Name: Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Aprenda a técnica FPALM para imagem multicolor de proteínas em células fixas ou vivas com precisão nanométrica. Este método permite localizar milhares de moléculas individualmente, superando o limite de difração da microscopia convencional.

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Os autores gostariam de agradecer a Philip Andresen, Matthew Parent e Sean Carter pela programação de computadores, assistência técnica e conversas úteis e Pat Byard pela assistência administrativa. Este trabalho foi financiado pelo NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 e 2061 e Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
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<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

STH e MJM detêm patentes em microscopia de super-resolução. STH atua no conselho consultivo científico da Vutara, Inc.

A imagem de super-resolução baseada em localização fornece muitos recursos poderosos para imagens biológicas. A rota de componentes ópticos individuais colocados na mesa para um microscópio funcional de super-resolução capaz de obter imagens simultâneas de várias espécies fluorescentes em uma amostra biológica apresenta uma série de desafios. Alguns aspectos do alinhamento são mais críticos do que outros; Nós nos esforçamos abaixo para fornecer orientação aos usuários em potencial que lidam com os aspectos mais difíceis ...

Embora existam estruturas celulares em uma ampla gama de escalas espaciais, a imagem de fluorescência da organização celular em escalas de comprimento menores que ~250 nm é restrita na microscopia convencional devido à restrição física do limite de difração. Esse limite foi superado com o advento da microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM1) e técnicas semelhantes2,3, que podem localizar um grande número de moléculas individuais com precisão de ~ 10 nm, para gerar imagens com resolução de algumas dezenas de nanômetros. O FPALM é baseado no uso de controle óptico para ativar e inativar subconjuntos de moléculas (para uma descrição completa do FPALM e instruções sobre como implementar esse sistema de imagem, consulte Gould et al.4). Esta técnica permite que as distribuições espaciais de populações inteiras de moléculas únicas sejam mapeadas, elucidando assim estruturas biológicas em escalas de comprimento que variam de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. A microscopia de super-resolução baseada em localização (doravante denominada microscopia de localização) foi agora adaptada para abordar uma série de questões biológicas, com desenvolvimentos tecnológicos permitindo, por exemplo, a imagem de orientações moleculares individuais com polarização FPALM, ou P-FPALM5, a imagem de fluorescência de moléculas únicas em três dimensões com Biplane FPALM6 ou outras técnicas7-9e a imagem de fluorescência de super-resolução de moléculas únicas em células vivas10-12. A microscopia de localização também foi aplicada à imagem de várias espécies em células fixas13-16. Recentemente, três espécies de proteínas foram simultaneamente visualizadas com FPALM em células fixas e vivas17. A microscopia de localização pode obter imagens de amostras marcadas de várias maneiras: exemplos incluem proteínas expressas com etiquetas de fusão PAFP ou PSFP, anticorpos ou moléculas marcadas com corantes orgânicos enjaulados ou corantes orgânicos convencionais. Embora o uso de corantes fluorescentes convencionais permita a marcação de proteínas na ausência de uma etiqueta de proteína de fusão, as condições geralmente exigidas para o uso de corantes orgânicos não enjaulados em imagens de super-resolução exigem que as amostras sejam imersas em tampões redutores2. Além disso, a entrega intracelular de conjugados anticorpo-corante normalmente requer que as células sejam fixadas e suas membranas permeabilizadas, ou requer que as células vivas sejam permeáveis por eletroporação ou algum outro meio. Os requisitos para reduzir as condições de tampão e permeabilização da membrana limitam a adequação dos corantes orgânicos para imagens de células vivas, embora desenvolvimentos recentes tenham permitido o uso efetivo de HaloTags e FPALM para imagens de estruturas de membrana18.
FPALM foi a primeira técnica de microscopia de localização a ser aplicada a células vivas10. Em células vivas, além de fornecer um mapa espacial dependente do tempo das localizações das moléculas marcadas, o FPALM pode rastrear moléculas únicas em vários quadros e trajetórias moleculares determinadas em escalas de tempo de milissegundos19. Assim, o FPALM fornece acesso a escalas de tempo bastante curtas e resolução em nanoescala.
O FPALM multicolorido pode ser usado para uma variedade de sondas diferentes, incluindo proteínas fotoativáveis e corantes orgânicos enjaulados ou não enjaulados. Aqui fornecemos detalhes sobre o protocolo e a configuração para a imagem simultânea de duas espécies de proteínas fluorescentes, Dendra2 e PAmCherry. Relatamos os resultados da imagem de PAmCherry conjugada à beta actina (PAmCherry-actina) e Dendra2 conjugada à hemaglutinina influenza (Dendra2-HA) em fibroblastos NIH-3T3. Os componentes descritos na configuração podem ser trocados por outro hardware mais adequado para a imagem de outras sondas. Quando for esse o caso, tentamos ser explícitos no texto.
Multicolor FPALM é ideal para relatar as distribuições espaciais de várias espécies de proteínas em células vivas ou fixas. Esta técnica é especialmente adequada para investigar relações espaciais e/ou dinâmicas em escalas espaciais de comprimento nanométrico, embora as imagens relatem a localização em uma variedade de escalas de comprimento, de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. Uma grande vantagem do FPALM multicolorido é que a configuração é relativamente barata de construir e muito flexível para uso com várias combinações de sondas. O processo de construção e calibração do sistema a partir de componentes também fornece uma compreensão considerável dos fatores que podem comprometer a qualidade e a interpretabilidade dos dados e, portanto, o resultado da pesquisa. Detalhamos aqui os métodos para a configuração óptica, preparação de amostras e aquisição de dados de várias espécies de proteínas, com construções de fusão PSFP e PAFP, usando FPALM. Embora este protocolo descreva a análise de células fixas, esses procedimentos são prontamente aplicáveis à imagem de células vivas.
A configuração óptica aqui descrita é ideal para a aquisição simultânea de imagens do PSFP Dendra2 e do PAFP PAmCherry. Muitas outras sondas podem ser usadas para imagens multicoloridas; no entanto, os componentes precisos necessários podem variar, dependendo dos espectros de excitação e emissão das sondas escolhidas. As escolhas de espelhos dicróicos, filtros e comprimentos de onda de laser devem ser feitas com base nessas considerações.

<table><tbody><tr><td>Câmaras LabTek II</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Contas fluorescentes</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Esferas para calibração</td></tr><tr><td>Contas Tetraspeck</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Quatro contas de cores para calibração</td></tr><tr><td>Óleo de imersão de objetiva</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Óleo de imersão para objetiva de alta NA (dependendo da escolha da objetiva)</td></tr> <tr><td>Água HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Ou Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>soro</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>CUIDADO: Tóxico</td></tr></tbody></table>

simultânea multicolor imagem de estruturas biológicas com fluorescência fotoativação localização microscopia

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

A microscopia de super-resolução baseada em localização pode ser aplicada para obter um mapa espacial (imagem) da distribuição de moléculas individuais marcadas com fluorescência dentro de uma amostra com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros. Usando proteínas fluorescentes fotoativáveis (PAFP) ou fotocomutáveis (PSFP) fundidas a proteínas de interesse, ou corantes orgânicos conjugados a anticorpos ou outras moléculas de interesse, a microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM) pode obter imagens simultâneas de várias espécies de moléculas dentro de células únicas. Usando a abordagem a seguir, populações de um grande número (milhares a centenas de milhares) de moléculas individuais são visualizadas em células individuais e localizadas com uma precisão de ~ 10-30 nm. Os dados obtidos podem ser aplicados para entender as distribuições espaciais em nanoescala de vários tipos de proteínas dentro de uma célula. Uma das principais vantagens dessa técnica é o aumento dramático na resolução espacial: enquanto a difração limita a resolução a ~ 200-250 nm na microscopia de luz convencional, o FPALM pode dimensionar o comprimento da imagem em mais de uma ordem de magnitude menor. Como muitas hipóteses biológicas dizem respeito às relações espaciais entre diferentes biomoléculas, a resolução aprimorada do FPALM pode fornecer informações sobre questões de organização celular que antes eram inacessíveis à microscopia de fluorescência convencional. Além de detalhar os métodos de preparação de amostras e aquisição de dados, descrevemos aqui a configuração óptica do FPALM. Uma consideração adicional para os pesquisadores que desejam fazer microscopia de super-resolução é o custo: as configurações internas são significativamente mais baratas do que a maioria das máquinas de imagem disponíveis comercialmente. As limitações dessa técnica incluem a necessidade de otimizar a marcação de moléculas de interesse em amostras de células e a necessidade de software de pós-processamento para visualizar os resultados. Descrevemos aqui o uso da expressão de PAFP e PSFP para obter imagens de duas espécies de proteínas em células fixas. A extensão da técnica para células vivas também é descrita.

A hemaglutinina (HA) da gripe forma aglomerados na ordem de dezenas de nanômetros a micrômetros, e esses aglomerados colocalizam-se variavelmente com a actina (Figura 5). Essas distribuições espaciais corroboram imagens em escala mais ampla dessas duas proteínas28 e a dependência das distribuições espaciais da HA em relação à actina19. Imagens multicoloridas de FPALM podem ser ainda utilizadas para descrever a densidade, área e perímetro desses aglomerados, bem como o grau de coloca...

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de múltiplas espécies proteicas simultaneamente com precisão de nanômetro em células fixadas ou vivas. Isso é realizado primeiramente ajustando a posição de uma câmera e da óptica até que uma imagem focalizada do microscópio seja projetada sobre o sensor da câmera. O segundo passo consiste em alinhar os feixes de laser para que sejam direcionados precisamente sobre a amostra localizada na platina do microscópio.Em seguida, a amostra celular preparada é iluminada e uma célula que expressa as proteínas desejadas é selecionada. O passo final consiste em obter uma imagem da célula por microscopia de localização por ativação fotofluorescente, iluminando a amostra com lasers e, em seguida, direcionando a fluorescência celular para o sensor da câmera a fim de adquirir um conjunto de dados. Em última análise, a microscopia de localização por ativação fotofluorescente é utilizada para demonstrar a localização de múltiplas espécies proteicas em escala espacial de nanômetro em células fixadas ou vivas, tanto em campo amplo quanto ao utilizar fluorescência por reflexão interna total para isolar uma região fina da amostra.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia confocal ou eletrônica, é que é possível obter imagens de múltiplas proteínas simultaneamente com resolução de nanômetros em células fixadas ou vivas. Os seguintes passos referem-se a um sistema de numeração mostrado aqui, que é um esquema para a configuração multicolorida F Om fornecido como figura um no protocolo de texto complementar para alinhar o microscópio, começando por colocar uma escala de calibração ou um radical na platina do microscópio com uma objetiva de 10 x no lugar e a lâmpada ajustada para luz transmitida. Centralize o elemento vertical no centro do campo de visão.Em seguida, ajuste o microscópio para iluminação de Kohler fechando a abertura de campo e observando através das oculares na vertical. Se as bordas da abertura de campo estiverem desfocadas, ajuste a altura do condensador até que tanto a abertura de campo quanto o retículo estejam em foco. Em seguida, ajuste a posição lateral da abertura de campo até que ela esteja centralizada em relação ao campo de visão e feche a abertura de campo até que apenas a grade central no retículo esteja iluminada.Na primeira vez que esses componentes forem montados, ajuste os comprimentos de percurso de cada canal para que sejam iguais. Para realizar este procedimento, desloque o laser para o chip da câmera ajustando os espelhos sete e nove e feche o diafragma de detecção para evitar sobreposição espacial entre os dois canais. Em seguida, foque a imagem do radical no canal de luz refletida e verifique se ela também está em foco no canal de luz transmitida.Se a imagem no canal de luz transmitida não estiver em foco, desloque o espelho nove até que a imagem do radical esteja focada simultaneamente em ambos os canais. Inicie o alinhamento dos lasers removendo a lente um do trajeto do laser e bloqueando os feixes de ativação e leitura. Em seguida, coloque um cartão branco encostado contra o espelho quatro, abra o obturador do microscópio e foque até que a imagem do radical seja projetada no cartão diante do espelho quatro.Em seguida, desbloqueie o feixe de leitura e ajuste o espelho um para centralizar o laser de leitura nas cruzetas da imagem do radical no espelho quatro. Uma vez centralizado, projete a imagem do radical no espelho cinco e ajuste o espelho quatro até que o feixe esteja centralizado nas cruzetas da imagem do espelho cinco. O feixe de leitura agora deve estar centralizado tanto no M quatro quanto no M cinco.Em seguida, bloqueie o feixe de leitura fechando o obturador um. Depois, projete a imagem do radical no espelho três. Remova o expansor de feixe do trajeto do laser e desbloqueie o laser de ativação.Agora, ajuste o espelho dois para centralizar o feixe de ativação sobre as cruzetas da imagem do radical no espelho três. Uma vez centralizado, substitua o expansor de feixe entre os espelhos dois e três e ajuste a posição do expansor de feixe até que o feixe esteja centralizado nas cruzetas da imagem do radical. No espelho três, projete a imagem do radical sobre o espelho cinco e foque.Usando o botão de foco do microscópio, ajuste o ângulo do espelho dicróico número um até que o feixe de ativação esteja centralizado na imagem vermelha. Em seguida, bloqueie o laser de ativação fechando o obturador dois, sem objetiva no lugar e com o obturador do microscópio aberto. Abra o obturador de leitura, obturador um, e projete o laser através da abertura traseira do microscópio.Ajuste o espelho cinco até que o feixe saia do microscópio, de modo que o feixe saia verticalmente do microscópio com a lente um e a objetiva recolocadas. Coloque uma amostra contendo 100 micromolar de bromo B sobre a platina com o laser de ativação bloqueado. Projete o laser de leitura através de uma objetiva de 60 x e dentro do corante.Com o ganho de multiplicação de elétrons desativado. Envie esta imagem para a câmera. Em seguida, foque o objetivo no interior da amostra.Abra a abertura o suficiente para permitir a aquisição do perfil completo do feixe. Em seguida, desloque a abertura lateralmente de modo que o centro do perfil do feixe e a abertura fiquem concêntricos. Utilizando o software da câmera, selecione a região de interesse para permitir a menor região de leitura da câmera que englobe ambos os canais e registre essas coordenadas.Neste momento, registre uma única imagem para representar o perfil do feixe de leitura. Em seguida, bloqueie o laser de leitura fechando o obturador um e abra o obturador dois. Para iniciar a medição do perfil do feixe de ativação, projete o laser de ativação na amostra; se necessário, utilize um ganho multiplicador de elétrons inferior a 100 e ajuste o primeiro espelho dicróico até que o feixe esteja centralizado em cada campo de visão.Em seguida, registre uma imagem instantânea do perfil do feixe de ativação para iniciar a aquisição de imagens multicoloridas de F palm. Elimine toda a iluminação ambiente. Em seguida, projete a lâmpada de mercúrio, por meio do suporte basculante, sobre as células transfectadas e troque o cubo de filtros por um que contenha o comprimento de onda de excitação apropriado do estado pré-alteração fotoinduzida.Uma vez escolhida uma célula, mova o suporte invertido para baixo para permitir que os lasers passem para o microscópio e altere a torreta de filtros para aquela que contém o espelho dicromático apropriado para a imagem, conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, projete esta imagem na câmera para distinguir as células transfectadas da fluorescência de fundo e confirmar que as moléculas são passíveis de fotoativação. Ilumine brevemente a amostra com uma potência baixa inferior a 10 microwatts proveniente do laser de ativação.Em seguida, prepare o software da câmera para a aquisição de séries cinéticas configurando o ganho de multiplicação eletrônica para 200 e o número desejado de quadros entre cinco e 10.000. Também defina a exposição entre 10 e 30 milissegundos. Em seguida, bloqueie o feixe de ativação, desbloqueie o feixe de leitura e projete a imagem da célula iluminada na câmera.Escolha um plano focal próximo à membrana celular inferior movendo o foco para baixo até que as moléculas individuais deixem de ser visíveis. Em seguida, mova gradualmente o foco para cima até que as moléculas se tornem visíveis pela primeira vez. Agora, desbloqueie o feixe de ativação e ilumine a amostra com intensidade inferior a um watt por centímetro quadrado.Comece a adquirir esses dados por meio do software da câmera, mantendo uma densidade de 0,1 a uma molécula fotográfica visível por micrômetro quadrado, ajustando dinamicamente o filtro de densidade neutra diante do laser de ativação. Para a montagem de imagem por fluorescência de reflexão interna total, fixe o espelho cinco e a lente um sobre uma única plataforma de translação, que será movida lateralmente logo atrás da entrada do microscópio. À medida que o espelho cinco e a lente um são transladados, os lasers que saem do objetivo para cima através da amostra irão gradualmente inclinar-se para um lado; continue transladando a plataforma até que o ângulo dos lasers atinja 90 graus em relação à vertical.Neste ponto, o próprio laser emergente desaparecerá e o laser incidente será refletido de volta para a abertura, viajando em sentido anti-paralelo ao feixe incidente e deslocado para o lado. Você deverá observar uma redução no fundo quando a amostra entrar em fluorescência por reflexão interna total após a conclusão das aquisições de imagem; imediatamente feche o obturador do microscópio e bloqueie ambos os feixes. Desative o ganho de multiplicação eletrônica.Configure a câmera para gravar um quadro e defina a região de leitura da câmera no tamanho máximo. Por fim, bloqueie um canal colocando um cartão sobre F três ou F quatro com um filtro de passagem longa montado na lâmpada do microscópio. Ilumine a amostra e projete esta imagem na câmera.Registre uma imagem da célula para representar toda a célula em luz transmitida. Aqui é mostrado um exemplo de aquisição F palm de duas cores de uma célula NIH três T três expressando tanto DENDRA dois Hemaglutinina quanto PAM Cherry actina. O canal transmitido à esquerda contém comprimentos de onda mais longos do que o canal refletido à direita.Mostram-se aqui imagens do mesmo processo de aquisição em duas cores de microscopia de fluorescência após subtração do fundo e transformação para sobreposição dos canais esquerdo e direito. Moléculas individuais podem ser identificadas e localizadas. Algumas moléculas aparecem mais brilhantes no canal transmitido e outras apresentam uma distribuição mais uniforme da emissão entre os dois canais.Isso indica a diferença nos espectros de emissão entre o PAM cherry e o DENDRA dois, respectivamente, e é utilizado na análise para identificar essas duas espécies. O histograma mostrado aqui indica uma razão entre a intensidade do canal vermelho transmitido e a intensidade total para todas as moléculas localizadas após a aplicação das tolerâncias. Os pixels aparecem brancos na imagem inferior esquerda e aparecem vermelhos na imagem final sobreposta, mostrada na parte inferior direita, onde aqueles na região verde são mostrados como brancos na imagem superior direita e aparecem verdes na imagem final sobreposta mostrada na parte inferior direita.Os níveis de limiar escolhidos durante a renderização afetam significativamente o grau de ruído e a aparência da colocalização mostrada. Aqui estão três opções diferentes de renderização que resultam em variados graus de vazamento, sendo que os níveis de limiar mais conservadores são mostrados nos dois últimos. Os histogramas de cor F palm alfa são os mais adequados para interpretação quando há dois picos distintos na imagem.Embora o histograma à esquerda seja um bom candidato para análises posteriores, as imagens resultantes dos outros dois histogramas serão muito mais difíceis de interpretar seguindo este procedimento. Métodos como reflexão interna total, microscopia e imagem de células vivas podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como as proteínas são organizadas em escala nanométrica nas membranas de células vivas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar seu próprio microscópio FAR e utilizá-lo para adquirir dados.Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso, e o treinamento de segurança deve ser concluído antes de tentar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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