Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

A pesquisa em genética se beneficiou muito com a liberação da sequência do genoma humano. A pirosequenciação é um sistema exclusivo que permite a análise de variações genéticas, bem como desequilíbrio alélico de RNA, estado de metilação do DNA e número de cópias gênicas. Neste vídeo, demonstramos uma reação básica de pirosequenciação para análise genética.

Olá, sou Kristy King do laboratório do Dr. Charles Eby e da Dra. Brian Gage, do Departamento de Medicina Interna da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Hoje vamos mostrar um procedimento de pirosequenciamento. Esse procedimento é útil porque é um dos métodos mais completos e, ao mesmo tempo, simples para analisar SNPs.

O pirosequenciamento baseia-se no sequenciamento por síntese, aproveitando a liberação de pirofosfato sempre que um nucleotídeo é incorporado a uma fita de DNA com extremidade 3' livre. Após o carregamento de uma placa, os nucleotídeos são incorporados com base em uma sequência fornecida pelo software. Uma vez liberado, o pirofosfato é utilizado em uma reação que resulta na liberação de ATP, o qual é usado pela luciferase para converter luciferina em oxiluciferina, gerando a emissão de luz. A luz emitida é captada por uma câmera CCD e registrada como picos, também conhecidos como piros.

Quaisquer nucleotídeos não incorporados na fita de DNA são degradados pela AP pirase para evitar ruído de fundo. Este procedimento envolve as seguintes etapas: desenho do ensaio, eletroforese em gel de PCR para controle de qualidade e pirosequenciamento.

Então vamos começar com o sequenciamento por pirosequenciamento. Para realizar o pirosequenciamento, um produto de PCR deve primeiro ser preparado. A PCR para pirosequenciamento requer mais ciclos do que a maioria das PCR para garantir que todo o iniciador seja consumido, cerca de 50 ciclos.

A pirosequenciação também exige que um dos iniciadores de PCR seja biotinilado. Por fim, é importante observar que um iniciador interno também é necessário. O planejamento eficiente do ensaio pode ser realizado com software fornecido pela pirosequenciação para garantir que não haja contaminação.

E para confirmar a presença do produto de PCR, deve-se realizar uma eletroforese em gel com algumas amostras, bem como com um controle negativo. Para preparar a placa de pirosequenciamento, adicione 12 microlitros da mistura de iniciadores para pirosequenciamento à placa de pirosequenciamento de 96 poços. Isso requer uma mistura de 43,2 microlitros do iniciador interno, juntamente com 1396,8 microlitros de um tampão de cobertura; cubra a placa de pirosequenciamento com filme adesivo.

Se a preparação demorar mais de 50 minutos por poço da placa de PCR de 96 poços, adicione 70 microlitros da mistura SRO speed que contém 240 microlitros de sero speeds revestidos com estreptavidina. 4.560 microlitros de tampão de ligação, composto por cloreto de sódio triss, EDTA e tween 20, e 3.600 microlitros de água, e feche bem a tampa. Coloque a placa de PCR de 96 poços com a mistura de microesferas em um agitador de placas por cinco minutos à temperatura ambiente.

Certifique-se de que a tampa está bem fixada para evitar qualquer contaminação cruzada entre os poços. Este passo permitirá uma ligação completa da strep ENC, revestindo as esferas magnéticas, à marcação de biotina localizada no iniciador de PCR. Prepare uma estação de trabalho para o preparo das placas.

Isso inclui as bandejas de reagentes, a bandeja com a mistura de produto de PCR e perlas e a bandeja de iniciadores para pirosequenciamento. Certifique-se de que a placa com a mistura de produto de PCR e perlas, bem como a bandeja de iniciadores para pirosequenciamento, estejam devidamente alinhadas, de modo que os negativos tenham a mesma orientação. Antes de transferir as amostras, agite a ferramenta de vácuo, desligada, em água limpa para liberar quaisquer perlas ou resíduos que possam estar aderidos a ela.

Descarte a água restante, reabasteça o recipiente e ligue o vácuo. Deixe a ferramenta de vácuo no recipiente até que toda a água tenha sido removida, o que equivale a aproximadamente 30 segundos. Coloque as ponteiras do filtro da ferramenta de vácuo nos poços da placa com a mistura de perlas PCR e mantenha-a até que todo o líquido tenha sido removido da placa.

Pode-se usar uma agitação suave para evitar a tensão superficial. Coloque o vácuo na cuba com etanol 70% quando o líquido começar a fluir através da tubulação. Deixe as ponteiras filtrantes aspirarem o etanol por cinco segundos.

Repita para o hidróxido de sódio 0,2 molar, que desnatura o DNA em PCR de fita simples e para o tampão de lavagem. Para limpar e neutralizar o produto de PCR. Desconecte a mangueira de vácuo da ferramenta de vácuo e coloque a ferramenta de vácuo na placa de pirosequenciamento contendo o iniciador de pirosequenciamento em uma mistura tampão em posição de joelhos.

Se a mangueira de vácuo ainda estiver conectada, ao ser colocada na placa de pirosequenciamento, a mistura de iniciadores será sugada através das ponteiras, fazendo com que você perca seu produto de PCR. Agite ou balance suavemente as ponteiras do vácuo nos poços da placa de pirosequenciamento para dispersar seu produto de PCR.

Remova a ferramenta de vácuo da placa de pirosequenciamento após a conclusão da agitação ou movimento oscilante e reconecte a ferramenta de vácuo à mangueira, colocando-a em água limpa para limpeza antes do uso na próxima placa. Coloque a placa de pirosequenciamento em um bloco térmico por dois minutos a 80 graus Celsius. Após dois minutos, remova a placa do bloco térmico e coloque-a sobre uma superfície fria.

Uma vez resfriado, pode-se usar filme adesivo para cobrir a placa, a menos que a placa seja utilizada em até 15 minutos para prevenir evaporação. E agora é hora de iniciar a pirosequenciação. O primeiro passo da pirosequenciação é inserir os detalhes do ensaio no computador.

Em entrada simplex, selecione a nova entrada e insira as informações do ensaio, incluindo um nome de ID e a sequência a ser analisada, fornecida pelo software de design do ensaio e que permite o controle de qualidade; selecione a ordem de dispensação, que fornece a sequência ao redor do SNP mais as bases controle. Por fim, selecione histogramas para obter uma representação visual de como seu pirograma deve ficar. Agora é hora de iniciar uma execução de SNP.

Em "snip runs" e na guia geral, insira um nome para a execução e selecione os parâmetros do instrumento para a execução. Na guia configuração, selecione a entrada do ensaio e clique e arraste sobre a placa. Para inserir o ensaio desejado em sua placa, é importante observar que toda a placa não precisa ser utilizada, podendo-se inativar diferentes poços para análise, além de ser possível realizar diversos ensaios diferentes na mesma placa.

Clique na guia visualizar e depois selecione Executar. Esta página lista os volumes apropriados de nucleotídeos, enzima e substrato necessários para a execução. Limpe ambos, o nucleotídeo ou o capilar e as ponteiras de reagentes, antes do uso.

Encha as pontas com água e aplique pressão sobre a parte superior da ponta para verificar obstruções. Se a água não sair em jato pela extremidade inferior da ponta, esvazie e encha novamente várias vezes para tentar forçar a passagem da água. Alternativamente, você pode usar ultrassom nas pontas caso a obstrução persista.

Descarte e utilize novas ponteiras. A enzima e o substrato devem ser ressuspendidos com água antes do uso. Se houver agitação, podem surgir bolhas de ar, causando obstruções nas ponteiras ou dispensação inconsistente. A enzima e o substrato ressuspendidos não utilizados podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius.

Para uso futuro de ponteiras para dispensação capilar em um tubo microfúg, faça uma diluição um para um com os nucleotídeos e o tampão TE P oito. Misture bem antes do uso. Preencha as ponteiras de nucleotídeos e reagentes com os volumes apropriados de acordo com as quantidades sugeridas pelo software.

Dispense suavemente o líquido pelas laterais das ponteiras para evitar pipetar bolhas de ar e causar obstruções. Certifique-se de verificar a presença de bolhas de ar nas ponteiras de dispensação de nucleotídeos. Se houver bolhas de ar, basta tocar levemente nas laterais das ponteiras até que as bolhas subam à superfície ou removê-las com uma ponteira limpa.

Execute uma placa de teste após preencher a cartela. Coloque a cartela no instrumento de pirosequenciamento e a placa de teste na plataforma de placa de 96 poços. Colocar um filme adesivo sobre a placa permite que a dispensação de reagentes e nucleotídeos seja facilmente visualizada.

Selecione a aba do instrumento no lado esquerdo da tela, depois clique em gerenciar. Selecione o instrumento no menu suspenso. Clique em testar, e um aviso será exibido.

Solicitamos que verifique se a placa de teste foi colocada no instrumento. Clique em OK. Após a conclusão, remova a placa de teste e, no centro da placa, deverá haver gotas líquidas sobre seis dos poços, representando quatro nucleotídeos, enzima e substrato.

Se houver menos de seis pontos pequenos, ocorreu uma obstrução e as ponteiras devem ser verificadas e desobstruídas. Coloque a placa na plataforma de sequenciamento pirosequencial de 96 poços. Feche todas as alavancas e clique em executar na placa individual.

Execute a configuração: a enzima, o substrato e os nucleotídeos serão dispensados na ordem predeterminada. Após a análise do ensaio pelo pirosequenciador, é hora de examinar o resultado. Poços azuis representam um genótipo aprovado e um pirograma válido.

Os poços laranja exigem intervenção humana e podem ser editados clicando no poço de interesse e abrindo o histograma previsto. Um genótipo pode ser aprovado, reprovado ou verificado, além de o próprio genótipo poder ser alterado adequadamente. Após um poço ser editado, um círculo escuro aparecerá no mapa da placa.

Os controles negativos devem ser classificados como negativos. Pode haver picos inespecíficos nos poços negativos; no entanto, geralmente são causados por formação de laço do iniciador interno. Assim, acabamos de mostrar como sequenciar por pirosequenciamento um polimorfismo no genoma humano.

A pirosequenciação de DNA é útil em comparação com outros procedimentos de sequenciamento porque é adaptável a uma ampla gama de aplicações. Também é suficientemente robusta para processar DNA de qualquer origem, incluindo DNA com baixa concentração e DNA degradado. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de começar com um produto de PCR limpo e de boa qualidade.

Inclua um controle negativo para cada ensaio e certifique-se de que todos os seus reagentes estejam em boas condições. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.