Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

O objetivo geral deste procedimento é realizar um ensaio de adesão em câmara de fluxo com placas paralelas utilizando um sistema de divisão de emissão com duas câmeras para registrar simultaneamente sequências de imagens em tempo real em duas cores. Para isso, as duas câmeras do sistema de imageamento são primeiramente alinhadas. Em seguida, as células e o substrato reativo são preparados e a câmara de fluxo com placas paralelas é montada.

As configurações da câmera são então calibradas para a aquisição de imagens em duas cores, e quaisquer correções digitais necessárias são feitas no alinhamento da câmera. Em seguida, são capturadas sequências de imagens, demonstrando a aquisição de imagens em dupla cor com alta resolução temporal. A vantagem dos sistemas de divisão de emissão com duas câmeras em relação aos sistemas com uma única câmera é que diferentes tempos de exposição podem ser atribuídos a cada câmera e todo o campo de visão é mantido.

Essa técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da adesão celular, como a forma pela qual a localização de moléculas de adesão na superfície das células pode afetar processos biológicos dinâmicos, tais como migração celular, inflamação e metástase do câncer. O procedimento a seguir exige um microscópio invertido de fluorescência de epifluorescência. Este deve ser equipado com uma fonte de luz de alta intensidade acoplada a um guia de luz, um cubo de filtro combinado e um sistema de câmera dupla com divisão de emissão.

A configuração do microscópio deve ser conectada a um computador com software de imagem capaz de coletar e combinar imagens capturadas por câmeras CCD monocromáticas. Aqui, o software StreamPix 5 é usado com o módulo SimulPix. Comece abrindo o StreamPix 5 na faixa de tarefas e selecione o espaço de trabalho.

Em seguida, no extremo direito da tela, abra o gerenciador de workspace e selecione um novo workspace. Após nomear a câmera, siga as instruções do software para selecionar, em uma lista pré-definida, um grabber compatível com o modelo da câmera; um pequeno ícone de câmera aparecerá no workspace para indicar que o sinal da câmera está sendo recebido. Os objetos imageados com o microscópio podem agora ser visualizados na tela.

Repita este processo para o segundo espaço de trabalho da câmera, depois para o espaço de trabalho mesclado, repita mais uma vez e todas as câmeras estarão em uso. Uma mensagem de erro aparecerá. Esta mensagem é normal, atribuindo câmeras do espaço de trabalho um e dois ao espaço de trabalho mesclado no painel de encaixe localizado no lado direito da tela de visualização.

As imagens no espaço de trabalho um e dois serão sobrepostas no espaço de trabalho mesclado como duas imagens pseudocoloridas. O aspecto mais difícil deste procedimento é o alinhamento da câmera. Para garantir o sucesso, utilizamos a lâmina do fabricante, seguindo meticulosamente as instruções do fabricante.

Para alinhar as câmeras no sistema de divisão de emissão com câmeras duplas, envie luz de contraste de fase ou campo claro para a ocular do microscópio. Coloque a grade metálica de calibração fornecida pelo fabricante sobre a platina do microscópio e alinhe a grade na platina do microscópio. Exiba a grade sem binning e sem redimensionamento automático, foque-a e, em seguida, desloque, mas não remova, o alojamento do dicróico para alinhar a câmera um.

Em seguida, utilizando o botão de ajuste de foco na porta do monte subaquático um, foque novamente a imagem. Depois, empurre completamente o alojamento do dicróico para dentro do dispositivo de aquisição em canal duplo, de modo que a imagem seja dividida pelo dicróico para ambas as câmeras. Solte os parafusos de fixação de 3/5/60 polegadas e gire a segunda câmera no encaixe fêmea CM da porta dois até que a orientação da grade seja idêntica em ambas as imagens; utilizando o botão de ajuste de foco na porta C mount dois, coloque a imagem da câmera dois em foco.

Para finalizar o alinhamento, use o botão RL no lado direito do DC dois para ajustar as posições das imagens combinadas até o levantamento direito. A fronteira vertical das imagens deve estar precisamente alinhada na área de trabalho mesclada. Em seguida, use o botão UD para ajustar o alinhamento vertical da segunda imagem até que as barras da grade horizontal estejam adequadamente alinhadas.

Se durante o alinhamento vertical uma leve rotação da câmera ocorrer, corrija esse problema afrouxando os três parafusos de um quarto de polegada 5-60 da câmera dois e girando até que a imagem exibida esteja adequadamente alinhada. Prepare células de câncer de mama BET 20 para o ensaio de adesão em câmara de fluxo com placas paralelas corando-as com anti-CD 24 e TECA 4-5-2 usando anticorpos secundários LOR 5-68 e 4-88 conforme descrito no documento anexo; certifique-se de preparar os controles apropriados de uma única cor. Após a coloração, distribua as células no reservatório da câmara de fluxo com placas paralelas. Conecte dois comprimentos separados de tubo às portas de entrada e saída da câmara de fluxo.

Um tubo será conectado ao reservatório contendo as células marcadas suspensas em DPBS mais 0,1% de PSA. Conecte o outro tubo à bomba de seringa, que irá retirar o fluido em uma taxa de fluxo específica. Conecte uma linha de vácuo à câmara de fluxo e posicione a câmara de fluxo sobre a placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês que expressam lectina ou células CHO-e.

Ajuste a câmara de fluxo e a junta da câmara de fluxo para garantir uma vedação a vácuo adequada. Retire o fluido do reservatório, monitorando o conjunto da câmara de fluxo para verificar a vedação correta. Por fim, posicione o conjunto da câmara de fluxo sobre o microscópio, ligue a fonte de luz e configure o microscópio por inspeção manual.

Certifique-se de que o alojamento do espelho dicróico está na posição operacional correta e rebaixada, e não em modo de desvio. Altere manualmente para o modo de fluorescência e selecione o cubo de filtro de fluorescência verde-vermelho para determinar separadamente o tempo de exposição e o ganho. Capture imagens das células usando fluorescência vermelha na câmera um e fluorescência verde na câmera dois.

Pressione manualmente o dicróico conforme necessário para obter as imagens. Em seguida, deposite uma suspensão de células BT 20 coradas apenas com flora vermelha. Quatro anticorpos conjugados no reservatório conectado à porta de entrada da câmara de fluxo com placas paralelas.

Use a bomba de seringa para perfundir células BT 20 sobre o monocamada de choi na câmara de fluxo com placas paralelas. Nas configurações em tempo real do software de imagem, ajuste o tempo de exposição da câmera um para obter uma imagem no canal vermelho. Igualize o tempo de exposição da câmera dois ao tempo de exposição da câmera um.

Se uma imagem for observada no canal verde, há artefatos de vazamento. Se isso ocorrer, mantenha o tempo de exposição equivalente na câmera um e na câmera dois e reduza o tempo de exposição até que o artefato de vazamento não seja mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera um para melhorar a visibilidade da imagem no canal vermelho, se necessário.

Em seguida, remova toda a suspensão remanescente de células BT 20 do reservatório e substitua a suspensão por DPBS. Utilize a bomba de seringa para perfundir a solução sobre a monocamada de choi até que as células BT 20 não sejam mais visíveis na monocamada. Reabasteça o reservatório com a suspensão de células BT 20 marcadas apenas com o anticorpo conjugado com fluoro verde quatro.

Repita o processo de calibração da câmera utilizando os controles de cor única verde. Desta vez, defina o tempo de exposição com a câmera dois para imagens de células no canal verde sem artefatos de vazamento no canal vermelho coletado pela câmera um. Utilize o software de imagem para visualizar simultaneamente as imagens capturadas pelas duas câmeras CCD monocromáticas na câmara de fluxo.Experimento.

Una as imagens coletadas de ambas as câmeras usando o módulo simul pics do stream picks. Utilize ajustes de correção digital no simul pic ou em software alternativo para alinhar espacialmente as imagens combinadas. Se necessário, as imagens podem ser corrigidas com o módulo simul PIC para ajustes horizontais, verticais e rotacionais.

O sistema agora está pronto para ser usado para capturar duas imagens coloridas simultaneamente. Um ensaio de adesão em câmara de fluxo com placas paralelas foi utilizado para demonstrar o sistema de divisão de emissão com duas câmeras descrito neste vídeo. Como mostrado aqui, o sistema detectou células BT 20 marcadas fluorescentemente com anti-CD24 humano mostrado em vermelho e HECA 452, que se liga a moléculas relacionadas aos SCO mostradas em verde.

Algumas células rolantes exibiam sinais vermelhos, mas não verdes. Outras exibiam sinais verdes, mas não vermelhos, e ainda outras células exibiam tanto sinais vermelhos quanto verdes. As câmeras mantiveram a resolução óptica e temporal necessárias para acompanhar as características celulares durante a rotação e o movimento de ponta a ponta, enquanto as células rolavam sobre o substrato reativo na direção do fluxo; os canais de emissão combinados revelaram a distribuição e a colocalização das moléculas CD24 e sialiladas na superfície das células BT20 que rolavam e aderiam a monocamadas de CHO-e.

Essas imagens mostram um aumento de uma única célula BT 20 na qual moléculas CD 24 e sialiladas co-localizam-se e aparecem como pontos amarelos a laranja quando os canais de emissão com cores falsas vermelha e verde são sobrepostos. Em conjunto, essas informações demonstram que o sistema de divisão de emissão com duas câmeras possui a resolução espacial, temporal e óptica necessária para revelar características celulares e moleculares em aplicações como ensaios de adesão em câmara de fluxo, nos quais as células se movem rapidamente pelo campo de visão.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar e calibrar um sistema de divisão de emissão com câmera dupla ou realizar em tempo real um ensaio de adesão em câmara de fluxo com placas paralelas com imagem em duas cores. Este método pode ser aplicado a outros ensaios in vitro que utilizam fluorescência para estudar o comportamento celular.