A Materials Guided Approach Triagem de Desenvolvimento de quantitativos Sol-gel derivados de microarrays de proteína

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos materiais baseados em gel de soul para a fabricação de microarranjos e utilizar esses materiais em ensaios enzimáticos de volume nanométrico. Isso é alcançado primeiro por meio da identificação de materiais que apresentem tempos de ativação suficientemente longos para evitar a gelificação na ponta de impressão do microarranjo durante o processo de impressão. O segundo passo consiste em avaliar materiais com longos tempos de ativação quanto à sua capacidade de serem impressos como microarranjos com reprodutibilidade, resistência ao trincamento, qualidade de adesão, ausência de separação de fases indesejável e, finalmente, alta atividade para enzimas imobilizadas.

Em seguida, a enzima de interesse é impressa como um microarranjo utilizando os materiais ideais, e sua capacidade de sobrepor o ponto da solução do ensaio e gerar uma resposta enzimática mensurável é testada. O passo final consiste em avaliar os materiais quanto à sua capacidade de fornecer ensaios altamente reprodutíveis com a enzima de interesse e gerar dados quantitativos. O material final para a fabricação do arranjo é então escolhido.

Por fim, microarranjos de proteínas derivados de géis de alga são utilizados para identificar moléculas pequenas que reduzem a atividade enzimática. A principal vantagem deste método em comparação com métodos existentes, como triagem baseada em placas, é a possibilidade de analisar um grande número de materiais de maneira sistemática e muito rápida, utilizando baixos volumes de reagentes. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque é possível que os materiais gelifiquem dentro das ponteiras de impressão.

Se esses forem então limpos adequadamente, isso resultará em áreas não cobertas que podem ser interpretadas como materiais não imprimíveis. Para começar, prepare as diversas soluções aditivas conforme descrito no protocolo textual complementar. Muitas das soluções podem ser preparadas previamente e armazenadas por até um mês ou mais sob as condições adequadas, mas algumas devem ser preparadas no dia do experimento.

Misture as serras à base de silicato de sódio imediatamente antes do uso e certifique-se de mantê-las em gelo. O SOS deve ser usado dentro de uma hora após a adição da água, pois períodos de espera mais longos resultam em tempos de DATION reduzidos e inconsistentes. Em seguida, prepare várias combinações de tampões, polímeros salans e vias orgânicas conforme indicado no protocolo de texto acompanhante, a fim de identificar quais combinações podem ser usadas como material imprimível com tempos de dilatação superiores a 2,5 horas.

Uma vez identificadas diversas combinações, ajuste a umidade dentro da câmara de impressão para entre 80 e 90%. Uma umidade inferior a 80% pode resultar em evaporação da amostra e inconsistências na impressão, devido aos pequenos volumes de deposição com a impressora. Agora, com tudo preparado, organize os padrões de matriz a serem impressos utilizando o programa Chip Writer Pro. Defina a velocidade de deslocamento nas direções XY para 10 milímetros por segundo e a velocidade de aproximação da amostra na direção Z para dois milímetros por segundo, com um tempo de carregamento da amostra de 2,5 segundos, usando as combinações de gel de serra identificadas anteriormente.

Prepare 25 microlitros dos materiais básicos combinando os polímeros correspondentes, organossilanos e aditivos de molécula pequena identificados por meio do processo de pré-seleção. Utilize tampões de 50 milimolares com pH de 8,0 em poços individuais de uma placa de microtitulação de 384 poços. Em seguida, sonique até quatro pinos de bainha ranhurados de diâmetro de 100 mícrons em água bidestilada.

Após 15 minutos, teste-os sob um fluxo de nitrogênio. Em seguida, utilize um limpador de tubos para remover a umidade residual do interior do suporte do pino e coloque cuidadosamente o pino na cabeça de impressão do robô de impressão por contato com pinos. A falha em remover a umidade residual pode impedir que o pino se mova livremente com o suporte, resultando em pontos não impressos.

Em seguida, adicione 25 microlitros do respectivo SA ao poço imediatamente antes da impressão. Misture a solução utilizando um movimento de pipetagem para cima e para baixo, repetido 50 vezes durante a mistura com pipeta. Minimize a quantidade de ar incorporada à solução.

As bolhas de ar impedem o carregamento completo da amostra dentro do pino. Em seguida, carregue o pino abaixando-o na amostra. Uma vez carregados os pinos, inicie o processo de impressão e imprima a amostra sobre uma superfície de lâmina.

Pare o processo de impressão antes de adicionar sal à placa fonte subsequente. Bem, com o processo pausado, remova o pino de impressão usando um ímã e coloque um limpa-tubos na cabeça de impressão para evitar o acúmulo de umidade na mesma. Em seguida, enxágue o pino de impressão com água duplamente destilada e submeta-o à ultrassonicação em água duplamente destilada limpa por 30 segundos.

Em seguida, seque o pino de impressão sob um fluxo de nitrogênio e, depois, recoloque o pino na cabeça de impressão. Continue misturando, imprimindo e limpando todos os amostras restantes na placa de origem; até 12.000 pontos, com 100 micrômetros de diâmetro, podem ser depositados em um único lâmina. Após a conclusão da impressão, envelheça o arranjo por um mínimo de 30 minutos e até 24 horas dentro da câmara de impressão, a uma umidade de 80 a 90%.

Prepare 50 microlitros do controle positivo logo antes do uso, combinando 25 microlitros de iodeto de acetilcolina a um milimolar, 0,14 microlitros de bodi pi, cisteína FIL, e tris a 25 milimolar em pH 7,0 com 4% de glicerol no poço de uma placa de microtitulação de 384 poços; pipete a solução lentamente para cima e para baixo para misturar, sem criar bolhas. Em seguida, prepare os controles negativos logo antes do uso, combinando 0,14 microlitros de boai PI FIL cisteína a cinco milimolar com 49,86 microlitros de triss a 25 milimolar em pH 7,0 com 4% de glicerol em outro poço de uma placa de microtitulação de 384 poços e misture suavemente. Imprima os controles nos microarranjos envelhecidos utilizando os mesmos procedimentos descritos na seção anterior. No entanto, em vez de pinos com diâmetro de 100 micrômetros, utilize pinos ranhurados com diâmetro de 235 micrômetros.

Isso garante que as soluções cubram completamente os pontos previamente depositados. Incube as matrizes em umidade de 80 a 90% por uma hora à temperatura ambiente devido à auto-hidrólise da acetilcolina. Tempos de incubação mais longos podem resultar em falsos positivos devido ao aumento da atividade enzimática.

Certifique-se de que o leitor de microarranjos Alpha Innotech Novo está ligado e equipado com um filtro de excitação de 478 mais ou menos 17 nanômetros e um filtro de emissão de 538 mais ou menos 21 nanômetros para a medição dos microarranjos de acetilcolinesterase. Em seguida, coloque a lâmina no porta-lâminas com as manchas voltadas para cima. Defina o número de seções de pré-visualização de modo que pelo menos uma em cada lado da lâmina do microscópio seja pré-visualizada com uma resolução mínima de quatro micrômetros utilizando exposição automática.

Uma vez que os parâmetros sejam considerados aceitáveis, adquira uma imagem do lâmina e salve-a como um arquivo TIFF. Em seguida, abra a imagem da lâmina adquirida no ImageJ 64. Clique na Ferramenta de Seleção Oval e selecione cada ponto.

Selecione uma região ligeiramente maior que o ponto observado e certifique-se de usar um tamanho consistente entre os pontos para reduzir a subjetividade do ImageJ. Em seguida, meça a intensidade do sinal de cada ponto utilizando a opção de medição, na guia Analyze. Calcule a média da intensidade de 25 pontos de controle positivo semelhantes e divida pelo valor médio da intensidade de 25 pontos de controle negativo semelhantes para obter as razões entre controle positivo e controle negativo para as composições individuais dos materiais.

É apresentado aqui um exemplo da faixa dinâmica dos microarranjos resultantes preparados utilizando estes métodos. Os controles altos resultaram em regiões verde brilhante, enquanto os controles baixos resultaram em pontos muito menos intensos. A intensidade medida pelo Image J 64 mostra que os controles altos apresentam uma média de cerca de 22.000 unidades fluorescentes relativas, e os controles baixos apresentam uma média próxima de 8.000.

As linhas tracejadas representam três desvios padrão da média. Abaixo estão exemplos de microarranjos para uma triagem em array de honor de análogos sintéticos de alcaloides ameral sier identificados como composto um e composto dois. Ambos os eixos representam a porcentagem de enzima determinada pelo sinal fluorescente.

Em duplicata, a proximidade dos pontos em relação à diagonal representa alta reprodutibilidade do ensaio. São apresentados aqui os gráficos de IC50 de dois inibidores potenciais diferentes. O composto um resultou em um valor de IC50 de 16 micromolar, enquanto o IC50 do composto dois foi de 21 micromolar. Manchas representativas são exibidas acima para ilustrar as diferenças no sinal proporcionais às concentrações dos inibidores.

A matriz mostrada aqui foi impressa com quatro quinases diferentes: quinase p38 MAP, EGFR e GSK, e foi sobreimpressa com tampão apenas, tampão contendo ATP e tampão contendo ATP e staurosporina, um inibidor da atividade enzimática. Os resultados mostram um efeito significativo do inibidor de quinase staurosporina, com base nas intensidades de fluorescência resultantes, conforme descrito aqui. A maior diferença observada na concentração de staurosporina utilizada aqui foi nos pontos correspondentes à p38.

Aqui, são mostrados pontos representativos de um microarranjo BP P 30 8:00 AM, que foram sobrepostos com concentrações variadas de storporina. Conforme indicado, a CI 50 dessa molécula foi determinada como sendo um micromolar e é apresentada no gráfico à direita. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas horas, se for executada corretamente seguindo este procedimento.

Outros métodos, como ensaios imunológicos ou ensaios de interação proteica, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas ao diagnóstico ou à descoberta de moléculas pequenas.