Name: Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Aprenda a técnica FPALM para imagem multicolor de proteínas em células fixas ou vivas com precisão nanométrica. Este método permite localizar milhares de moléculas individualmente, superando o limite de difração da microscopia convencional.

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Os autores gostariam de agradecer a Philip Andresen, Matthew Parent e Sean Carter pela programação de computadores, assistência técnica e conversas úteis e Pat Byard pela assistência administrativa. Este trabalho foi financiado pelo NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 e 2061 e Maine Economic Improvement Fund.

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
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<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
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<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

STH e MJM detêm patentes em microscopia de super-resolução. STH atua no conselho consultivo científico da Vutara, Inc.

A imagem de super-resolução baseada em localização fornece muitos recursos poderosos para imagens biológicas. A rota de componentes ópticos individuais colocados na mesa para um microscópio funcional de super-resolução capaz de obter imagens simultâneas de várias espécies fluorescentes em uma amostra biológica apresenta uma série de desafios. Alguns aspectos do alinhamento são mais críticos do que outros; Nós nos esforçamos abaixo para fornecer orientação aos usuários em potencial que lidam com os aspectos mais difíceis ...

Embora existam estruturas celulares em uma ampla gama de escalas espaciais, a imagem de fluorescência da organização celular em escalas de comprimento menores que ~250 nm é restrita na microscopia convencional devido à restrição física do limite de difração. Esse limite foi superado com o advento da microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM1) e técnicas semelhantes2,3, que podem localizar um grande número de moléculas individuais com precisão de ~ 10 nm, para gerar imagens com resolução de algumas dezenas de nanômetros. O FPALM é baseado no uso de controle óptico para ativar e inativar subconjuntos de moléculas (para uma descrição completa do FPALM e instruções sobre como implementar esse sistema de imagem, consulte Gould et al.4). Esta técnica permite que as distribuições espaciais de populações inteiras de moléculas únicas sejam mapeadas, elucidando assim estruturas biológicas em escalas de comprimento que variam de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. A microscopia de super-resolução baseada em localização (doravante denominada microscopia de localização) foi agora adaptada para abordar uma série de questões biológicas, com desenvolvimentos tecnológicos permitindo, por exemplo, a imagem de orientações moleculares individuais com polarização FPALM, ou P-FPALM5, a imagem de fluorescência de moléculas únicas em três dimensões com Biplane FPALM6 ou outras técnicas7-9e a imagem de fluorescência de super-resolução de moléculas únicas em células vivas10-12. A microscopia de localização também foi aplicada à imagem de várias espécies em células fixas13-16. Recentemente, três espécies de proteínas foram simultaneamente visualizadas com FPALM em células fixas e vivas17. A microscopia de localização pode obter imagens de amostras marcadas de várias maneiras: exemplos incluem proteínas expressas com etiquetas de fusão PAFP ou PSFP, anticorpos ou moléculas marcadas com corantes orgânicos enjaulados ou corantes orgânicos convencionais. Embora o uso de corantes fluorescentes convencionais permita a marcação de proteínas na ausência de uma etiqueta de proteína de fusão, as condições geralmente exigidas para o uso de corantes orgânicos não enjaulados em imagens de super-resolução exigem que as amostras sejam imersas em tampões redutores2. Além disso, a entrega intracelular de conjugados anticorpo-corante normalmente requer que as células sejam fixadas e suas membranas permeabilizadas, ou requer que as células vivas sejam permeáveis por eletroporação ou algum outro meio. Os requisitos para reduzir as condições de tampão e permeabilização da membrana limitam a adequação dos corantes orgânicos para imagens de células vivas, embora desenvolvimentos recentes tenham permitido o uso efetivo de HaloTags e FPALM para imagens de estruturas de membrana18.
FPALM foi a primeira técnica de microscopia de localização a ser aplicada a células vivas10. Em células vivas, além de fornecer um mapa espacial dependente do tempo das localizações das moléculas marcadas, o FPALM pode rastrear moléculas únicas em vários quadros e trajetórias moleculares determinadas em escalas de tempo de milissegundos19. Assim, o FPALM fornece acesso a escalas de tempo bastante curtas e resolução em nanoescala.
O FPALM multicolorido pode ser usado para uma variedade de sondas diferentes, incluindo proteínas fotoativáveis e corantes orgânicos enjaulados ou não enjaulados. Aqui fornecemos detalhes sobre o protocolo e a configuração para a imagem simultânea de duas espécies de proteínas fluorescentes, Dendra2 e PAmCherry. Relatamos os resultados da imagem de PAmCherry conjugada à beta actina (PAmCherry-actina) e Dendra2 conjugada à hemaglutinina influenza (Dendra2-HA) em fibroblastos NIH-3T3. Os componentes descritos na configuração podem ser trocados por outro hardware mais adequado para a imagem de outras sondas. Quando for esse o caso, tentamos ser explícitos no texto.
Multicolor FPALM é ideal para relatar as distribuições espaciais de várias espécies de proteínas em células vivas ou fixas. Esta técnica é especialmente adequada para investigar relações espaciais e/ou dinâmicas em escalas espaciais de comprimento nanométrico, embora as imagens relatem a localização em uma variedade de escalas de comprimento, de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. Uma grande vantagem do FPALM multicolorido é que a configuração é relativamente barata de construir e muito flexível para uso com várias combinações de sondas. O processo de construção e calibração do sistema a partir de componentes também fornece uma compreensão considerável dos fatores que podem comprometer a qualidade e a interpretabilidade dos dados e, portanto, o resultado da pesquisa. Detalhamos aqui os métodos para a configuração óptica, preparação de amostras e aquisição de dados de várias espécies de proteínas, com construções de fusão PSFP e PAFP, usando FPALM. Embora este protocolo descreva a análise de células fixas, esses procedimentos são prontamente aplicáveis à imagem de células vivas.
A configuração óptica aqui descrita é ideal para a aquisição simultânea de imagens do PSFP Dendra2 e do PAFP PAmCherry. Muitas outras sondas podem ser usadas para imagens multicoloridas; no entanto, os componentes precisos necessários podem variar, dependendo dos espectros de excitação e emissão das sondas escolhidas. As escolhas de espelhos dicróicos, filtros e comprimentos de onda de laser devem ser feitas com base nessas considerações.

<table><tbody><tr><td>Câmaras LabTek II</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Contas fluorescentes</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>Esferas para calibração</td></tr><tr><td>Contas Tetraspeck</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>Quatro contas de cores para calibração</td></tr><tr><td>Óleo de imersão de objetiva</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>Óleo de imersão para objetiva de alta NA (dependendo da escolha da objetiva)</td></tr> <tr><td>Água HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>Media</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Ou Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>soro</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td>1689149</tr> <tr><td>paraformaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>CUIDADO: Tóxico</td></tr></tbody></table>

simultânea multicolor imagem de estruturas biológicas com fluorescência fotoativação localização microscopia

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

A microscopia de super-resolução baseada em localização pode ser aplicada para obter um mapa espacial (imagem) da distribuição de moléculas individuais marcadas com fluorescência dentro de uma amostra com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros. Usando proteínas fluorescentes fotoativáveis (PAFP) ou fotocomutáveis (PSFP) fundidas a proteínas de interesse, ou corantes orgânicos conjugados a anticorpos ou outras moléculas de interesse, a microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM) pode obter imagens simultâneas de várias espécies de moléculas dentro de células únicas. Usando a abordagem a seguir, populações de um grande número (milhares a centenas de milhares) de moléculas individuais são visualizadas em células individuais e localizadas com uma precisão de ~ 10-30 nm. Os dados obtidos podem ser aplicados para entender as distribuições espaciais em nanoescala de vários tipos de proteínas dentro de uma célula. Uma das principais vantagens dessa técnica é o aumento dramático na resolução espacial: enquanto a difração limita a resolução a ~ 200-250 nm na microscopia de luz convencional, o FPALM pode dimensionar o comprimento da imagem em mais de uma ordem de magnitude menor. Como muitas hipóteses biológicas dizem respeito às relações espaciais entre diferentes biomoléculas, a resolução aprimorada do FPALM pode fornecer informações sobre questões de organização celular que antes eram inacessíveis à microscopia de fluorescência convencional. Além de detalhar os métodos de preparação de amostras e aquisição de dados, descrevemos aqui a configuração óptica do FPALM. Uma consideração adicional para os pesquisadores que desejam fazer microscopia de super-resolução é o custo: as configurações internas são significativamente mais baratas do que a maioria das máquinas de imagem disponíveis comercialmente. As limitações dessa técnica incluem a necessidade de otimizar a marcação de moléculas de interesse em amostras de células e a necessidade de software de pós-processamento para visualizar os resultados. Descrevemos aqui o uso da expressão de PAFP e PSFP para obter imagens de duas espécies de proteínas em células fixas. A extensão da técnica para células vivas também é descrita.

A hemaglutinina (HA) da gripe forma aglomerados na ordem de dezenas de nanômetros a micrômetros, e esses aglomerados colocalizam-se variavelmente com a actina (Figura 5). Essas distribuições espaciais corroboram imagens em escala mais ampla dessas duas proteínas28 e a dependência das distribuições espaciais da HA em relação à actina19. Imagens multicoloridas de FPALM podem ser ainda utilizadas para descrever a densidade, área e perímetro desses aglomerados, bem como o grau de coloca...

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de múltiplas espécies proteicas simultaneamente com precisão de nanômetro em células fixadas ou vivas. Isso é realizado primeiramente ajustando a posição de uma câmera e da óptica até que uma imagem focalizada do microscópio seja projetada sobre o sensor da câmera. O segundo passo consiste em alinhar os feixes de laser para que sejam direcionados precisamente sobre a amostra localizada na platina do microscópio.Em seguida, a amostra celular preparada é iluminada e uma célula que expressa as proteínas desejadas é selecionada. O passo final consiste em obter uma imagem da célula por microscopia de localização por ativação fotofluorescente, iluminando a amostra com lasers e, em seguida, direcionando a fluorescência celular para o sensor da câmera a fim de adquirir um conjunto de dados. Em última análise, a microscopia de localização por ativação fotofluorescente é utilizada para demonstrar a localização de múltiplas espécies proteicas em escala espacial de nanômetro em células fixadas ou vivas, tanto em campo amplo quanto ao utilizar fluorescência por reflexão interna total para isolar uma região fina da amostra.A principal vantagem

simultaneous-multicolor-imaging-biological-structures-with

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Biology

Biologia

Este vídeo descreve o BiFC-PALM ― uma combinação de microscopia de localização fotoativada e complementação de fluorescência bimolecular ― para avaliar as interações proteína-proteína. BiFC envolve a fusão de dois fragmentos de proteína fluorescente com duas proteínas de interesse que interagem. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos são aproximados, o que permite que as duas partes se juntem e reconstituam uma proteína fluorescente funcional. A fluorescência de um único fluoróforo é...

Microscopia de localização fotoativada acoplada à complementação de fluorescência bimolecular

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Demonstamos um método para imagem de múltiplas moléculas dentro de nanoestruturas heterogêneas com precisão de molécula única usando ligação sequencial e eluição de anticorpos marcados fluorescentemente.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Este protocolo apresenta um guia passo a passo para a técnica microscópica multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (SLAM), incluindo detalhes sobre como gerar a fonte de luz laser, preparar uma amostra de tecido, realizar imagens e analisar os dados. O SLAM avança a microscopia não linear medindo quatro contrastes complementares sem marcação para investigar o microambiente do tecido.

Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho eficiente para microscopia de localização de molécula única em núcleos isolados de Arabidopsis, utilizando isolamento, fixação e marcagem otimizados para alcançar visualização confiável em nanoescala da cromatina e da RNA Polimerase II. Essa abordagem pode ser facilmente adaptada a outras proteínas associadas à cromatina ou modificações de histonas para imagens de alta resolução.

Um Protocolo Simplificado para Microscopia de Localização de Molécula Única em Núcleos de Arabidopsis

Aprenda a técnica FPALM para imagem multicolor de proteínas em células fixas ou vivas com precisão nanométrica. Este método permite localizar milhares de moléculas individualmente, superando o limite de difração da microscopia convencional.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

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