Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de várias espécies de proteínas simultaneamente com precisão nanométrica em células fixas ou vivas. Isso é feito ajustando primeiro a posição de uma câmera e óptica até que uma imagem focada do microscópio seja projetada no chip da câmera. O segundo passo é organizar os feixes de laser para que fiquem diretamente alinhados em uma amostra no estágio do microscópio.

Em seguida, a amostra de célula preparada é iluminada e uma célula que expressa as proteínas desejadas é escolhida. A etapa final é obter imagens da célula com microscopia de localização de fotoativação de fluorescência, iluminando a amostra com lasers e, em seguida, direcionando a fluorescência da célula para o chip da câmera para adquirir um conjunto de conjuntos de dados. Em última análise, a microscopia de localização de fotoativação de fluorescência é usada para mostrar a localização de várias espécies de proteínas em escala espacial nanométrica em células fixas ou vivas e em campo amplo ou ao usar fluorescência de reflexão interna total para isolar uma região fina da amostra.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como microscopia confocal ou eletrônica, é que se pode obter imagens de várias proteínas simultaneamente com resolução nanométrica em células fixas ou vivas. As etapas a seguir referem-se a um sistema de numeração conforme mostrado aqui, que é um esquema para a configuração multicolorida F Om fornecida como figura um no protocolo de texto que acompanha para alinhar o microscópio Comece colocando uma escala de calibração ou radical no microscópio stage com uma objetiva de 10 x no lugar e o conjunto de lâmpadas para luz transmitida. Centralize a vertical no centro do campo de visão.

Em seguida, ajuste o microscópio para iluminação coer fechando a abertura de campo e olhando através das oculares para a vertical. Se as bordas da abertura de campo estiverem desfocadas, ajuste a altura do condensador até que a abertura de campo e o redle estejam focados. Em seguida, ajuste a posição lateral da abertura do campo até que esteja centralizada em relação ao campo de visão e feche a abertura do campo até que apenas a grade central no redle seja iluminada.

Na primeira vez que esses componentes forem montados, ajuste os comprimentos de caminho de cada canal para serem iguais. Para realizar este projeto, o redle no chip da câmera ajusta os espelhos sete e nove e fecha a abertura de detecção para evitar sobreposição espacial entre os dois canais. Em seguida, focalize a imagem do radical no canal de luz refletido e verifique se ele também está em foco no canal de luz transmitido.

Se a imagem no canal de luz transmitida não estiver em foco, translade o espelho nove até que a imagem radical esteja em foco simultaneamente em ambos os canais. Comece a alinhar os lasers removendo a lente um do caminho do laser e bloqueando os feixes de ativação e leitura. Em seguida, coloque um cartão branco rente ao espelho quatro, abra o obturador do microscópio e foque até que a imagem radical se projete no cartão na frente do espelho quatro.

Em seguida, desbloqueie o feixe de leitura e ajuste o espelho um para centralizar o laser de leitura na mira da imagem radical no espelho quatro. Uma vez centralizado, projete a imagem radical no espelho cinco e ajuste o espelho quatro até que o feixe esteja centralizado na mira da imagem do espelho cinco. O feixe de leitura agora deve estar centralizado em M quatro e M cinco.

Em seguida, bloqueie o feixe de leitura fechando o obturador um. Em seguida, projete a imagem radical no espelho três. Remova o expansor de feixe do caminho do laser e desbloqueie o laser de ativação.

Agora ajuste o espelho dois para centralizar o feixe de ativação na mira da imagem radical no espelho três. Uma vez centralizado, recoloque o expansor de feixe entre os espelhos dois e três e ajuste a posição do expansor de feixe até que o feixe esteja centralizado na mira da imagem radical. No espelho três, projete a imagem radical no espelho cinco e foque.

Usando o botão de foco do microscópio, ajuste o ângulo do espelho dicróico número um até que o feixe de ativação esteja centralizado na imagem vermelha. Em seguida, bloqueie o laser de ativação fechando o obturador dois sem nenhuma objetiva no lugar e o obturador do microscópio aberto. Abra o obturador de leitura e projete o laser através da abertura traseira do microscópio.

Ajuste o espelho cinco até que o feixe saia do microscópio, de modo que o feixe saia do microscópio verticalmente com a lente um e a objetiva de volta no lugar. Coloque uma amostra contendo 100 bromo B micromolar no estágio com o laser de ativação bloqueado. Projete o laser de leitura através de uma objetiva de 60 x e no corante.

Com o ganho de multiplicação de elétrons desativado. Envie esta imagem para a câmera. Em seguida, concentre o objetivo na amostra.

Abra a abertura o suficiente para permitir a imagem do perfil de feixe completo. Em seguida, translade a abertura lateralmente para que o centro do perfil do feixe e a abertura sejam concêntricos. Usando o software da câmera, escolha a região de interesse para permitir a menor região de leitura da câmera encapsulando ambos os canais e registre essas coordenadas.

Neste ponto, registre um único instantâneo para representar o perfil do feixe de leitura. Em seguida, bloqueie o laser de leitura fechando o obturador um e abra o obturador dois. Para começar a medir o perfil do feixe de ativação, projete o laser de ativação para a amostra, se necessário, use um ganho de multiplicação de elétrons inferior a 100 e ajuste o primeiro espelho dicróico até que o feixe esteja centralizado em cada campo de visão.

Em seguida, grave um instantâneo do perfil do feixe de ativação para começar a adquirir imagens multicoloridas da palma da mão. Elimine toda a iluminação da sala. Em seguida, projete a lâmpada de mercúrio através do flip mount em células transfectadas e mude o cubo do filtro para um contendo o comprimento de onda de excitação apropriado do interruptor pré-foto. Estado.

Uma vez escolhida uma célula, mova o suporte flip para baixo para permitir que os lasers passem para o microscópio, mude a torre do filtro para aquela que contém o espelho dicróico apropriado para a imagem, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, projete essa imagem para a câmera para distinguir as células transfectadas da fluorescência de fundo e para confirmar que as moléculas são fotoáveis. Iluminar brevemente a amostra com uma potência inferior a 10 microwatts do laser de activação.

Em seguida, prepare o software da câmera para aquisição de séries cinéticas definindo o jogo de multiplicação de elétrons para 200 e o número desejado de quadros entre cinco e 10.000. Defina também a exposição entre 10 e 30 milissegundos. Em seguida, bloqueie o feixe de ativação, desbloqueie o feixe de leitura e projete a imagem da célula iluminada para a câmera.

Escolha um plano focal próximo à membrana celular inferior, deslocando o foco para baixo até que as moléculas individuais não sejam mais visíveis. Em seguida, mova gradualmente o foco para cima até que as moléculas se tornem visíveis. Agora desbloqueie o feixe de ativação e ilumine a amostra com menos de um watt por centímetro quadrado de intensidade.

Comece a adquirir esses dados por meio do software da câmera, mantendo uma densidade de 0,1 a uma molécula fotoável visível por mícron quadrado, ajustando dinamicamente o filtro de densidade neutra na frente do laser de ativação. Para imagens de fluorescência de reflexão interna total, monte o espelho cinco e a lente um em um único estágio de translação para ser movido lateralmente logo atrás da entrada do microscópio. À medida que o espelho cinco e a lente um são translacionados, os lasers que saem da objetiva para cima através da amostra irão gradualmente inclinar-se para um lado, continuar a traduzir o palco até que o ângulo dos lasers atinja 90 graus da vertical.

Neste ponto, o próprio laser emergente desaparecerá e o laser de entrada será refletido de volta na abertura viajando antiparalelamente ao feixe de entrada e deslocado para o lado. Você deve ver uma redução no fundo quando a amostra entra na fluorescência de reflexão interna total após a conclusão das aquisições de imagem, feche o obturador do microscópio imediatamente e bloqueie ambos os feixes. Desative o ganho de multiplicação de elétrons.

Configure a câmera para gravar um quadro e defina a região de leitura da câmera para seu tamanho máximo. Finalmente, bloqueie um canal colocando um cartão sobre F três ou F quatro com um filtro passa-longo montado na lâmpada do microscópio. Ilumine a amostra e projete essa imagem na câmera.

Registre um instantâneo da célula para representar toda a célula na luz transmitida. Aqui é mostrado um exemplo de uma aquisição de palma F de duas cores de uma célula NIH três T três expressando DENDRA duas hemaglutininas e PAM Cherry actina. O canal transmitido à esquerda contém comprimentos de onda mais longos do que o canal refletido à direita.

Aqui são mostrados instantâneos da mesma aquisição de F OM de duas cores seguindo o plano de fundo, a subtração e a transformação para sobrepor os canais esquerdo e direito. Moléculas individuais podem ser identificadas e localizadas. Algumas moléculas parecem mais brilhantes no canal transmitido e algumas têm uma distribuição mais uniforme de emissão entre os dois canais.

Isso indica a diferença nos espectros de emissão entre PAM cherry e DENDRA two, respectivamente, e é usado em análises para identificar essas duas espécies. O histograma mostrado aqui indica uma proporção da intensidade do canal transmitido vermelho dividida pela intensidade total para todas as moléculas localizadas após a aplicação das tolerâncias. Os pixels aparecem em branco na imagem inferior esquerda e aparecem em vermelho na imagem mesclada final mostrada no canto inferior direito, onde os da região verde são mostrados como brancos na imagem superior direita e aparecem em verde na imagem mesclada final mostrada no canto inferior direito.

Os níveis de limite escolhidos durante a renderização afetam muito o grau de ruído e a aparência da colocalização. Mostrado. Aqui estão três opções diferentes de renderização que resultam em vários graus de sangramento através dos níveis de limite mais conservadores são mostrados nos dois inferiores. Os histogramas alfa da palma da mão Color F são melhores para interpretar quando há dois picos discerníveis na imagem.

Embora o histograma à esquerda seja um bom candidato para análise posterior, as imagens resultantes dos outros dois histogramas serão muito mais difíceis de interpretar após este procedimento. Métodos como reflexão interna total, microscopia e imagens de células vivas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como as proteínas são organizadas em nanoescala em membranas celulares vivas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como configurar seu próprio microscópio FAR e usá-lo para adquirir dados.

Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso e o treinamento de segurança deve ser concluído antes de tentar este procedimento.