Purificação de afinidade de complementação bimolecular para isolar duas proteínas em interação

Para detectar e isolar um par de proteínas de interação específicas usando purificação de afinidade de complementação bimolecular, adicione um par de plasmídeos de complementação de fluorescência bimolecular-mistura de agente de transfecção em uma placa de cultura contendo células de mamíferos.

Um plasmídeo codifica uma proteína de interação - a proteína isca - fundida a um fragmento de proteína fluorescente repórter. O outro plasmídeo codifica a outra proteína de ligação - a proteína da presa - fundida ao fragmento complementar da proteína fluorescente.

incubar. O agente de transfecção facilita a captação celular do plasmídeo. As células transfectadas com sucesso expressam proteínas localizadas na membrana celular.

As interações das proteínas isca-presa aproximam os fragmentos de proteína fluorescente. Isso faz com que os fragmentos se fundam e se dobrem novamente, formando a proteína fluorescente funcional, cuja fluorescência pode ser visualizada sob um microscópio de fluorescência.

Substitua o meio por um tampão de lise contendo detergente não iônico para romper as membranas celulares, liberando as proteínas de fusão. Colete o lisado celular em um tubo. Centrifuga.

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