. </li><li> Prepare a mistura exoglycosidase (mix EG), combinando cada 2 l de α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, β1-3 Galactosidase e α1-3, 6 Galactosidase. </li><li> Configurar tubos PCR, conforme indicado: </li></ol>ak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo / amostra # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glicoproteína 10X Tampão de desnaturação </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Tapar os tubos, misture delicadamente e coloque notermociclador, feche a tampa e desnaturar as proteínas de incubação de 10 minutos a 94 ° C, seguido de um 4 segure C ° (usando tubos de PCR em um termociclador muito evita a evaporação em amostras de pequeno volume). </li><li> Remover os tubos de termociclador e centrífuga para remover qualquer condensação visível. </li><li> Adicionar os seguintes reagentes conforme indicado: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Amostra # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Tampão G7 10X </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 01:50 dil. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Mix Deglycosylation </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> Mix EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Vol reação total. </td><td> 25 l μ </td><td> 25 l μ </td><td> 25 l μ </td><td> 25 l μ &lt;/ Td&gt; <td> 25 l μ </td><td> 25 l μ </td><td> 25 l μ </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Fechar os tubos PCR usando novas tampas (descartar os usados ​​desde que não se encaixam corretamente após um ciclo de incubação). </li><li> Misture os tubos batendo quatro vezes e depois girar o conteúdo para baixo. </li><li> Coloque os tubos no termociclador e incubar a 37 ° C por 4 horas depois esfriar as amostras a 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE de amostras deglycosylated <ol><li> Prepare 130 mL de tampão de carregamento fresco 3X reduzindo SDS, adicionando 4 mL de DTT 1.25m. </li><li> Adicionar 12,5 l do tampão de carregamento preparado 3X reduzindo SDS para cada amostra. </li><li> Fechar os tubos com tampas novas e bata suavemente os tubos para misturar. </li><li> Incubar os tubos em um termociclador a 94 ° C por 5 minutos e depois arrefecer a 4 ° C. </li><li> Carga de 30 mL de cada amostra e 10 ml do marcador da proteína em um gel de 10-20% Tris-Glicina. Salvar o restante da amostra para a parte 3.1. 10μl de carga de proteína marcadora ColorPlus Prestained. </li><li> Electroforese do gel em 130 volts à temperatura ambiente até que a frente corante é perto da parte inferior do gel. </li><li> Quando o gel terminar a execução, remover o gel do elenco e colocá-lo em uma pequena caixa de plástico com bastante Coomasie mancha azul para cobrir o gel. </li><li> Manchar o gel por 1 hora com agitação suave. </li><li> Lave o gel três vezes durante 30 minutos em 50 ml de solução destain. </li><li> Gravar as imagens usando um transiluminador de luz branca ou scanner. Alternativamente, o gel pode ser secado entre folhas de papel celofane em um frame. </li></ol> 3. Pro-Q Emerald 300 para detecção de proteínas glicosiladas em géis SDS-PAGE <ol><li> Em paralelo com o gel em 2.1), coloque o restante das amostras em um gel de 10-20% Tris-Glicina. Carga 10 e mu; L da proteína marcadora ColorPlus Prestained. </li><li> Enquanto o gel está sendo executado dissolver o Pro-Q reagente Emerald com DMF e preparar o estoque Fix Wash, e oxidantes soluções para o Emerald Pro-Q 300 mancha seguindo o manual do produto fornecido com o kit. </li><li> Quando a eletroforese é concluída, remova o gel de elenco e colocá-lo em uma caixa de plástico. </li><li> Corrigir o gel pela adição de 100 ml da solução de Fix e deixá-lo durante a noite a temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Lavar o gel com 100 ml da solução de lavagem para 10 a 20 minutos em temperatura ambiente com agitação gentios. Repetir a lavagem com solução de lavagem fresca. </li><li> Oxidar os carboidratos, incubando o gel com agitação suave por 30 minutos em 25 ml de solução oxidante. </li><li> Lave o gel como descrito no passo 3.5. </li><li> Enquanto que o gel é lavar preparar fresco Pro-Q Emerald 300 mancha por adição de 500 mL do Pro-Q solução reagente Emerald 300 dissolvido na etapa 3,2-25 ml decoloração buffer fornecido no kit. </li><li> Mancha do gel pela adição de 25 ml da mancha preparada no passo 3.8 e incubar no escuro com agitação suave durante 90 a 120 minutos. </li><li> Repita as duas etapas de lavagem descrito no passo 3.5. </li><li> Gravar as imagens com um transiluminador UV, a 300nm. Use o marcador kDa 80, que é marcado com verde esmeralda Pro-Q, para sobrepor a imagem UV para uma imagem de luz branca do gel mostrando a escada prestained. </li><li> Compare as imagens do gel Coomasie manchada no passo 2,10 com o gel Emerald Pro-Q manchada a partir do passo 3.11. </li></ol> 4. Resultados representativos As mudanças na migração de proteína após deglycosylation enzimática são mostrados na Figura 2. Compare a amostra controle (painel A, faixa 1) com o tratamento F PNGase (remoção de N-glicanos, pista 2), e Mix Deglycosylation (PNGase F; além de endo e exoglycosidases para remover O-glicanas, pista 3). Sem reduçãoem tamanho é visto depois de digerir com glicosidases adicional (faixa 4). Além de uma mudança em massa, tornam-se mais nítidas bandas como glicanos são removidos. A banda rodando sob o marcador kDa 17 (asterisco) representa o (MW: 16 kDa) totalmente deglycosylated hCGβ polipeptídeo. Outras bandas poderiam derivar de deglycosylation incompleta ou das proteínas não-identificados vários presentes na amostra hCGβ (veja pista 1). Lanes 5-7 (controles) mostram as bandas correspondentes às glicosidases. A coloração da glicoproteína pelo verde esmeralda é mostrado no painel B. Este reagente oxida e manchas todos os glicanos presentes em uma molécula de proteína. Portanto, a intensidade do sinal diminui à medida que hCGβ é enzimaticamente deglycosylated (pista 1 a pista 4). O sinal residual em faixas 3 e 4 indicam a presença de motivos glicano, que são resistentes às enzimas utilizadas. O glicosidases adicional utilizado na pista quatro remover alguns resíduos de açúcar extra: a migração de proteínas é a mesma, masuma ligeira redução na intensidade de coloração pode ser visto. Metades açúcar resistentes não estavam presentes em todas as espécies de proteína: algumas bandas não foram detectados pelo verde esmeralda (ausente na imagem UV, entre parênteses), indicando que eles foram extensivamente deglycosylated. Dados adicionais de suporte à conclusão de que é heterogeneamente hCGβ glicosilada. A banda inferior na pista 2 (seta) é fraco na imagem verde esmeralda, enquanto a faixa superior na pista 2 é brilhante, indicando que muitos grupos glicanos ainda estão presentes. Esses dados dão suporte à conclusão de que hCGβ recombinante expresso em células de camundongo contém múltiplas glycoforms 9. Estes glycoforms diferentes são devido à heterogeneidade inerente de glicosilação, onde alguns polipeptídeos não receber um glicano em cada local consenso e / ou algum glicanos são estendidos, enquanto outros ainda sobre a mesma proteína não são. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Figura 1.Padrões típicos de glicosilação para secretada ou glicoproteínas da superfície celular. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> Figura 2. Géis SDS-PAGE mostrando deglycosylation enzimática de hCGβ. Um painel mostra uma coloração azul, enquanto Coomasie Painel B mostra os resultados do Pro-Q Emerald 300 para a visualização de proteínas glicosiladas. Número da amostra: 1, controle hCGβ; 2, PNGase F digestão; 3, digestão Mix Deglycosylation; 4, Mix Deglycosylation mais exoglycosidases digestão, as amostras de 5-7 são os controles de reagentes (O-Glyc, ó glicosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; fucosidase Gal / FUC, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase e α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, Neuraminidase; PNGase; F PNGase)

<ol><li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation%3A+nature%2C+distribution%2C+enzymatic+formation%2C+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li>
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<li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li>
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</ol>

Os autores são empregados por New England Biolabs, que produz muitos dos reagentes utilizados neste artigo.

O método descrito aqui, usando deglycosylation enzimática e SDS-PAGE pode fornecer informações valiosas sobre o estado de glicosilação de uma proteína de interesse, enquanto glicano-reagentes específicos facilitar a interpretação dos dados. Este protocolo destina-se para os estudos iniciais da glicosilação de proteínas e é particularmente adequada para secretoras e glicoproteínas da membrana de células de mamíferos: as enzimas escolhido, neste caso, especificamente remover todas as N-glicanos, e ou N-glicanos mais e os açúcares mais comuns ampliar e formar o núcleo de O-glicanas. Glicosidases têm a vantagem adicional de ser leve, em comparação com métodos químicos deglycosylation, preservando a integridade de ambos os açúcares e proteínas backbone. Para elucidar a taxa de ocupação (que aminoácidos são glicosilada), extensão de glicosilação, ou para determinar a estrutura fina de glicanos, técnicas mais sofisticadas, como mespectrometria de bunda, cromatografia líquida ou RMN são obrigatórios. Devido à sua simplicidade, vários passos neste protocolo pode ser ajustado, substituídos e / ou combinados para acomodar várias necessidades experimental. No entanto, a fim de obter resultados que podem ser claramente interpretado é importante para entender seus pontos fortes e limitações. Primeiro, a especificidade e pureza do glicosidases são cruciais: apenas enzimas bem caracterizados testado para ser livre de proteases e outras atividades de contaminação devem ser usados. Infelizmente, não há uma definição unidade padrão enzimático para glicosidases, o usuário deve determinar a substituição apropriada de acordo com as especificações do fabricante. Segundo, uma escolha cuidadosa de detecção é necessário: a) reagentes de coloração de proteínas são úteis somente se os resultados deglycosylation em uma mudança significativa na massa molecular. Um resultado tão claro como mostrado aqui nem sempre é obtida. Em outros casos, vimos mi anormalgração após deglycosylation (longe do peso previsto molecular, ou a migração ainda mais lento). Este fenômeno não é bem compreendida, mas pode-se dizer que qualquer alteração na migração evidências de que a proteína tem sido deglycosylated. B) detecção de anticorpos com Açúcar apresenta desafios únicos limitando a sua aplicabilidade. Tem sido muito difícil gerar geral anti-glicano anticorpos, que são geralmente levantadas contra um alvo glicano complexo, o que restringe seu uso. Além disso, vários monoclonal anti-glicano anticorpos exibir reatividade cruzada indesejada 10. C) As lectinas (proteínas com afinidade intrínseca de açúcar) são adequados para a detecção de açúcar, mais eles dão uma visão sobre a estrutura de glicano. No entanto, nem todos eles têm uma especificidade estreita, e muitos são apenas parcialmente caracterizada (o que significa que eles poderiam ter afinidades desconhecido). Como conseqüência coloração lectina positivo fornece uma indicação, não uma prova da presença de um soldadoven açúcar. d) kits rotulagem química (com base na oxidação periodato de açúcares) são o método de escolha para manchar todas as glicoproteínas, e, portanto, bem adequado a seguir deglycosylation. Ao processar uma amostra desconhecida, é uma boa prática para incluir controles glicoproteína. Fetuína é um N prontamente disponível - e O-glicoproteína, gonadotrofina coriônica (ambas subunidades) também é uma boa escolha. Albumina de soro bovino (BSA) pode ser usado como controle negativo. No entanto, deve notar-se que algumas proteínas não-glicosiladas reagir um pouco com o Emerald Pro-Q 300, especialmente quando usado em altas concentrações. Não-glicosilada padrões de peso molecular, tais como o marcador de proteína prestained utilizado neste protocolo, têm a vantagem de exibir faixas afiadas. Só por acaso é uma dessas proteínas (80 kDa) reativa para pró-Q Emerald 300. Portanto, o usuário pode querer executar uma escada padrão glicoproteína vez, como Candy Cane-de Invitrogen. Finalmente, detecção em gel simples de glicoproteínas nucleocytosolic (que são modificados com um único O-GlcNAc) é possível com o uso de um anticorpo monoclonal, junto β-N-Acetylglucosaminidase para o controle de especificidade 11. A descrição desta técnica está além do escopo deste artigo, mas deve ser mencionado como glicosidases são ferramentas úteis para o estudo de muitas outras glicoproteínas e glicoconjugados presentes nas células. Um tratamento abrangente de todas as formas conhecidas de glicosilação pode ser encontrado na segunda edição do &quot;Essentials of Glycobiology&quot;; on-line gratuito, disponível no NCBI Bookshelf (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Β gonadotrofina coriônica humana </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Tubes </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Termociclador </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> P0704 </td><td> Fornecido com buffers </td></tr><tr><td> Mix Deglycosylation proteína </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Fornecido com buffers </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Fornecido com tampão </td></tr><tr><td> α1-2 fucosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Fornecido com tampão </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Fornecido com tampão </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Fornecido com tampão </td></tr><tr><td> Tampão 10X G7 (fosfato de sódio 500 mM) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Fornecido com PNGaseF ou Mix Degl </td></tr><tr><td> Tampão de desnaturação Glicoproteína 10X (5% SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Fornecido com PNGaseF ou Mix Degl </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Fornecido com PNGaseF ou Mix Degl </td></tr><tr><td> 3X SDS loading buffer (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, SDS a 6%, glicerol 30%, brom 0,03%azul ophenol) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> Fornecido com 1.25m TDT </td></tr><tr><td> ColorPlus Prestained marcador Protein </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glicina Multigel </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Eletroforese cassete </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Eletroforese EPS Fonte de alimentação 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald Kit Glicoproteína 300 Stain </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP Sistema </td><td> Célula de Biociências </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glicosilação, adição de açúcares ligados covalentemente, é uma modificação pós-translacional de proteínas importantes que podem afetar significativamente processos como adesão celular, o tráfico molecular, depuração e transdução de sinal 1-4. Em eucariotos, as modificações mais comuns de glicosilação na via de excreção são adições em consenso resíduos asparagina (N-linked), ou em serina ou resíduos de treonina (O-linked) (Figura 1). Início do N-glicano síntese é altamente conservada em eucariotos, enquanto o produto final pode variar muito entre diferentes espécies, tecidos ou proteínas. Alguns glicanos não haverá alterações (&quot;alta manose N-glicanos&quot;) ou são tratados posteriormente no Golgi (&quot;complexo N-glicanos&quot;). Uma maior diversidade é encontrada para O-glicanas, que começam com um comum N-acetilgalactosamina resíduos (GalNAc) em células animais, mas diferem em organismos inferiores 1. ent &quot;&gt; A análise detalhada da glicosilação de proteínas é um campo em si mesmo e exige muitos recursos e expertise para executar corretamente. No entanto uma variedade de enzimas que removem disponíveis açúcares (glicosidases) torna possível ter uma idéia geral do estado de glicosilação . uma proteína em uma configuração padrão de laboratório Aqui ilustramos o uso de glicosidases para a análise de uma glicoproteína modelo. recombinante gonadotrofina coriônica humana beta (hCGβ), que carrega dois N-glicanos e quatro O-glicanas 5 A técnica requer apenas simples instrumentação e consumíveis típica, e pode ser facilmente adaptado para a análise de amostras glicoproteína múltiplas. Várias enzimas pode ser usado em paralelo para estudar uma glicoproteína. PNGase F é capaz de remover quase todos os tipos de N-glicanos ligados 6,7. Para O-glicanas, não há enzima disponíveis que podem decompor um oligossacarídeo intacto de thbackbone e proteína. Em vez disso, O-glicanas são aparados por exoglycosidases a um núcleo pequeno, que depois é facilmente removido por O glicosidase. O Mix Deglycosylation Protein contém PNGase F, O glicosidase, Neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase e β-N-Acetylglucosaminidase. Ele é usado para remover simultaneamente N-glicanos e alguns glicanos O-8. Finalmente, o Mix Deglycosylation foi suplementada com uma mistura de exoglycosidases outros (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase e β1-3 Galactosidase), que ajudam a remover monossacarídeos de outra forma resistente, que podem estar presentes em alguns O-glicanas. SDS-PAGE/Coomasie azul é usado para visualizar diferenças na migração de proteína antes e após o tratamento glicosidase. Além disso, um açúcar específico método de coloração, ProQ Emerald-300, mostra o sinal diminuído como glicanos são successively removido. Este protocolo é projetado para a análise de pequenas quantidades de glicoproteína (0,5 a 2 mg), embora deglycosylation enzimática podem ser ampliados para acomodar grandes quantidades de proteína, conforme necessário.

Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

A glicosilação, a adição de açúcares ligados covalentemente, é uma modificação pós-traducional importante de proteínas que pode afetar significativamente processos...

O objetivo geral do experimento a seguir é ilustrar o uso da glicosidase para a desglicosilação enzimática e análise da glicosilação N e O ligada em uma glicoproteína modelo. Isso é alcançado tratando uma glicoproteína com PGA's F ou com a mistura de desglicosilação proteica. Além disso, a mistura de desglicosilação proteica foi suplementada com uma mistura de exoglicosidases adicionais, que às vezes ajudam a remover açúcares resistentes.Ilustramos este método utilizando uma proteína recombinante modelo, a gonadotrofina coriônica humana beta glicoproteica, ou HCG beta, seguida de SDS-PAGE, coloração com Kumasi blue e um método de coloração específica para açúcares. São utilizados Pro Q Emerald 300 para analisar a glicosilação D. São obtidos resultados da amostra de HCG beta, que mostram que a HCG beta é heterogeneamente glicosilada e contém múltiplas glicoformas, com base nas diferenças na migração proteica com e sem tratamento glicosídico e no sinal diminuído na coloração ProQ à medida que os glicanos são sucessivamente removidos.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise por espectrometria de massas, é que ela é simples, utiliza equipamentos de laboratório comuns e é adequada para o pesquisador novato em glicobiologia. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da glicobiologia, como se minha proteína está glicosilada. Para iniciar a desglicosilação enzimática, descongele os tampões fornecidos no kit de desglicosilação proteica.Misture bem os tubos e mantenha-os em temperatura ambiente. Coloque os frascos contendo a enzima sobre gelo, dissolva o conteúdo do frasco de beta-HCG em 600 microlitros de água destilada e mantenha sobre gelo. Após preparar um mililitro de tampão 1 XG sete diluindo o estoque 10 x em água destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.Prepare a mistura de glicosídeo exo combinando dois microlitros de cada um dos quatro glicosídeos exo. Em seguida, adicione beta-HCG e tampão desnaturante de glicoproteína 10x a sete tubos PCR numerados conforme indicado no protocolo escrito, tampe os tubos e misture suavemente. Desnature as proteínas no termociclador incubando por 10 minutos a 94 graus Celsius, seguido por uma pausa a quatro graus Celsius. Após remover os tubos do termociclador, centrifugue para eliminar qualquer condensação visível. A cada tubo de reação, adicione os reagentes restantes conforme o protocolo escrito. Feche os tubos PCR usando tampas novas.Em seguida, misture os tubos batendo suavemente quatro vezes após centrifugar os conteúdos, coloque os tubos no termociclador e incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Prossiga resfriando as amostras a quatro graus Celsius. Para preparar o gel de SDS-PAGE, prepare um tampão de carga SDS redutor a 3 x fresco.Com DTT, adicione 12,5 microlitros do tampão de carga SDS redutor preparado três vezes a cada amostra, feche os tubos com tampas novas e agite suavemente os tubos para homogeneizar. Incube os tubos em um termociclador a 94 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie a quatro graus Celsius. Após a incubação, carregue 30 microlitros de cada amostra e 10 microlitros do marcador de proteína em um gel tri-glicina 10 a 20%. Guarde o restante de cada amostra.Eletroforese o gel a 130 volts até que a frente de D esteja próxima à base do gel. Quando a eletroforese terminar, remova o gel do molde e coloque-o em uma caixa plástica pequena com quantidade suficiente de corante azul de kumasi para cobrir o gel. Incube o gel por uma hora com agitação suave após a coloração do gel.Lave três vezes durante 30 minutos. Em 50 mililitros de solução de retenção, registre as imagens utilizando um transiluminador de luz branca ou um scanner. Alternativamente, o gel pode ser seco entre folhas de celofane.Em uma cuba, execute o restante de cada amostra e um marcador proteico em um gel de Tri glicina de 10 a 20% enquanto o gel estiver em funcionamento. Dissolva o reagente ProQ Emerald em DMF e prepare as soluções estoque de fixação, lavagem e oxidação para a coloração, seguindo o manual do produto fornecido com o kit. Quando a eletroforese estiver concluída, remova o gel da placa e coloque-o em uma caixa de plástico.Fixe o gel adicionando 100 mililitros da solução fixadora preparada. Deixe o gel durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave no dia seguinte. Lave o gel com 100 mililitros da solução de lavagem preparada por 10 a 20 minutos à temperatura ambiente com agitação suave, repetindo a lavagem uma segunda vez com solução de lavagem fresca.Em seguida, oxide os carboidratos incubando o gel com agitação suave por 30 minutos em 25 mililitros da solução oxidante preparada, seguindo a incubação com duas lavagens adicionais enquanto o gel estiver sendo lavado. Prepare a coloração ProQ Emerald 300 fresca adicionando 500 microlitros da solução do reagente ProQ Emerald 300 a 25 mililitros do tampão de coloração fornecido no kit. Colore o gel incubando-o na coloração preparada em condições escuras com agitação suave por 90 a 120 minutos após a coloração do gel.Repita os dois passos de lavagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, registre as imagens com um transiluminador UV a 300 nanômetros. Como etapa final, compare as imagens do gel corado com kumasi ao gel corado com ProQ emerald.As alterações na migração proteica após a desglicosilação enzimática podem ser observadas ao comparar a amostra controle com o tratamento F da PGA. Para remover os glicanos N e com o tratamento com mistura de desglicosilação para remover glicanos N e O, nenhuma redução adicional no tamanho é observada após a digestão com glicosidase adicional. Além da mudança na massa, as bandas tornam-se mais nítidas à medida que os glicanos são removidos.Uma faixa que se desloca abaixo do marcador de 17 quilodaltons provavelmente representa o polipeptídeo beta da HCG completamente desglicosilado. As pistas cinco a sete mostram as faixas correspondentes à glico. Outras faixas podem derivar de desglicosilação incompleta ou de múltiplas proteínas não identificadas presentes na amostra do beta da HCG.O reagente verde esmeralda oxida e cora todos os glicanos presentes em uma molécula proteica. Portanto, a intensidade do sinal diminui à medida que a beta-HCG é desglicosilada enzimaticamente. O sinal residual nas pistas três e quatro indica a presença de motivos de glicanos resistentes às enzimas utilizadas.O glicosídeo adicional é utilizado na faixa quatro. Remova alguns resíduos de açúcar extras. A migração da proteína é a mesma, mas pode-se observar uma ligeira redução na intensidade da coloração.Moietyres de açúcar resistentes não estavam presentes em todas as espécies proteicas. Algumas bandas não foram detectadas pela Emerald Green, indicando que foram extensivamente desglicosiladas. Dados adicionais apoiam a conclusão de que o HCG beta é heterogeneamente glicosilado. A banda inferior na trilha dois é fraca na imagem Emerald Green.Embora a faixa superior na pista dois seja brilhante, indicando que muitos grupos GLYCAN ainda estão presentes, esses dados apoiam a conclusão de que a HCG beta recombinante expressa em células de camundongo contém múltiplas formas glicossiladas devido à heterogeneidade inerente da glicosilação. Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como: qual é a taxa de ocupação? Qual é o grau de glicosilação, ou qual é a estrutura fina dos glicanos?Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a glicosilação para a desglicosilação enzimática e análise de glicanos ligados a NNO em glicoproteínas. A escolha da detecção pode ser difícil porque as regiões de coloração proteica são úteis apenas se a desglicosilação resultar em uma mudança significativa na massa molecular de outras proteínas.Observamos migrações anormais após a desglicosilação e descobrimos que qualquer alteração na migração é evidência de que a proteína foi desglicosilada.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

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Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

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Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

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A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao Acinetobacter baumannii O

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Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

Aprenda a usar glicosidases para desglicosilação enzimática de glicoproteínas, analisando padrões de glicosilação N e O ligada em HCG beta por SDS-PAGE e coloração específica. Este método simples auxilia pesquisadores iniciantes em glicobiologia.

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