Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

O objetivo geral deste procedimento é realizar um ensaio de adesão de câmara de fluxo de placa paralela usando um sistema de divisão de emissão de câmera dupla para gravar simultaneamente sequências de imagens em tempo real em duas cores. Para fazer isso, as duas câmeras na configuração de imagem são primeiro alinhadas. Em seguida, as células e o substrato reativo são preparados e a câmara de fluxo de placas paralelas é montada.

As configurações da câmera são então calibradas para aquisição de imagem em duas cores e quaisquer correções digitais necessárias são feitas no alinhamento da câmera. As sequências de imagens são então capturadas, o que demonstra a aquisição de imagens de duas cores com alta resolução temporal. A vantagem dos sistemas de divisão de emissão de câmera dupla em relação aos sistemas de câmera única é que diferentes tempos de exposição podem ser atribuídos a cada câmera e o campo de visão total é mantido.

Essa técnica pode ajudar a responder a questões-chave no campo da adesão celular, como a localização de moléculas de adesão na superfície das células pode afetar processos biológicos dinâmicos, como migração celular, inflamação e metástase de câncer. O procedimento a seguir requer um microscópio de epifluorescência invertido. Este deve ser equipado com uma fonte de luz de alta intensidade acoplada a um guia de luz, um cubo de filtro combinado e um sistema de câmera de divisão de emissão de câmera dupla.

A configuração do microscópio deve ser conectada a um computador com software de imagem capaz de coletar e combinar imagens capturadas por câmeras CCD monocromáticas. Aqui, o software multicâmera stream picks five é usado com o módulo simul picks. Comece abrindo as seleções de fluxo cinco na faixa de opções de tarefas, selecione workspace.

Em seguida, na extremidade direita da tela, abra o gerenciador de espaço de trabalho e selecione novo espaço de trabalho. Depois de nomear a câmera, siga as instruções do software para selecionar em uma lista pré-preenchida, um modelo de câmera correspondente ao grabber, um pequeno ícone de câmera aparecerá na área de trabalho para indicar que o feed da câmera foi recebido. Objetos fotografados com o microscópio agora podem ser visualizados na tela.

Repita esse processo para a segunda área de trabalho da câmera e, em seguida, para a área de trabalho mesclada, repita isso mais uma vez e todas as câmeras estarão em uso. A mensagem de erro aparecerá. Esta mensagem é uma câmera normalmente atribuída do espaço de trabalho um e dois ao espaço de trabalho mesclado no painel de encaixe localizado no lado direito da tela de visualização.

As imagens na área de trabalho um e dois serão sobrepostas na área de trabalho mesclada como duas imagens pseudocoloridas. O aspecto mais difícil deste procedimento é o alinhamento da câmera. Para garantir o sucesso, usamos o slide do fabricante enquanto seguimos meticulosamente as instruções do fabricante.

Para alinhar as câmeras no sistema de divisão de emissão de câmera dupla, envie luz de campo claro ou contraste de fase para a ocular do microscópio. Coloque a grade de calibração com revestimento metálico fornecida pelo fabricante na platina do microscópio e coloque a grade no quadrado da platina do microscópio. Exiba a grade sem binning e sem dimensionamento automático e coloque-a em foco, em seguida, desloque, mas não remova a caixa dicróica para alinhar a câmera um.

Em seguida, usando o botão de ajuste de foco na porta do monte submarino um, foque a imagem novamente. Em seguida, empurre o invólucro dicróico para o dispositivo de aquisição de canal duplo totalmente para que a imagem seja dividida pelo dicróico para ambas as câmeras. Afrouxe os parafusos de fixação de 3 5 60 polegadas de quarta polegada e gire a segunda câmera na porta de montagem CM fêmea dois até que a orientação da grade seja idêntica em ambas as imagens usando o botão de ajuste de foco na porta de montagem C dois, coloque a imagem da câmera dois em foco.

Para finalizar o alinhamento, use o botão RL no lado direito do DC dois para ajustar as posições combinadas da imagem até o levantamento direito. O limite vertical das imagens é alinhado com precisão na área de trabalho mesclada. Em seguida, use o botão UD para ajustar o alinhamento de cima para baixo da segunda imagem até que as barras de grade horizontais estejam alinhadas corretamente.

Se durante o alinhamento para cima e para baixo ocorrer uma ligeira rotação da câmera, corrija esse problema afrouxando os parafusos de 3 5 60 polegadas da câmera dois e girando até que a imagem exibida esteja alinhada corretamente. Prepare as células de câncer de mama BET 20 para o ensaio de adesão da câmara de fluxo de placa paralela, colorindo-as com anti CD 24 e TECA 4 5 2 usando LOR 5 68 e 4 88 secundários conforme descrito no documento anexo, certifique-se de preparar os controles de cor única apropriados após a coloração dispensar as células no reservatório da câmara de fluxo de placa paralela. Conecte dois comprimentos separados de tubulação às portas de entrada e saída da câmara de fluxo.

Um tubo se conectará ao reservatório contendo as células marcadas suspensas em DPBS mais contendo 0,1% PSA. Conecte o outro tubo à bomba de seringa, que retirará o fluido a uma taxa de fluxo especificada. Conecte uma linha de vácuo à câmara de fluxo e posicione a câmara de fluxo sobre a placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês expressando lectina ou células cho e.

Ajuste a câmara de fluxo e a junta da câmara de fluxo para garantir uma vedação a vácuo adequada. Retire o fluido do reservatório monitorando o conjunto da câmara de fluxo para vedação adequada. Por fim, coloque o conjunto da câmara de fluxo na alimentação do microscópio na fonte de luz e na configuração do microscópio por inspeção manual.

Certifique-se de que o invólucro dicróico esteja na posição de operação deprimida correta e não no modo de bypass. Mude manualmente para o modo de fluorescência e selecione o cubo do filtro de fluorescência vermelho verde para determinar o tempo de exposição e o ganho separadamente. Visualize as células usando fluorescência vermelha na câmera um e fluorescência verde na câmera dois.

Pressionou manualmente o dicróico conforme necessário para obter as imagens. Em seguida, deposite uma suspensão de células BT 20 coradas apenas com flora vermelha. Quatro anticorpos conjugados no reservatório conectados à porta de entrada da câmara de fluxo de placas paralelas.

Use a bomba de seringa para perfundir células BT 20 sobre a monocamada de choi na câmara de fluxo de placa paralela. Nas configurações ao vivo do software de imagem, ajuste o tempo de exposição da câmera um para obter uma imagem no canal vermelho. Combine o tempo de exposição da câmera dois com o tempo de exposição da câmera um.

Se uma imagem for observada no canal verde, haverá sangramento através de artefatos. Se isso acontecer, mantenha o tempo de exposição equivalente na câmera um e na câmera dois e reduza o tempo de exposição até que o artefato de sangria não seja mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera um para melhorar a visibilidade da imagem no canal vermelho, se necessário.

Em seguida, remova qualquer suspensão de célula BT 20 restante do reservatório e substitua a suspensão por DPBS. Use a bomba de seringa para perfundir a solução sobre a monocamada de choi até que as células BT 20 não sejam mais visíveis na monocamada. Reabasteça o reservatório com a suspensão de células BT 20 coradas apenas com anticorpo verde conjugado com flúor quatro.

Repita o processo de calibração da câmera usando os controles de cor única verde. Desta vez, defina o tempo de exposição com a câmera dois para células de imagem no canal verde sem sangrar através de artefatos no canal vermelho coletados pela câmera um. Use o software de imagem para visualizar simultaneamente as imagens capturadas das duas câmeras CCD monocromáticas na câmara de fluxo. Experimentar.

Mescle as imagens coletadas de ambas as câmeras usando o módulo simul pics de escolhas de stream. Use ajustes de correção digital em simul pic ou software alternativo para alinhar espacialmente as imagens mescladas. Se necessário, as imagens podem ser corrigidas com o módulo simul PIC para ajustes horizontais, verticais e rotacionais.

O sistema agora está pronto para ser usado para capturar duas imagens coloridas simultaneamente. Um ensaio de adesão de câmara de fluxo de placa paralela foi usado para demonstrar o sistema de divisão de emissão de câmera dupla descrito neste vídeo. Como mostrado aqui, o sistema detectou células BT 20 que foram marcadas com fluorescência com CD 24 anti-humano mostrado em vermelho e HECA 4 52, que se liga a moléculas relacionadas a SCOs mostradas em verde.

Algumas células rolantes exibiam sinais vermelhos, mas não verdes. Outros exibiam sinais verdes, mas não sinais vermelhos, e ainda outras células exibiam sinais vermelhos e verdes. Aqui. As câmeras mantiveram a resolução óptica e temporal para rastrear as características da célula em uma célula caindo e sobre a extremidade à medida que rolava no substrato reativo na direção do fluxo, os canais de emissão mesclados revelaram a distribuição e colocalização de moléculas CD 24 e saciadas na superfície das células BT 20 rolando e aderindo a CHO e Monocamadas.

Essas imagens mostram um zoom de uma única célula BT 20 na qual as moléculas CD 24 e saciadas se localizam e aparecem como manchas amarelas a laranja quando os canais de emissão pseudocoloridos vermelhos e verdes são mesclados. Tomados em conjunto. Essas informações demonstram que o sistema de divisão de emissão de câmera dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para revelar características celulares e moleculares em aplicações como ensaios de adesão de câmara de fluxo nos quais as células se movem rapidamente pelo campo de visão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar e calibrar um sistema de divisão de emissão de câmera dupla ou imagens de um ensaio de adesão de câmara de fluxo de placa paralela em tempo real em duas cores. Este método pode ser aplicado a outros ensaios in vitro que usam fluorescência para estudar o comportamento celular.