Name: Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de adesão celular em câmara de fluxo de placas paralelas usando um sistema de separação de emissão com câmera dupla para capturar imagens em duas cores simultaneamente com alta resolução temporal.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Douglas Goetz (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade Ohio) e Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade Ohio) para discussões criteriosas e revisão do manuscrito. Agradecemos também o Dr. Christopher Huppenbauer para discussões úteis técnicas (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation (CBET-1106118) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R15CA161830-01).

1. Instalação de Software <ol><li> Compre StreamPix 5 software multi-câmera com módulo SimulPix ou outro software de imagem capaz de coletar e combinar imagens captadas por câmeras CCD monocromática. </li><li> Os requisitos mínimos para StreamPix 5 incluem: Um PC equipado com Core 2 Duo com 2.4 GHz ou superior, com 2 GB de RAM ou superior. Uma câmera digital ou analógico IEEE apoiado e compatível placa de captura. O Windows XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Um monitor com suporte para resolução 1024 x 768 ou superior. Um adaptador gráfico com bom desempenho 2D (OCU Express 16x ou melhor é recomendado) e 7.200 RPM disco rígido para gravar com configuração RAID-O. </li></ol> 2. Instalação de sistema de câmera dupla capaz de duas cores simultâneas em tempo Real Imaging <ol><li> Conecte o divisor DC2 Photometrics emissão, ou semelhante dispositivo câmera dupla divisão de emissões, ao microscópio, deslizando o adaptador DC2 C-mount na porta de vídeo do microscope de tal modo que a carcaça da dicróico no dispositivo é acessível. </li><li> Insira duas câmeras CCD monocromático em fêmea de montagem C 1 e C-mount fêmea 2. Câmeras idênticas são preferíveis. Câmaras similares podem ser utilizados, mas a compatibilidade depende do hardware interno, o mais importante o sensor de imagem CCD. </li><li> Use software de imagem para exibir imagens de ambas as câmaras. Os passos seguintes (2.3.1 - 2.3.4) aplicam-se a StreamPix 5 com módulo SimulPix e deve ser adaptada para outro software de imagem multi-câmera. <ol><li> Abrir StreamPix 5 e selecione &quot;espaço de trabalho&quot; na fita tarefa. </li><li> Abrir &quot;gerente da área de trabalho&quot;, localizada na extremidade direita da tela e selecione &quot;novo espaço de trabalho&quot;. </li><li> Depois de nomear uma câmera, siga software pede para selecionar um capturador de uma lista pré-preenchida. Selecione o grabber combinando o modelo da câmera e repita para o segundo espaço de trabalho da câmara. Para a área de trabalho mesclado, repito mais uma vez, mas &quot;todas as câmeras estão em uso&quot; erro mENSAGEM aparecerá. Esta mensagem é normal. </li><li> Uma vez que o espaço de trabalho resultante da fusão é carregado, atribuir câmeras de espaço de trabalho um espaço de trabalho e 2 para o espaço de trabalho incorporada no painel de encaixe localizado no lado direito do ecrã de visualização. </li></ol></li><li> Alinhe as câmeras no sistema de separação, emissão câmera dual. <ol><li> Alinhar as câmaras em campo brilhante ou de contraste de fase com a grelha de calibração fornecidas pelo fabricante, utilizando uma objectiva 40X PlanApo (ou maior). </li><li> Enviar luz para as oculares do microscópio, coloque a grelha de calibração revestido de metal que foi fornecida pelo fabricante no palco microscópio e Praça da grade no palco microscópio. </li><li> Traga a grade em foco. </li><li> Deslocar, mas não remova, o alojamento dicróica para alinhar a câmera 1 (câmera manual). Exibir a grade sem binning e sem autoscaling. Foque a imagem usando o botão de ajuste de foco no porta C-mount 1. </li><li> Empurrar a caixa para o duplo dicróico Circuitosl dispositivo de aquisição totalmente, de modo que a imagem é dividida pelo dicróico para ambas as câmaras. </li><li> Solte os três 5/64 &quot;set parafusos e gire a segunda câmera na fêmea de montagem C 2 até que a orientação da rede é idêntico em ambas as imagens. Usando o botão de ajuste do foco em C-mount porta 2, trazer a imagem da câmera 2 em foco. </li><li> Finalize o alinhamento usando a imagem combinada no espaço de trabalho resultante da fusão do software de imagem. Isto permite que se veja uma pseudo sobreposição em tempo real das duas imagens da grelha de calibragem. Ajustar a posição da imagem combinados utilizando apenas o botão R / L, no lado direito da DC2. Ajuste este botão até que limite vertical direita / esquerda das imagens é precisamente alinhadas. </li><li> Use o botão L / D para ajustar o alinhamento up / down da segunda imagem até que as barras da grade horizontal estão devidamente alinhados. </li><li> Se durante o alinhamento para cima / baixo uma ligeira rotação da câmera ocorre, corrigir este problema, soltando os três 5/64 &quot;polegadas screws para câmera de 2 e gire até que a imagem exibida está bem alinhada. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de células de câncer de placas paralelas de fluxo Câmara Adesão Assay <ol><li> Culturas células BT-20 do cancro da mama em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com meio completo com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C e 5,0% de CO 2, como descrito anteriormente 2. </li><li> Células de câncer de colheita com um tratamento diluída tripsina e contagem de células com um hemocitômetro. </li><li> Lavar e suspender as células em 10 7 células / ml em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS com cálcio e magnésio (DPBS +). </li><li> Dilui-se os anticorpos primários, ratinho purificada CD24 anti-humano e de rato purificada HECA-452 (anti-antigénios sialofucosylated), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 minutos 9, 10. </li><li> Células centrifugar a 1.200 rpm para obter um pellet de células. Aspiclassificar o anticorpo primário, e lavar as células duas vezes com 0,1% de BSA DBPS +. </li><li> Dilui-se anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de ratinho AlexaFluor 568 (emissão máxima, 603 nm), e de cabra anti-IgM de rato AlexaFluor 488 (emissão máxima, 519 nm), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 min. </li><li> Lave as células duas vezes e suspensão em 0,1% de BSA DPBS + a 10 6 células / ml em 0,1% BSA DPBS +. </li></ol> 4. Preparação de Reactive Substrato para Placa Paralela Fluxo Câmara Adesão Assay <ol><li> Conectar dois comprimentos separados de tubo para as portas de entrada e de saída da câmara de fluxo de placas paralelas que se encaixa dentro de 35 mm de cultura de tecidos prato. Um tubo vai ligar ao reservatório de células marcadas em suspensão em 0,1% de BSA DPBS + e o outro para a bomba de seringa, que irá retirar o fluido a uma taxa de fluxo especificada. </li><li> Ligar uma linha de vácuo para a câmara de fluxo 1. </li><li> Posicione a câmara de fluxo ao longo de 35 mm de cultura de tecidos dish contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês que expressam E-selectina (CHO-E). As células CHO-E foram cultivadas em meio completo MEM a 37 ° C e 5,0% de CO 2 2. </li><li> Ajustar a câmara de fluxo e / ou junta câmara de fluxo para assegurar um selo de vácuo adequada 1. </li><li> Retire fluido do reservatório, monitoramento da montagem de câmara de fluxo para vedação adequada e nenhuma evidência visual de formação de bolhas de ar 1. </li><li> Coloque o conjunto câmara de fluxo em microscópio (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Duas cores Aquisição de Imagem <ol><li> Poder fonte Leica EL-6000 luz compacta, ou dispositivo similar, para gerar luz de alta intensidade e par-a em um guia de luz. Use um microscópio invertido para passar esta luz através de um filtro de combinação do cubo, ou seja, G / R (verde / vermelho) cubo de filtro, para excitar fluoróforos de uma cor / intensidade desejada. </li><li> Certifique-se de habitação dicróica está na posição correcta de funcionamento (deprimido) enão está no modo manual. </li><li> Operar microscópio de fluorescência no modo e selecionar adequada cubo de filtro de fluorescência (verde / vermelho). </li><li> Determinar o tempo de exposição e ganho de câmera 1 (vermelho, 620 ± 60 nm) e câmera de 2 (verde; 535 ± 40 nm). <ol><li> Pressione a dicróica para obter imagens em ambos os canais de emissão de vermelho e verde. Usar um ensaio de câmara de fluxo com células marcadas com apenas o fluoróforo vermelho, e obter uma imagem no canal vermelho, ajustando o tempo de exposição da câmara 1 em &quot;configurações vivo&quot; do software de imagem. </li><li> Combine o tempo de exposição de 2 a câmera o tempo de exposição da câmera 1. Se uma imagem é observada no canal verde, artefactos de purga estão presentes e tempo de exposição, em ambas as câmaras tem de ser reduzida. </li><li> Manter o tempo de exposição equivalente em câmera 1 e câmera de 2, reduzir o tempo de exposição até que o artefato de sangria-through não é mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera 1 para melhorar a imagem visibility no canal vermelho, se necessário. </li><li> Repita os passos 5.4.1 - 5.4.3 com células marcadas apenas com o fluoróforo verde, mas definir o tempo de exposição com a câmera de 2 a células de imagem no canal verde, sem artefatos sangram-through no canal vermelho coletadas pela câmera 1. </li><li> Anticorpos Retitrate se artefatos sangram-through não podem ser eliminados 11, ou se os tempos de exposição da câmera e uma câmera de 2 são substancialmente diferentes de tal forma que se fundiu imagens podem ser temporariamente desalinhado. </li></ol></li><li> Use um software de imagem para visualizar as imagens capturadas simultaneamente a partir de duas câmeras CCD monocromático no experimento câmara de fluxo. </li><li> Mesclar imagens recolhidas a partir de ambas as câmaras, utilizando o módulo de SimulPix Streampix 5 ou um pacote de software alternativo. </li><li> Use ajustes de correção digitais em SimulPix ou software alternativo para alinhar espacialmente as imagens incorporadas, se necessário. As imagens podem ser corrigidos com o módulo SimulPix para horizontal, verticale ajustes de rotação. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para capturar imagens de alta qualidade em aplicações onde a célula ou o movimento molecular é rápido. Em gerando os resultados representativos, os parâmetros do sistema de separação de emissão de câmara dupla, incluindo as configurações de software e as configurações da câmera, foram otimizados para obter uma sequência imagem mesclada em que rolamento e as células aderentes foram espacialmente e temporalmente alinha...

Os métodos para análise de moléculas na superfície das células, tais como a imunocoloração, empregam sondas que são quimicamente conjugados com fluoróforos, permitindo a detecção de moléculas alvo. Imagens de células vivas e ensaios de adesão de células baseadas no fluxo hidrodinâmicas são gravadas com câmeras CCD monocromático projetado para capturar os processos fisiológicos a nível celular e / ou molecular 1, 2. Essas câmeras são altamente sensíveis, entregar taxas de quadro rápidas (mais de 30 quadros por segundo), e fornecer resolução temporal excepcional (devido a taxas de quadro rápidas e tempos de exposição curto). No entanto, as câmeras monocromáticas só pode capturar um único canal de emissão (a detecção de um único fluoróforo) para coletar imagens. Sistemas de divisão de emissão de uma única câmara podem ser incorporados para captar vários canais de emissão, mas muitas vezes reduzir o campo de visão e exigem o mesmo tempo de exposição para a imagem de todos os canais. Para capturar o espectro de cores a partir de células marcadas com multiple fluoróforos, uma câmara de cor pode ser usado como alternativa. No entanto, câmeras de cor geralmente não são capazes de fornecer a resolução temporal desejado para imagens de células vivas em determinadas aplicações. Outro dispositivo de imagem é necessária para aplicações em que é vantajosa a imagem de células vivas em vários comprimentos de onda, mantendo uma alta resolução temporal. Uma aplicação experimental principal é o ensaio de adesão de câmara de fluxo de placas paralelas, em que as células são perfundidos em condições fisiologicamente relevantes sobre um substrato potencialmente reactiva 1, 3. As células em fluxo que expressam moléculas da superfície celular específicos podem aderir e rolo sobre o substrato, tal como uma monocamada de células que expressam as moléculas de adesão ou de proteínas extracelulares adsorvido à superfície da matriz 4, 5. Rolando células podem sofrer movimento de rotação e de translação em frações de segundo. Características moleculares sobre rolamento e células aderentes, tais como aglomerados de moléculas de superfície celular, também têm o potenciômetroal de sofrer reorganização activa na superfície da célula. Assim, sistemas de imagem deve fornecer uma resolução temporal excepcional (30 quadros por segundo ou mais, e &quot;quase zero&quot; tempos de exposição) para gerar uma seqüência de imagens que ilustra a progressão passo-a-passo de célula rolando 6, 7. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla são capazes de atender a essas demandas para a imagem latente células marcadas com vários fluoróforos. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla dividir e canais de fluorescência do filtro em duas câmeras semelhantes de capturar simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicos de fluoróforo, mantendo o pleno campo de visão. Esta tecnologia permite a comparação direta da imagem capturada em tempo real em cada canal e permite ao usuário alternar rapidamente entre os modelos de câmeras com diferentes capacidades de imagem. Esse recurso é útil para fazer ajustes nas configurações de captura de imagem em uma câmera que melhor permitem que o sistema para capturarfluoróforos com diferentes intensidades, vidas, e coeficientes de extinção 8. Juntamente com o software de imagem, sistemas de divisão de emissão da câmera dupla permite a gravação em tempo real de ensaios de imagens de células vivas em vários comprimentos de onda e pode aumentar a ensaios in vitro que utilizam a fluorescência para estudar o comportamento das células.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>BT-20 células</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E</td><td>Presente do Dr. R. Sackstein (Brigham and Women' s Hospital, Harvard Medical School)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina / 0.1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 anticorpo monoclonal</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal CD24 anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato IgG AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD</td><td>Camera Q Imaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD</td><td>Camera Q Imaging</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Emission Splitter</td><td>Photometrics</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Streampix 5 software</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneamente capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão usando um sistema de separação, dual camera emissão: aplicações de adesão celular

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

A microscopia de imunofluorescência multi-color para detectar moléculas específicas na membrana da célula pode ser acoplado com os ensaios de câmara de fluxo paralelo à placa de investigar os mecanismos que regulam a adesão de células em condições de escoamento dinâmico. Por exemplo, as células cancerosas marcadas com vários fluoróforos podem ser perfundidos sobre um substrato potencialmente reativo para modelar mecanismos de metástase do câncer. No entanto, multi-canal de sistemas únicos de câmera e câmeras coloridas deficiências apresentam na aquisição de imagens para análise de células vivas em tempo real. Para superar essas limitações, foi utilizado um sistema de separação de emissão de câmara dupla de capturar simultaneamente sequências de imagens em tempo real de células marcadas com fluorescência na câmara de fluxo. Comprimento de onda do filtro sistemas de divisão de emissão dupla de câmera definido varia em duas câmeras CCD monocromático, capturando, assim, simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Subsequentemente, psuedocolored imagens de um canal são combinados numa únicaem tempo real fundiu seqüência que pode revelar várias moléculas-alvo em células movendo-se rapidamente através de uma região de interesse.

Um ensaio de adesão câmara de fluxo de placas paralelas foi utilizado para demonstrar um sistema de separação de emissão de câmara dupla que simultaneamente capturado sequências de imagens em tempo real em dois canais de emissão (Figura 1). O sistema de separação de emissão de câmara dupla detectado células BT-20, que foram marcadas por fluorescência com CD24 anti-humano e HECA-452 (detecção de antigénios sialofucosylated) anticorpos monoclonais e anticorpos secundários adequados (Figura 2).</st...

Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um ensaio de adesão em câmara de fluxo com placas paralelas utilizando um sistema de divisão de emissão com duas câmeras para registrar simultaneamente sequências de imagens em tempo real em duas cores. Para isso, as duas câmeras do sistema de imageamento são primeiramente alinhadas. Em seguida, as células e o substrato reativo são preparados e a câmara de fluxo com placas paralelas é montada.As configurações da câmera são então calibradas para a aquisição de imagens em duas cores, e quaisquer correções digitais necessárias são feitas no alinhamento da câmera. Em seguida, são capturadas sequências de imagens, demonstrando a aquisição de imagens em dupla cor com alta resolução temporal. A vantagem dos sistemas de divisão de emissão com duas câmeras em relação aos sistemas com uma única câmera é que diferentes tempos de exposição podem ser atribuídos a cada câmera e todo o campo de visão é mantido.Essa técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da adesão celular, como a forma pela qual a localização de moléculas de adesão na superfície das células pode afetar processos biológicos dinâmicos, tais como migração celular,

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Förster transferência de energia por ressonância (FRET) microscopia é uma técnica poderosa para monitoramento em tempo real de eventos de sinalização em células vivas usando biossensores diversos como repórteres. Aqui descrevemos como construir um epifluorescência personalizado FRET sistema de imagens a partir de componentes disponíveis comercialmente e como usá-lo para FRET experimentos.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

Fonte: Bello-Gamboa, A. et al., Imageando a Sinapse Imunológica Humana.J. Vis. Exp.(2019) Este vídeo demonstra o estudo in vitro da formação de sinapses imunológicas entre uma célula apresentadora de antígeno e linfócitos T auxiliares usando um microscópio de fluorescência. Os receptores de células T dos linfócitos T auxiliares interagem com um complexo antígeno-MHC-II nas células apresentadoras de antígenos e formam sinapses imunológicas, seguidas por movimentos de vesículas secretoras em...

Formação de sinapses imunológicas entre células T auxiliares e células apresentadoras de antígenos

Fonte: Kulkarni, M. et al. Dinâmica de Ca2+ em terminais axônicos fotorreceptores de cone da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de uma retina de camundongo transgênico. Ele descreve as etapas para preparar fatias de retina, imagens de biossensores de cálcio baseados em FRET e analisar alterações de fluorescência para quantificar os níveis de cálcio sob iluminação de...

Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos

Nós descrevemos um método de imagem ao vivo de células que fornece insights sobre a dinâmica de proteínas durante o processo de ativação de células-T. Nós demonstramos a utilização combinada de a célula T-ensaio espalhamento, microscopia confocal e análise de imagens para se obter resultados quantitativos para seguir a formação do complexo de sinalização durante a activação de células-T.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&amp;B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Este protocolo apresenta uma coleção de dados geométricos sarcomere, cálcio e macroscópico de uma trabecula cardíaca ex vivo. Essas medidas simultâneas são possíveis pela integração de três modalidades de imagem.

Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

Aprenda a realizar ensaios de adesão celular em câmara de fluxo de placas paralelas usando um sistema de separação de emissão com câmera dupla para capturar imagens em duas cores simultaneamente com alta resolução temporal.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular (Vídeo) | JoVE Journal

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

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