Purificação de afinidade de complementação bimolecular para isolar duas proteínas em interação

Para detectar e isolar um par de proteínas de interação específicas usando purificação de afinidade de complementação bimolecular, adicione um par de plasmídeos de complementação de fluorescência bimolecular-mistura de agente de transfecção em uma placa de cultura contendo células de mamíferos.

Um plasmídeo codifica uma proteína de interação - a proteína isca - fundida a um fragmento de proteína fluorescente repórter. O outro plasmídeo codifica a outra proteína de ligação - a proteína da presa - fundida ao fragmento complementar da proteína fluorescente.

incubar. O agente de transfecção facilita a captação celular do plasmídeo. As células transfectadas com sucesso expressam proteínas localizadas na membrana celular.

As interações das proteínas isca-presa aproximam os fragmentos de proteína fluorescente. Isso faz com que os fragmentos se fundam e se dobrem novamente, formando a proteína fluorescente funcional, cuja fluorescência pode ser visualizada sob um microscópio de fluorescência.

Substitua o meio por um tampão de lise contendo detergente não iônico para romper as membranas celulares, liberando as proteínas de fusão. Colete o lisado celular em um tubo. Centrifuga.

Transfira o sobrenadante contendo proteína de fusão para um novo tubo. Adicione grânulos de agarose conjugados com o anticorpo de domínio único direcionado à proteína fluorescente, nanocorpo, que reconhece e se liga a um epítopo tridimensional na proteína fluorescente dobrada.

centrifuga. Ressuspenda as esferas de agarose ligadas à proteína de fusão no tampão. Aqueça para dissociar as proteínas de fusão das esferas de agarose. Realize SDS-PAGE para separar proteínas individuais, seguido de western blotting com anticorpos específicos para os fragmentos de proteína fluorescente.

Apenas proteínas interagentes marcadas com fragmentos fluorescentes são detectadas, confirmando seu isolamento.

Primeiro, semeie HEK293T células em placas de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM. Em seguida, dilua 2,5 microgramas de cada vetor de complementação de fluorescência bimolecular em 500 microlitros de tampão de transfecção.

Adicione 10 microlitros do reagente de transfecção e vortex a mistura por 10 segundos. Em seguida, centrifugue brevemente as amostras e incube-as em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione a mistura de transfecção de DNA gota a gota ao prato. Em seguida, incube as amostras por 8 a 24 horas.

Prepare o tampão de lise celular e o tampão de lise celular suplementado conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, lave as células com PBS gelado duas vezes. Aspire o PBS e adicione 1 mililitro de tampão de lise celular suplementado com gelo.

Em seguida, coloque o prato no gelo e incube por cinco minutos. Em seguida, use um raspador de células para remover as células e transferi-las para um tubo de microcentrífuga resfriado. Centrifugue o tubo a 18.000 vezes a gravidade por cinco minutos a 4 graus Celsius para remover os detritos celulares. Em seguida, transfira o sobrenadante transparente para um novo tubo de microcentrífuga.

Lave um volume apropriado de contas de agarose em 1 mililitro de PBS. Em seguida, centrifugue as esferas com gravidade de 300 vezes e remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, adicione 20 microlitros de grânulos de agarose a cada amostra e incube a 4 graus Celsius por duas horas com rotação de ponta a ponta.

Centrifugue os grânulos a 300 vezes a gravidade e lave-os em tampão de lise celular três vezes. Em seguida, ressuspenda as esferas lavadas em 50 microlitros de tampão de amostra diluído. Finalmente, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por dois a três minutos.