Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de múltiplas espécies proteicas simultaneamente com precisão de nanômetro em células fixadas ou vivas. Isso é realizado primeiramente ajustando a posição de uma câmera e da óptica até que uma imagem focalizada do microscópio seja projetada sobre o sensor da câmera. O segundo passo consiste em alinhar os feixes de laser para que sejam direcionados precisamente sobre a amostra localizada na platina do microscópio.

Em seguida, a amostra celular preparada é iluminada e uma célula que expressa as proteínas desejadas é selecionada. O passo final consiste em obter uma imagem da célula por microscopia de localização por ativação fotofluorescente, iluminando a amostra com lasers e, em seguida, direcionando a fluorescência celular para o sensor da câmera a fim de adquirir um conjunto de dados. Em última análise, a microscopia de localização por ativação fotofluorescente é utilizada para demonstrar a localização de múltiplas espécies proteicas em escala espacial de nanômetro em células fixadas ou vivas, tanto em campo amplo quanto ao utilizar fluorescência por reflexão interna total para isolar uma região fina da amostra.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia confocal ou eletrônica, é que é possível obter imagens de múltiplas proteínas simultaneamente com resolução de nanômetros em células fixadas ou vivas. Os seguintes passos referem-se a um sistema de numeração mostrado aqui, que é um esquema para a configuração multicolorida F Om fornecido como figura um no protocolo de texto complementar para alinhar o microscópio, começando por colocar uma escala de calibração ou um radical na platina do microscópio com uma objetiva de 10 x no lugar e a lâmpada ajustada para luz transmitida. Centralize o elemento vertical no centro do campo de visão.

Em seguida, ajuste o microscópio para iluminação de Kohler fechando a abertura de campo e observando através das oculares na vertical. Se as bordas da abertura de campo estiverem desfocadas, ajuste a altura do condensador até que tanto a abertura de campo quanto o retículo estejam em foco. Em seguida, ajuste a posição lateral da abertura de campo até que ela esteja centralizada em relação ao campo de visão e feche a abertura de campo até que apenas a grade central no retículo esteja iluminada.

Na primeira vez que esses componentes forem montados, ajuste os comprimentos de percurso de cada canal para que sejam iguais. Para realizar este procedimento, desloque o laser para o chip da câmera ajustando os espelhos sete e nove e feche o diafragma de detecção para evitar sobreposição espacial entre os dois canais. Em seguida, foque a imagem do radical no canal de luz refletida e verifique se ela também está em foco no canal de luz transmitida.

Se a imagem no canal de luz transmitida não estiver em foco, desloque o espelho nove até que a imagem do radical esteja focada simultaneamente em ambos os canais. Inicie o alinhamento dos lasers removendo a lente um do trajeto do laser e bloqueando os feixes de ativação e leitura. Em seguida, coloque um cartão branco encostado contra o espelho quatro, abra o obturador do microscópio e foque até que a imagem do radical seja projetada no cartão diante do espelho quatro.

Em seguida, desbloqueie o feixe de leitura e ajuste o espelho um para centralizar o laser de leitura nas cruzetas da imagem do radical no espelho quatro. Uma vez centralizado, projete a imagem do radical no espelho cinco e ajuste o espelho quatro até que o feixe esteja centralizado nas cruzetas da imagem do espelho cinco. O feixe de leitura agora deve estar centralizado tanto no M quatro quanto no M cinco.

Em seguida, bloqueie o feixe de leitura fechando o obturador um. Depois, projete a imagem do radical no espelho três. Remova o expansor de feixe do trajeto do laser e desbloqueie o laser de ativação.

Agora, ajuste o espelho dois para centralizar o feixe de ativação sobre as cruzetas da imagem do radical no espelho três. Uma vez centralizado, substitua o expansor de feixe entre os espelhos dois e três e ajuste a posição do expansor de feixe até que o feixe esteja centralizado nas cruzetas da imagem do radical. No espelho três, projete a imagem do radical sobre o espelho cinco e foque.

Usando o botão de foco do microscópio, ajuste o ângulo do espelho dicróico número um até que o feixe de ativação esteja centralizado na imagem vermelha. Em seguida, bloqueie o laser de ativação fechando o obturador dois, sem objetiva no lugar e com o obturador do microscópio aberto. Abra o obturador de leitura, obturador um, e projete o laser através da abertura traseira do microscópio.

Ajuste o espelho cinco até que o feixe saia do microscópio, de modo que o feixe saia verticalmente do microscópio com a lente um e a objetiva recolocadas. Coloque uma amostra contendo 100 micromolar de bromo B sobre a platina com o laser de ativação bloqueado. Projete o laser de leitura através de uma objetiva de 60 x e dentro do corante.

Com o ganho de multiplicação de elétrons desativado. Envie esta imagem para a câmera. Em seguida, foque o objetivo no interior da amostra.

Abra a abertura o suficiente para permitir a aquisição do perfil completo do feixe. Em seguida, desloque a abertura lateralmente de modo que o centro do perfil do feixe e a abertura fiquem concêntricos. Utilizando o software da câmera, selecione a região de interesse para permitir a menor região de leitura da câmera que englobe ambos os canais e registre essas coordenadas.

Neste momento, registre uma única imagem para representar o perfil do feixe de leitura. Em seguida, bloqueie o laser de leitura fechando o obturador um e abra o obturador dois. Para iniciar a medição do perfil do feixe de ativação, projete o laser de ativação na amostra; se necessário, utilize um ganho multiplicador de elétrons inferior a 100 e ajuste o primeiro espelho dicróico até que o feixe esteja centralizado em cada campo de visão.

Em seguida, registre uma imagem instantânea do perfil do feixe de ativação para iniciar a aquisição de imagens multicoloridas de F palm. Elimine toda a iluminação ambiente. Em seguida, projete a lâmpada de mercúrio, por meio do suporte basculante, sobre as células transfectadas e troque o cubo de filtros por um que contenha o comprimento de onda de excitação apropriado do estado pré-alteração fotoinduzida.

Uma vez escolhida uma célula, mova o suporte invertido para baixo para permitir que os lasers passem para o microscópio e altere a torreta de filtros para aquela que contém o espelho dicromático apropriado para a imagem, conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, projete esta imagem na câmera para distinguir as células transfectadas da fluorescência de fundo e confirmar que as moléculas são passíveis de fotoativação. Ilumine brevemente a amostra com uma potência baixa inferior a 10 microwatts proveniente do laser de ativação.

Em seguida, prepare o software da câmera para a aquisição de séries cinéticas configurando o ganho de multiplicação eletrônica para 200 e o número desejado de quadros entre cinco e 10.000. Também defina a exposição entre 10 e 30 milissegundos. Em seguida, bloqueie o feixe de ativação, desbloqueie o feixe de leitura e projete a imagem da célula iluminada na câmera.

Escolha um plano focal próximo à membrana celular inferior movendo o foco para baixo até que as moléculas individuais deixem de ser visíveis. Em seguida, mova gradualmente o foco para cima até que as moléculas se tornem visíveis pela primeira vez. Agora, desbloqueie o feixe de ativação e ilumine a amostra com intensidade inferior a um watt por centímetro quadrado.

Comece a adquirir esses dados por meio do software da câmera, mantendo uma densidade de 0,1 a uma molécula fotográfica visível por micrômetro quadrado, ajustando dinamicamente o filtro de densidade neutra diante do laser de ativação. Para a montagem de imagem por fluorescência de reflexão interna total, fixe o espelho cinco e a lente um sobre uma única plataforma de translação, que será movida lateralmente logo atrás da entrada do microscópio. À medida que o espelho cinco e a lente um são transladados, os lasers que saem do objetivo para cima através da amostra irão gradualmente inclinar-se para um lado; continue transladando a plataforma até que o ângulo dos lasers atinja 90 graus em relação à vertical.

Neste ponto, o próprio laser emergente desaparecerá e o laser incidente será refletido de volta para a abertura, viajando em sentido anti-paralelo ao feixe incidente e deslocado para o lado. Você deverá observar uma redução no fundo quando a amostra entrar em fluorescência por reflexão interna total após a conclusão das aquisições de imagem; imediatamente feche o obturador do microscópio e bloqueie ambos os feixes. Desative o ganho de multiplicação eletrônica.

Configure a câmera para gravar um quadro e defina a região de leitura da câmera no tamanho máximo. Por fim, bloqueie um canal colocando um cartão sobre F três ou F quatro com um filtro de passagem longa montado na lâmpada do microscópio. Ilumine a amostra e projete esta imagem na câmera.

Registre uma imagem da célula para representar toda a célula em luz transmitida. Aqui é mostrado um exemplo de aquisição F palm de duas cores de uma célula NIH três T três expressando tanto DENDRA dois Hemaglutinina quanto PAM Cherry actina. O canal transmitido à esquerda contém comprimentos de onda mais longos do que o canal refletido à direita.

Mostram-se aqui imagens do mesmo processo de aquisição em duas cores de microscopia de fluorescência após subtração do fundo e transformação para sobreposição dos canais esquerdo e direito. Moléculas individuais podem ser identificadas e localizadas. Algumas moléculas aparecem mais brilhantes no canal transmitido e outras apresentam uma distribuição mais uniforme da emissão entre os dois canais.

Isso indica a diferença nos espectros de emissão entre o PAM cherry e o DENDRA dois, respectivamente, e é utilizado na análise para identificar essas duas espécies. O histograma mostrado aqui indica uma razão entre a intensidade do canal vermelho transmitido e a intensidade total para todas as moléculas localizadas após a aplicação das tolerâncias. Os pixels aparecem brancos na imagem inferior esquerda e aparecem vermelhos na imagem final sobreposta, mostrada na parte inferior direita, onde aqueles na região verde são mostrados como brancos na imagem superior direita e aparecem verdes na imagem final sobreposta mostrada na parte inferior direita.

Os níveis de limiar escolhidos durante a renderização afetam significativamente o grau de ruído e a aparência da colocalização mostrada. Aqui estão três opções diferentes de renderização que resultam em variados graus de vazamento, sendo que os níveis de limiar mais conservadores são mostrados nos dois últimos. Os histogramas de cor F palm alfa são os mais adequados para interpretação quando há dois picos distintos na imagem.

Embora o histograma à esquerda seja um bom candidato para análises posteriores, as imagens resultantes dos outros dois histogramas serão muito mais difíceis de interpretar seguindo este procedimento. Métodos como reflexão interna total, microscopia e imagem de células vivas podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a forma como as proteínas são organizadas em escala nanométrica nas membranas de células vivas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar seu próprio microscópio FAR e utilizá-lo para adquirir dados.

Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso, e o treinamento de segurança deve ser concluído antes de tentar este procedimento.