A Materials Guided Approach Triagem de Desenvolvimento de quantitativos Sol-gel derivados de microarrays de proteína

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos materiais à base de gel soul para fabricação de microarrays e usá-los para ensaios enzimáticos de nano volume. Isso é feito identificando primeiro os materiais que têm tempos de ação suficientemente longos para evitar o congelamento no pino de impressão do microarray durante o processo de impressão. O segundo passo é avaliar materiais com longos tempos de ação quanto à sua capacidade de imprimir como microarrays, reprodutibilidade, resistência a rachaduras, qualidade de adesão, separação de fases indesejável e, finalmente, alta atividade para enzimas aprisionadas.

Em seguida, a enzima de interesse é impressa como um microarray usando os materiais ideais e sua capacidade de detectar a solução do ensaio e gerar uma resposta enzimática mensurável é testada. A etapa final é avaliar os materiais quanto à sua capacidade de fornecer ensaios altamente reprodutíveis usando a enzima de interesse e gerar dados quantitativos. O material final para a fabricação da matriz é então escolhido.

Em última análise, os microarrays de proteínas derivadas do soul gel são usados para identificar pequenas moléculas que reduzem a atividade enzimática. A principal vantagem desse método sobre os métodos existentes, como a triagem baseada em placas, é que você pode rastrear um grande número de materiais de maneira sistemática muito rapidamente, usando baixos volumes de reagentes. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque é possível ter gel de materiais dentro dos pinos de impressão.

Se estes forem limpos adequadamente, isso resultará em pontos perdidos que podem ser interpretados como materiais não imprimíveis. Para começar, prepare as inúmeras soluções aditivas conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Muitas das soluções podem ser pré-fabricadas e armazenadas por até um mês ou mais nas condições corretas, mas algumas devem ser feitas no dia do experimento.

Misture as serras à base de silicato de sódio imediatamente antes de usar e certifique-se de mantê-las no gelo. O SOS deve ser usado dentro de uma hora após a adição da água, pois períodos de espera mais longos resultam em tempos de DATION reduzidos e inconsistentes. Em seguida, prepare várias combinações de tampões, polímeros de salans e faixas de órgãos, conforme indicado no protocolo de texto que acompanha, a fim de identificar quais combinações podem ser usadas como material imprimível com tempos de dilatação superiores a 2,5 horas.

Uma vez que várias combinações tenham sido identificadas, defina a umidade dentro da câmara de impressão para 80 a 90% umidade inferior a 80% pode resultar em evaporação da amostra e inconsistências na impressão devido aos pequenos volumes de deposição com a impressora. Agora pronto, organize os padrões de matriz a serem impressos usando o programa Chip Writer Pro. Defina o deslocamento na direção XY para 10 milímetros por segundo e a velocidade de aproximação da amostra na direção Z para dois milímetros por segundo com o tempo de carregamento da amostra de 2,5 segundos usando as combinações de gel de serra identificadas anteriormente.

Prepare 25 microlitros dos materiais de base combinando polímeros correspondentes, organo pistas e aditivos de moléculas pequenas identificados por meio do processo de pré-triagem. Usando pilhas milimolares de 50 milimolares com pH de 8,0 em poços individuais de uma placa de microtitulação de 384 poços. Em seguida, sonicar até quatro pinos de bainha com fenda de 100 mícrons de diâmetro em água bidestilada

Após 15 minutos, experimente-os sob um jato de nitrogênio. Em seguida, use um limpador de cachimbo para remover a umidade residual de dentro do porta-pinos e coloque cuidadosamente o pino na cabeça de impressão do robô de impressão de pinos de contato. A falha em remover a umidade residual pode impedir que o pino se mova livremente com o suporte, resultando em pontos perdidos.

Em seguida, adicione 25 microlitros do respectivo SA ao poço imediatamente antes da impressão. Misture a solução usando um movimento de pipetagem para cima e para baixo Repetido 50 vezes ao misturar com pipeta. Minimize a quantidade de ar incorporada à solução.

As bolhas de ar impedem o carregamento completo da amostra dentro do pino. Em seguida, carregue o pino abaixando-o na amostra. Depois que os pinos forem carregados, inicie o processo de impressão e imprima a amostra em uma superfície de lâmina.

Pause o processo de impressão antes de adicionar sal à placa de origem subsequente. Bem, com o processo pausado, remova o pino de impressão usando um ímã e coloque um limpador de cachimbo no cabeçote de impressão para evitar o acúmulo de umidade no cabeçote de impressão. Em seguida, enxágue o pino de impressão com água bidestilada e sonice-o em água limpa bidestilada por 30 segundos.

Em seguida, seque o pino de impressão sob um jato de nitrogênio e coloque o pino de volta na cabeça de impressão. Continue misturando, imprimindo e limpando todas as amostras restantes dentro da placa de origem até 12.000 pontos, 100 mícrons de diâmetro podem ser depositados em uma única lâmina. Quando a impressão estiver concluída, envelheça a matriz por no mínimo 30 minutos e até 24 horas dentro da câmara de impressão com 80 a 90% de umidade.

Prepare 50 microlitros do controle positivo imediatamente antes do uso, combinando 25 microlitros de um milimolar, iodeto de acetilcolina e 0,14 microlitros de cinco milimolares bodi pi, cisteína FIL e 25 milimolares tris a pH 7,0 com 4% de glicerol no poço de uma placa de microtitulação de 384 poços pipeta a solução para cima e para baixo lentamente para misturar sem criar bolhas. Em seguida, prepare os controles negativos antes do uso, combinando 0,14 microlitros de cinco cisteína PI FIL de cinco milimolares a 49,86 microlitros de 25 milimolares triss a pH 7,0 com 4% de glicerol em outro poço de uma placa de micro titulação de 384 poços e misture-os suavemente sobre a impressão dos controles nos microarrays envelhecidos usando os mesmos processos descritos na seção anterior. No entanto, em vez dos pinos de 100 mícrons de diâmetro, você encaixou os pinos principais com um diâmetro de 235 mícrons.

Isso garante que as soluções cubram completamente os pontos previamente depositados. As manchas envelhecem as matrizes em 80 a 90% de umidade por uma hora em temperatura ambiente devido à auto-hidrólise da acetilcolina. Tempos de incubação mais longos podem resultar em falsos positivos devido ao aumento da atividade enzimática.

Certifique-se de que o gerador de imagens de matriz nova alfa innotech esteja ligado e equipado com um filtro de excitação de 478 mais ou menos 17 nanômetros e um filtro de emissão de 538 mais ou menos 21 nanômetros para medição dos microarrays de acetilcolina esterase. Em seguida, coloque o slide no suporte do slide com as manchas voltadas para cima. Defina o número de seções de visualização para que pelo menos uma de cada lado da lâmina do microscópio seja visualizada com uma resolução mínima de quatro micrômetros usando a exposição automática.

Assim que os parâmetros forem considerados aceitáveis, adquira uma imagem de slide e salve-a como um arquivo TIFF. Em seguida, abra a imagem do slide adquirida na imagem J 64. Clique na Ferramenta Seleção Oval e selecione cada ponto.

Selecione uma região ligeiramente maior do que o ponto observado e certifique-se de usar um tamanho consistente entre os pontos para reduzir a subjetividade da imagem J.Em seguida, meça a intensidade do sinal de cada ponto usando a opção de medição. Na guia de análise. Calcular a média da intensidade de 25 pontos de controlo positivo semelhantes e dividir pela intensidade média de 25 pontos de controlo negativo semelhantes para obter o controlo positivo e os rácios de controlo negativo para as composições de materiais individuais.

Aqui é mostrado um exemplo da faixa dinâmica dos microarrays resultantes preparados usando esses métodos. Os controles altos resultaram em regiões verdes brilhantes, enquanto os controles baixos resultaram em pontos muito mais escuros. A intensidade medida pela imagem J 64 mostra que os controles altos têm uma média de cerca de 22.000 unidades fluorescentes relativas, e os controles baixos têm uma média de cerca de 8.000.

As linhas pontilhadas representam três desvios padrão da média. Aqui estão exemplos de microarrays para uma triagem de matriz de honra de análogos sintéticos de alcalóides ameral sier identificados como composto um e composto dois. Ambos os eixos representam a porcentagem da enzima determinada pelo sinal fluorescente.

Em duplicata, a proximidade dos pontos com a diagonal representa alta reprodutibilidade do ensaio. Os gráficos IC 50 de dois inibidores de potencial diferentes são mostrados aqui. O composto um resultou em um nível de IC 50 de 16 micromolares, enquanto o IC 50 do composto dois foi de 21 micromolares Pontos representativos são exibidos acima para ilustrar diferenças no sinal proporcional às concentrações de inibidores.

A matriz mostrada aqui foi impressa com quatro quinases diferentes, P 38 map quinase, EGFR e GSK, e foi sobreimpressa com tampão sozinho contendo A TP e tampão contendo A TP e starro esporina um inibidor da atividade enzimática. Os resultados mostram um efeito significativo do inibidor de quinase starro sporin com base nas intensidades de fluorescência resultantes, conforme descrito aqui. A maior diferença observada na concentração de stor sporin usada aqui foi dos pontos P 38.

Aqui, são mostrados pontos representativos de um microarray P 30 8:00 AM BP, que foram supermanchados com concentrações variadas de stors Conforme indicado, o IC 50 desta molécula foi determinado como sendo um micromolar e é mostrado no gráfico à direita Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em poucas horas se for realizada corretamente Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como imunoensaios ou ensaios de interação proteica, também podem ser feitos para responder a perguntas adicionais relacionadas ao diagnóstico ou à descoberta de pequenas moléculas.