Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

A pesquisa genética se beneficiou muito com a liberação da sequência do genoma humano. O sequenciamento pirotécnico é um sistema único que permite a análise da variação genética, bem como do desequilíbrio alélico do RNA, DNA, status de metilação e número de cópias do gene. Neste vídeo, demonstramos uma reação básica de pirosequenciamento para análise genética.

Olá, sou Kristy King, do laboratório do Dr. Charles Eby e do Dr. Brian Gage no Departamento de Medicina Interna da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Hoje vamos mostrar um procedimento para o sequenciamento pirotécnico. Este procedimento é útil porque é um dos métodos mais completos e simples usados para analisar SNPs.

O pirosequenciamento é baseado no sequenciamento por síntese, aproveitando a liberação de pirofosfato sempre que um nucleotídeo é incorporado em uma fita aberta de três primos de DNA. Uma vez que uma placa é carregada, os nucleotídeos são incorporados com base em uma sequência fornecida pelo software Uma vez liberado, o pirofosfato é usado em uma reação que resulta na liberação de um TP, que é usado pela luciferase para converter Lúcifer em oxi Lúcifer, resultando na emissão de luz. A luz admitida é coletada por uma câmera CCD e registrada como picos, também conhecidos como pirotecnia.

Quaisquer nucleotídeos não incorporados à fita de DNA são degradados pela pira AP para evitar ruído de fundo. Este procedimento envolve as seguintes etapas. Projeto de ensaio, eletroforese em gel PCR para controle de qualidade e pirosequenciamento.

Então, vamos começar com o sequenciamento pirotécnico. Para realizar o sequenciamento pirotécnico, um produto de PCR deve primeiro ser preparado. A PCR para pirosequenciamento requer mais ciclos do que a maioria das PCRs para garantir que todo o primer seja usado em cerca de 50 ciclos.

O sequenciamento pirotécnico também requer que um dos primers de PCR seja biotinilado. Por fim, é importante observar que também é necessário um primer interno. O projeto de ensaio eficiente pode ser realizado com software fornecido por meio de pirosequenciamento para garantir que a contaminação não esteja presente.

E para confirmar a presença do produto de PCR, um gel deve ser executado em algumas amostras, bem como um controle negativo. Para fazer a placa de sequenciamento piro, adicione 12 microlitros da mistura de primer de sequenciamento piro à placa de sequenciamento pirotécnico de 96 poços. Isso requer uma mistura de 43,2 microlitros do primer interno, juntamente com 1396,8 microlitros de um tampão ajoelhado para cobrir a placa de pirosequenciamento com filme adesivo.

Se a configuração levar mais de 50 minutos para cada poço do produto de PCR de 96 poços, adicione 70 microlitros de mistura de velocidade SRO que contém 240 microlitros de velocidades de soro revestidas com estreptavidina. 4, 560 microlitros de tampão de ligação, que é feito de cloreto de sódio triss, EDTA e tween 20 e 3, 600 microlitros de água e recoloque a tampa com segurança. Coloque a placa de produto PCR de 96 poços com a mistura de esferas em um agitador de placas por cinco minutos em temperatura ambiente.

Certifique-se de que a tampa esteja presa para evitar qualquer contaminação cruzada entre os poços. Esta etapa permitirá um ajoelhar completo do ENC estreptocócico, esferas de esferas revestidas até a etiqueta de biotina localizada no primer de PCR. Configure uma estação de trabalho para preparar as placas.

Isso inclui as calhas de reagentes, a bandeja de mistura de produtos e esferas de PCR e a bandeja de primer de pirosequenciamento. Certifique-se de que o produto PCR e a placa de mistura de esferas, bem como a bandeja de primer de pirosequenciamento, estejam alinhados corretamente para que os negativos fiquem na mesma orientação. Antes de transferir amostras, agite a ferramenta de vácuo, que está desligada em água limpa para liberar quaisquer contas ou detritos que possam estar nela.

Descarte a água restante, reabasteça o cocho e ligue o aspirador. Deixe a ferramenta de vácuo na calha até que toda a água tenha sido removida, o que é de aproximadamente 30 segundos. Coloque as pontas do filtro da ferramenta de vácuo nos poços da placa de mistura de esferas PCR e deixe-a permanecer até que todo o líquido tenha sido removido da placa.

Um balanço suave pode ser usado para evitar tensão superficial. Coloque o vácuo na calha de etanol a 70% quando o líquido começar a fluir através da tubulação. Deixe as pontas do filtro aspirarem o etanol por cinco segundos.

Repita para o hidróxido de sódio 0,2 molar, que desnatura o DNA para PCR de fita simples e para o tampão de lavagem. Para limpar e neutralizar o produto de PCR. Desconecte a mangueira de vácuo da ferramenta de vácuo e coloque a ferramenta de vácuo na placa de pirosequenciamento contendo o primer de pirosequenciamento em uma mistura tampão ajoelhada.

Se a mangueira de vácuo ainda estiver conectada, quando colocada na placa de sequenciamento piro, a mistura de primer será sugada. As dicas que fazem com que você perca seu produto de PCR. Agite suavemente ou balance as pontas do vácuo nos poços da placa de pirosequenciamento para dispersar seu produto de PCR.

Remova a ferramenta de vácuo da placa de sequenciamento pirotécnico assim que a agitação ou balanço estiver completo e reconecte a ferramenta de vácuo à mangueira e coloque a ferramenta na água limpa para limpá-la para a próxima placa. Coloque a placa de sequenciamento pirotécnico em um bloco de calor por dois minutos a 80 graus Celsius. Após dois minutos, retire a placa do bloco de calor e coloque sobre uma superfície fria.

Uma vez resfriado, o filme adesivo pode ser usado para cobrir a placa, a menos que a placa seja executada em 15 minutos para evitar a evaporação. E agora é hora de começar o sequenciamento pirotécnico. O primeiro passo do sequenciamento pirotécnico é inserir os detalhes do ensaio no computador.

Em entrada simplex, selecione a nova entrada e insira as informações do ensaio, incluindo um nome de ID e a sequência a ser analisada, que é fornecida pelo software de design de ensaio e permite a ordem de dispensação de seleção de controle de qualidade, que fornece a sequência em torno do SNP mais bases de controle. Por fim, selecione histogramas para fornecer um visual de como seu pigram deve ser. Agora é hora de entrar em uma execução de recorte.

Na guia snip runs e na guia geral, insira um nome de trecho e selecione os parâmetros do instrumento para o trecho. Na guia de configuração, selecione a entrada do ensaio e clique e arraste sobre a placa. Para inserir o ensaio de escolha em sua placa, é importante observar que a placa inteira não precisa ser usada, na qual você pode inativar diferentes poços para análise, assim como muitos ensaios diferentes podem ser executados na mesma placa.

Clique na guia de exibição e selecione. Correr. Esta página lista os volumes apropriados de nucleotídeos, enzimas e substratos necessários para a execução. Limpe as pontas do nucleótido ou capilar e do reagente antes de utilizar.

Encha as pontas com água e aplique pressão sobre a parte superior da ponta para verificar se há bloqueios nas pontas. Se a água não esguichar do fundo da ponta, esvazie e reabasteça várias vezes para tentar forçar a passagem da água. Ou você pode sonicar as pontas se a ponta permanecer bloqueada.

Descarte e obtenha novas dicas. A enzima e o substrato devem ser ressuspensos com água antes do uso. Se bolhas de ar agitadas puderem causar bloqueios na ponta ou dispensação inconsistente, a enzima e o substrato ressuspensos não utilizados podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius.

Para uso futuro para pontas de distribuição capilar em um tubo de microfuga, faça uma diluição de um para um com os nucleotídeos e o tampão P oito. Misture bem antes de usar. Encha as pontas de nucleotídeos e reagentes com os volumes apropriados de acordo com as quantidades sugeridas pelo software.

Dispense suavemente o líquido pelas laterais das pontas para evitar que as bolhas de ar sejam pipetadas e causem bloqueios. Certifique-se de verificar se há bolhas de ar nas pontas de distribuição de nucleotídeos. Se houver bolhas de ar, basta bater nas laterais das pontas até que as bolhas de ar surjam ou desalojá-las com uma ponta de pipeta limpa.

Execute uma placa de teste após encher o cartucho. Coloque o cartucho no instrumento de pirosequenciamento e a placa de teste na plataforma de placa de 96 poços. A colocação de um filme adesivo sobre a placa permite que a dispensação de reagentes e nucleotídeos seja facilmente vista.

Selecione a guia do instrumento no lado esquerdo da tela e clique em gerenciar. Selecione o instrumento no menu suspenso. Clique em testar e um aviso aparecerá.

Solicitando que você verifique se a placa de teste foi colocada no instrumento. Clique em OK. Depois de concluído, remova a placa de teste e no meio da placa devem haver pontos líquidos sobre seis dos poços representando quatro nucleotídeos, enzima e substrato.

Se houver menos de seis pontos pequenos, ocorreu um bloqueio e as pontas devem ser verificadas e removidas de quaisquer bloqueios. Coloque a placa na plataforma de placa de 96 poços de sequenciamento pirotécnico. Feche todas as alavancas e clique em executar na placa individual.

Execute a configuração do substrato enzimático e os nucleotídeos serão dispensados na ordem predeterminada. Uma vez que a corrida tenha sido analisada pelo sequenciador piro, é hora de examinar a corrida. Os poços azuis representam um genótipo e piro de passagem.

Os poços laranja exigem intervenção humana e podem ser editados clicando no poço de interesse e abrindo o histograma previsto. Um genótipo pode ser passado, reprovado ou verificado, bem como o próprio genótipo alterado adequadamente. Depois que um poço for editado, um círculo escuro será exibido no mapa da placa.

Os controles negativos devem ser classificados como negativos. Pode haver picos inespecíficos nos poços negativos, no entanto, normalmente é causado pelo loop do primer interno. Então, acabamos de mostrar como sequenciar um polimorfismo na genômica humana.

O sequenciamento DNA Pyro é útil em relação a outros procedimentos de sequenciamento porque é adaptável a uma ampla gama de aplicações. Também é robusto o suficiente para lidar com DNA de qualquer fonte, incluindo baixa concentração e DNA degradado. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de começar com um bom produto de PCR limpo.

Inclua um controle negativo para cada ensaio e certifique-se de que todos os seus reagentes estejam bons. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.