Name: A Materials Guided Approach Triagem de Desenvolvimento de quantitativos Sol-gel derivados de microarrays de proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a desenvolver microarrays de proteínas derivados de sol-gel para triagem de pequenas moléculas usando acetilcolinesterase e multikinase. Este método sistemático permite alta reprodutibilidade e atividade enzimática em ensaios de nanovolume.

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Os autores agradecem a Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge e Laura Lautens de assistência em desenvolvimento de microarrays de proteína. Os autores também agradecem as Ciências Naturais eo Conselho de Pesquisa em Engenharia do Canadá (NSERC) para o financiamento deste trabalho. Os autores também agradecer à Fundação Canadense para Inovação e do Ontário Confiança Inovação para o apoio a este trabalho. JDB detém o Canada Research Chair in Chemistry bioanalíticos e Biointerfaces.

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<li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
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<li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+protein+microarray+support+materials%3A+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li>
<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

A metodologia aqui descrita foi escolhido como o mais adequado para identificação de impressão de materiais sol-gel derivados, com uma impressora de contacto, produzindo um tempo de processo e de custo eficaz para identificar rapidamente os materiais óptimos sem ter de analisar grandes quantidades de materiais. De um total de ~ 20000 materiais potenciais, foi possível identificar ~ 200 materiais que eram adequadas para impressão com base no tempo de gelificação sós. Isto reduz significativamente o número de materiais necessárias para estar preparado para os ensaios de impressão subsequente. Estes materiais de impressão foram então impressas em quatro superfícies de deslizamento para um total de 768 combinações de material de deslizamento. Em média, 50 pontos / repetições de um material pode ser impresso no ~ 3 min, incluindo o carregamento da amostra, local de deposição e limpeza pin. Destes, os materiais 155, ou cerca de 20%, permitido para imprimir o número máximo de pontos por absorção da solução e produzido local tamanhos reproduzíveis. Deve-se notar que o 4 slide superfícies testadas, materiais impressos melhor na ordem: amina&gt; epóxi&gt; aldeído&gt; PMMA; lâminas PMMA não produzir matrizes úteis para todos os materiais. Isto foi provavelmente atribuído à polaridade do revestimento de superfície. Comparando-se as superfícies de deslizamento atrás mencionadas, a amina mais polar e epóxi eram mais adequados para os sóis aquosos, em comparação com as corrediças de PMMA. Além disso, as superfícies de teste, as lâminas revestidas com amina proporcionam uma superfície carregada positivamente para o potencial depositado aniónico sol de ligação. Suspeita-se, a sílica nanopartículas na interface entre a corrediça e o sol de interagir ao longo da superfície. Tanto o epoxi e as superfícies de deslizamento de aldeído não têm a mesma interacção inicial baseada em carga. Para garantir a deposição local óptimo é altamente recomendada a usar lâminas pré-revestidas de um fornecedor tal como Arrayit. O revestimento em casa produz superfícies inconsistentes que levam a uma má reprodutibilidade ponto 13 e, em alguns casos, pode conduzir a problemas de quantificaçãoblemas. 18 De igual importância, temperatura e umidade afetam a &quot;qualidade de impressão&quot; dos materiais. Enquanto não existem estudos detalhados sobre os efeitos relacionados com a temperatura foram realizadas, a impressão era sempre realizado à temperatura ambiente (23 ± 3 ° C). Humidade (superior a 80%) foi também controlada no interior da câmara de impressão para evitar a deposição de forma irregular, devido à deposição de pequenos volumes de 0,7-2,3 (nl) e a evaporação. Enquanto a tela material foi orientada para identificar materiais derivados de sol-gel ótimas especificamente para impressão de AChE e quinases, um pequeno conjunto de materiais foi identificado que trabalhou para os dois tipos de proteínas. Com efeito, ambos os materiais que foram identificados para a fabricação de microarray quinase foram baseados em PVA SS + + glicerol, e ambos os materiais foram também identificados dentro dos 26 materiais seleccionados para microarranjos de AChE. Estes materiais &quot;ótimas&quot; pode oferecer um ponto de partida genérico para desenvolver ainda mais protein-dopados microarrays baseados em sol-gel, e telas pequenas centradas em torno destas composições podem identificar ainda melhores materiais para fabricação de microarray. Um segundo ponto a salientar é a importância da enzima utilizada. No caso da AChE (uma enzima bastante robusta), 26 (ou seja, aproximadamente 40%) das originais 66 materiais identificados como ensaio compatível retida a actividade da AChE aprisionada. No entanto, para as cinases mais delicado, apenas 2 das composições compatíveis com o ensaio 69, ou cerca de 3% do material, foram capazes de manter a actividade de todas as quinases. Quando um número suficiente de diferentes enzimas não têm sido estudados para fazer afirmações conclusivas, parece que a fabricação matriz otimização com enzimas relativamente instáveis ​​podem levar à identificação de materiais que podem entrap uma ampla gama de proteínas para permitir mutliplexed microarray fabricação. Independente da proteína escolhida, o principal factor de cut-off para a identificação de materiais de impressão era a necessidade de uma longatempos de gelificação de material (&gt; 2,5 hr). Quando o desenvolvimento de materiais à base de sol-gel de SS, que é muito importante para garantir que, na sequência de troca iónica e filtração, o sol é de cerca de pH 4. Os sóis com um pH inicial inferior pode resultar em materiais com um pH mais baixo do que o neutro, o que pode afectar a actividade da enzima. 19 ajustando a quantidade de Dowex (resina de troca de iões) para SS pode alterar o pH final da solução coloidal. Quando um novo lote de resina é preparada a proporção de resina a SS tem de ser ajustada de modo a produzir soluções coloidais a cerca de pH 4 seguindo o processo no ponto 2 do protocolo. Da mesma forma, a preparação da DGS cristalinas é frequentemente uma fonte de erro associado à insuficiência de material ao utilizar DGS sóis base para o aprisionamento biomolécula. Apesar de não ser relatado aqui em pormenor, um grande cuidado deve ser feita durante a síntese do DGS cristalinos, em particular a necessidade de evitar a presença de água durante a síntese, o que pode produzir sílica polyglyceratedtes, em vez de DGS monoméricos. Além disso, devido à natureza higroscópica do DGS, a amostra cristalina necessita de ser armazenado dessecado e utilizado dentro de 6 meses após a síntese. DGS cristalinos com mais de 6 meses, não pode dissolver completamente (devido ao material de silicato de poliglicerilo parcialmente condensada), mesmo com sonicação em um ambiente ácido. DGS incompleta dissolução produz sóis com desconhecido e incontrolável teor de sílica e, portanto, os materiais menos robustos. Um ponto importante a notar com a impressão de contacto é a qualidade dos pinos. Dos pinos danificadas ou extraviadas (Figura 9) nunca irá produzir matrizes reprodutíveis independentes do material a ser impresso. Recomenda-se verificar a qualidade do pino usando um microscópio de dissecação para garantir pinos quebrados ou entupidos não são usados. Manuseio cuidadoso garante vida longa para os pinos. O movimento livre do pino também é importante. Nos casos em que a humidade é preso na cabeça de impressão entre a cabeça e o pino, o pinonão irá assentar correctamente e, portanto, não entra em contacto adequado com a superfície, o que resulta numa falta de deposição de material. Em conclusão, nós fornecemos uma abordagem de triagem detalhada, várias etapas para o desenvolvimento de proteínas dopados microarrays pin-impressos de alta densidade. O rastreio envolve a optimização das propriedades dos materiais (o tempo de gelificação e capacidade de impressão) para permitir a impressão de materiais, seguido por triagem mais focado para identificar materiais que sejam compatíveis com um determinado ensaio e capaz de manter a actividade da enzima. Esta abordagem de triagem de material orientado pode ser aplicado a formatos microarray adicionais para reduzir o tempo e os custos associados com a produção eficiente microarranjos de alta densidade.

Microarrays ganharam popularidade no seio da comunidade científica como um método para aumentar o rendimento do ensaio. Desde o desenvolvimento da tecnologia de microarranjo para avaliar a expressão do gene 1 em meados da década de 1990, microarrays de ter encontrado utilização no desenvolvimento de ensaios de alto rendimento para identificar a proteína-proteína e proteína-interacções molécula pequena, e para encontrar novos materiais com propriedades únicas. 2-5 Mais recentemente, foram desenvolvidos os microarrays em que os materiais específicos são utilizados para imobilizar proteínas funcionais, produzir um elemento de microarray tridimensional dentro do qual as proteínas são aprisionadas, permitindo a fácil medição de actividade enzimática e a inibição no próprio usando um microarranjo de fluorescência adequada ensaio que é acoplada ao volume de substrato. 5-10 Importante, tais microarrays pode ser concebido para incluir todos os componentes necessários para as amostras de tela e controlos em conjunto de uma maneira altamente paralela. 5,8 &lt;/ P&gt; Os primeiros exemplos de microarrays de proteína foram tipicamente preparados usando métodos padrão para a imobilização da proteína em suportes sólidos, tais como ligação covalente, 11 afinidade capturar 3 e adsorção física. 12 Embora estes métodos de bio-imobilização para permitir o aumento da concentração da amostra e da cinética de reacção acelerados necessário para miniaturização de ensaio, cada um deles sofre desvantagens. Em geral, todos causar uma redução na funcionalidade biomolécula nativa devido a modificação química da superfície, dificultando o acesso a sítios activos, ou na orientação incorrecta devido a imobilização não específica. Assim, todos os métodos resultam em sensibilidade do ensaio inferior apesar de um aumento na deposição de biomoléculas, uma resposta que surge provavelmente devido à necessidade de se ligar artificialmente biomoléculas a uma superfície. Uma abordagem emergente para a produção de microarrays de biomoléculas funcionais é através do pino-impressão de proteína dopadosoles de sílica em suportes sólidos, os quais são normalmente lâminas de vidro ou funcionalizados ou poços individuais de placas de microcavidades. O processo sol-gel de si tem lugar num meio aquoso, à temperatura ambiente, e é o precursor líquido, que é impresso e, em seguida, os geles para biomoléculas aprisionam dentro da matriz 3D, permitindo a elevada carga de proteína 13, bem como o aprisionamento de múltiplos componentes dentro o mesmo elemento de microarray. 13,14 Adaptação do material derivado de sol-gel pode ser feito através de uma selecção cuidadosa de diferentes precursores de sílica, bem como alterando o componente aquoso através do uso de tampões diferentes (pH, força iónica) e inclusão de vários aditivos (polímeros, pequenas moléculas) para obter um material ideal, a natureza específica dos quais depende a biomolécula que está retido 10. Uma limitação potencial associado com o desenvolvimento de sol-gel de microarrays de proteínas derivados via pin-impressão éa necessidade de identificar materiais compósitos baseados em sol-gel que podem ser impressas sem gelificação no pino ou mostrando as propriedades indesejáveis ​​(tamanhos irreproduzíveis local rachaduras, falta de adesão, a incompatibilidade com componentes de ensaio, a má atividade da proteína), uma vez impressas em uma superfície. 5 simultânea otimização de todos estes parâmetros impede uma abordagem em que os materiais podem ser projetados de novo, ou examinou lentamente de uma forma serial. Por outro lado, a seleção aleatória de muitos milhares ou dezenas de milhares de materiais não é nem de tempo nem de baixo custo. Neste artigo, é descrito um método de rastreio dirigido, que permite a rápida identificação de materiais apropriados para a produção de microarrays de proteína, sem a necessidade de rastrear aleatoriamente um grande número de materiais. Utilizando uma abordagem orientada, materiais adequados para a impressão de microarray são identificadas em primeiro lugar, seguido por uma série de telas de pequena escala para identificar óptima de sol-gel derivado material combinações que podem ser impressos de forma reprodutível, sem rachaduras e são compatíveis com um determinado ensaio. Finalmente, os materiais óptimos são identificados com base na manutenção da actividade da enzima e desempenho em um teste de rastreio em pequena molécula final. Desta forma, os materiais podem ser identificados óptimas de muitos milhares de candidatos usando apenas algumas centenas de passos de ensaio. Nós demonstramos esta abordagem para o fabrico de ambos acetilcolinesterase de alta densidade e microarranjos multiquinase e a utilização de tais microarrays para pequenas moléculas de triagem.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Reagente/Material</forte></td></tr><tr><td>Poli(álcool vinílico) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>80% hidrolozyed, Mw 600</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>solução de 50% em peso em água</td></tr><tr><td>Carboxietilsilanotriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263,0</td><td>25% em água</td></tr><tr><td>N-(3-trietoxissililpropil) gluconamida (GLS)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189,0</td><td>50% em etanol</td></tr><tr><td>bis[(3-metildimetoxissilil)propil]óxido de polipropileno (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metiltrimetoxissilano (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(trietoxisiilia)etano (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoxissilano (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Trealose di-hidratada</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&epsilon; -Acetil-L-lisina</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, 1,0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 1,0 N/0,1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diglycerolsilane (DGS)</td><td></td><td></td><td>Preparado em solução de</td></tr><tr><td>silicato de sódio</td> em laboratório <td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Resina de exchance de íons Dowex 50WX8-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Iodeto de acetiltiocolina</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetilcolinesterase de Electrophorus electricus (enguia elétrica)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cistina</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Mancha de Microarray de Fosfoproteína/Fosfopeptídeo de Diamante Pro-Q</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de sal dissódico (ATP) de adenosina 5'trifosfato</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M),</td><td>EMD ativo Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Doado pela Millipore</td></tr><tr><td>Glicogen sintase quinase 3&beta; (GSK-3&beta;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteína básica de mielina (MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Substrate para MAPK2 e p38&alpha;, Doado por Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substrate para GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>Polipeptídeo poli-glu-tyr p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>Substrato para EGFR</td></tr><tr><td>Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pino Stealth</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corrediças revestidas com amina</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas revestidas com aldeído</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas revestidas Exposy</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corrediças revestidas com poli(metilmetacrilato) (PMMA)</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&mu; m</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><forte>Equipamento</forte></td></tr><tr><td>Impressora de Contato Virtek</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Imager de Slides de Fluorescência Novaray</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de microarray de mesa</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Usado para filtrar toda a água necessária para experimentos</td></tr></tbody></table>

a materials guided approach triagem de desenvolvimento de quantitativos sol-gel derivados de microarrays de proteína

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays encontraram utilização no desenvolvimento de ensaios de alto rendimento para a descoberta de novos materiais e de pequenas moléculas de droga leva. Descrevemos aqui uma abordagem de triagem de material guiada para identificar materiais à base de sol-gel, que são adequados para a produção de microarrays de proteína em três dimensões. A primeira abordagem identifica os materiais que podem ser impressas como microarrays, se reduz o número de materiais, identificando aqueles que são compatíveis com um determinado ensaio enzimático e afia em em materiais ideais com base na retenção de atividade máxima da enzima. Esta abordagem é aplicada para desenvolver microarrays adequados para dois ensaios diferentes de enzimas, utilizando uma enzima acetilcolinesterase e o outro utilizando um conjunto de quatro cinases-chave envolvidas no cancro. Em cada caso, foi possível produzir microarrays que poderiam ser usados ​​para ensaios quantitativos de rastreio de pequenas moléculas e de produção de curvas de resposta de inibidores dependentes da dose. Mais importante, a capacidade de filtrar muitos companheirorials produzido informações sobre os tipos de materiais que melhor se adequam tanto a produção de microarray e retenção da atividade enzimática. Os dados materiais fornecer informações sobre os requisitos materiais básicos necessários para a adaptação ideal, de alta densidade sol-gel microarrays derivados.

Através da realização de uma análise factorial guiada para a tela de material, fomos capazes de minimizar o número de materiais testados, a partir de ~ 20.000 a algumas centenas que tinham tempos de gelificação adequados para impressão. Através da aplicação de uma orientação estrita exige tempo de gelificação de material de 2,5 horas ou mais, os materiais susceptíveis de entupir os pinos de impressão ou produzir matrizes irreprodutíveis nunca foram impressas. Os materiais de impressão identificados tenham tempos (&gt; 2,5 hr) de gelificação suficientes foram impressas em quatro diferentes superfícies de deslizamento de vidro funcionalizadas. De modo a ser considerado como &quot;impressão&quot;, o número máximo de pontos por unidade de volume a absorção do pino teve de ser impresso (SMP3 = 200). Manchas foram também avaliadas para a morfologia local para assegurar nenhuma separação de fases de cracking ou indesejável tinha ocorrido utilizando microscopia de campo brilhante simples, como mostrado na Figura 2. A partir desta fase de materiais de impressão identificados, microarrays foram produzidos com a AChE equinases incorporada no componente aquoso tamponado. Materiais que eram compatíveis com o procedimento de ensaio (incluindo potencial overprinting e máquina de lavar ou coloração etapas) foram identificados pela observação retenção de manchas microarray (sem rachaduras, perda de pontos ou padrões incomuns de fluorescência) e um controle positivo (CP) para o controle negativo (NC ) rácio superior a 1, como observado através da imagem. Como este foi cerca de 50% dos materiais, uma maior proporção PC / CN, de 3 foi utilizada para definir materiais óptimos com retenção da actividade da proteína. Através deste método, 26 sol-gel de materiais derivados contendo materiais doer e 2 contendo quinases satisfeitos os critérios&gt; 3 PC / NC. Figuras 3 e 4 mostram uma avaria gráfica dos 5 passos da tela materiais guiadas para a identificação de ótima AChE e quinase microarrays, respectivamente. Os ensaios também podem ser validado através da geração de uma pontuação Z »17. </sup&gt; Isto foi feito utilizando o material que produziu a proporção PC / CN maior. Figura 5 mostra o plano Z &#39;obtida através da comparação do sinal gerado a partir de 200 pontos, 100 e 100 PC NC após a impressão sobreposta de corante indicador e do substrato sobre a matriz de AChE. A dor e as matrizes quinase resultou nos respectivos escores Z &#39;de 0,60 e 0,67, indicativo de um excelente ensaio. No entanto, deve notar-se que antes da validação do ensaio, enzima, corante, substrato e co-factor em concentrações de matriz teve de ser optimizadas por impressão sobreposta uma gama de concentrações de cada componente e seleccionando a concentração que produziu o sinal mais elevado, tal como descrito em pormenor noutro 5. Para validar os ensaios, dados de inibição quantitativos foram obtidos utilizando conhecidos e desconhecidos, os inibidores da acetilcolinesterase, com resultados realizados em duplicado e utilizada para produzir os gráficos de duplicados (Figura 6A) e as curvas de inibição (Figuras 6B e 6C). &lt;&gt; Spots fortes foram sobreposta primeiro com misturas de inibidores de pequenas moléculas biologicamente activas que, em seguida, com o corante e o substrato, e as misturas de controlo contendo tanto conhecidos inibidores ou inibidores não foram incluídos. Lotes duplicados foram gerados para avaliar a actividade da enzima, e quaisquer misturas que resultaram em pelo menos 25% a actividade da enzima foi considerada positiva para a inibição. Os compostos individuais de tais misturas foram então testadas em duplicado, para identificar a molécula pequena específico (s) responsável pela inibição. Uma vez identificadas, estas pequenas moléculas foram usadas para gerar curvas de inibição quantitativos para determinar valores de IC50 e as constantes de inibição. Resultados qualitativos semelhantes foram obtidos utilizando a matriz multiquinase com um inibidor da quinase comum, estaurosporina. Figura 7A e 7B mostram a imagem de microarray e indicam que as intensidades de sinal após a coloração e impressão sobreposta multiquinasematriz são tal como esperado para um controlo negativo (- ATP), controlo positivo (+ ATP) e inibidor conhecido (+ ATP + INH). Para demonstrar a capacidade de obter dados de inibição quantitativa dos microarrays, um ensaio de inibição dependente da concentração foi feita por uma única cinase. Tal como mostrado nas Figuras 8A e 8B, a intensidade do sinal diminui à medida que aumenta a concentração de inibidor, e a resposta segue a curva de inibição, dependente da concentração esperada para o sistema de quinase / substrato p38α/MBP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral para a abordagem de triagem de materiais guiada. Cada bloco representa um passo da tela em ordem sequencial. Os números do lado esquerdo indicam o número total de materiais preparados para análise. Utilizando um tempo de gelificação maior do que 2,5 horas (materiais com tempos de gelificação inferior a 2,5 hr are indicado pelo riscado), o número de materiais que passaram cada etapa e transportado durante a tela de material são indicadas pelo número à direita. * Representa materiais com menos do que a separação de fases óptima. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens ópticas mostram vários modos de materiais na etapa capacidade de impressão da tela fracasso. Uma imagem de um &quot;bom&quot; do material (segunda linha, terceira coluna) também é mostrado para comparação. Reproduzido com permissão da referência 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figura 3. Uma abordagem de triagem de material direcionado para a identificação de materiais ideais para a fabricação de sol-gel derivados de microarrays doer. Reproduzido com permissão de referência 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figura 4. A triagem de materiais abordagem direcionada para a identificação de materiais ideais para a fabricação de microarrays quinase sol-gel derivados. Reproduzido com permissão da referência 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figura 5. (A) A seção de microarray AChE mostrando HC (verde brilhante) e LC (luz verde) pontos (uma paleta de preto-verde foi aplicado como pseudo para maior clareza de apresentação), (B) uma visão ampliada da área de box para destacar local Morfologia e alinhamento;. e (C) um lote de Z &#39;linhas a cheio indicam a média da<html> repetições, enquanto que as linhas tracejadas correspondem a 3DP. Reproduzido com permissão da referência 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figura 6. (A) Duplicado lote para o rastreio em série de análogos sintéticos dos alcalóides de Amaryllidaceae, (B) IC 50 parcelas de inibidores potenciais identificadas marcadas como compostos 1 e (C), composto 2, com barras de erro que representa um desvio padrão da média de 25 repetições. pontos representativos são apresentados para ilustrar as diferenças de sinal proporcional às concentrações de inibidor. Reproduzido com permissão da referência 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figura 7. Ensaio On-matriz de quatro quinases usando 1.4SS/1.0PVA para o aprisionamento e impressos em um slide de amina derivados. (A) Uma imagem de uma seção de microarray na qual os pontos com quinases co-aprisionados com seus respectivos substratos foram sobreposta com tampão (NC, linha superior), ou soluções contendo ATP (PC, linha do meio) ou ATP + staurosporina (linha de fundo). (B) Os gráficos de barras comparando a intensidade do sinal entre as reacções inibidas e não inibidas, após a subtracção dos sinais de branco e barras de erro representam um desvio padrão da média de 25 repetições. Reproduzido com permissão da referência 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figura 8. Inhibiti. em ensaio em uma p38a/MBP microarray (D) Secções de microarrays que mostram pontos representativos overspotted com concentrações variadas de estaurosporina, como indicado (as imagens foram obtidas através de um único exame da mesma lâmina; imagem compósita é mostrado para maior clareza). (B) curva de IC 50 gerada a partir das imagens de matriz analisados. A intensidade obtida a 100 mM foi subtraída de todas as imagens, todas as outras intensidades foram normalizados definindo a intensidade obtida a 10 nM para um valor de 100% de actividade. Reproduzido com permissão da referência 8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figura 9. Imagens de pin discrição microscópico utilizado para contato pin-impressão mostrando várias imperfeições: (A) entupido, (B) dobradas.

Uma abordagem de triagem de material guiada para desenvolver sol-gel de proteína derivadas de microarrays dopados, utilizando um método de fabrico do pino-impressão emergente é descrito. Esta metodologia é demonstrada através do desenvolvimento de acetilcolinesterase e multiquinase microarrays, que são utilizados para rentável de pequenas moléculas de triagem.

A Materials Guided Approach Triagem de Desenvolvimento de quantitativos Sol-gel derivados de microarrays de proteína

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar novos materiais baseados em gel de soul para a fabricação de microarranjos e utilizar esses materiais em ensaios enzimáticos de volume nanométrico. Isso é alcançado primeiro por meio da identificação de materiais que apresentem tempos de ativação suficientemente longos para evitar a gelificação na ponta de impressão do microarranjo durante o processo de impressão. O segundo passo consiste em avaliar materiais com longos tempos de ativação quanto à sua capacidade de serem impressos como microarranjos com reprodutibilidade, resistência ao trincamento, qualidade de adesão, ausência de separação de fases indesejável e, finalmente, alta atividade para enzimas imobilizadas.Em seguida, a enzima de interesse é impressa como um microarranjo utilizando os materiais ideais, e sua capacidade de sobrepor o ponto da solução do ensaio e gerar uma resposta enzimática mensurável é testada. O passo final consiste em avaliar os materiais quanto à sua capacidade de fornecer ensaios altamente reprodutíveis com a enzima de interesse e gerar dados quantitativos. O material final para a fabricação do arranjo é então escolhido.Por fim, microarranjos de proteínas derivados de géis de alga são utilizados para identificar moléculas pequenas que reduzem a atividade enzimática. A principal vantagem deste método em comparação com métodos existentes, como triagem baseada em placas, é a possibilidade de analisar um grande número de materiais de maneira sistemática e muito rápida, utilizando baixos volumes de reagentes. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque é possível que os materiais gelifiquem dentro das ponteiras de impressão.Se esses forem então limpos adequadamente, isso resultará em áreas não cobertas que podem ser interpretadas como materiais não imprimíveis. Para começar, prepare as diversas soluções aditivas conforme descrito no protocolo textual complementar. Muitas das soluções podem ser preparadas previamente e armazenadas por até um mês ou mais sob as condições adequadas, mas algumas devem ser preparadas no dia do experimento.Misture as serras à base de silicato de sódio imediatamente antes do uso e certifique-se de mantê-las em gelo. O SOS deve ser usado dentro de uma hora após a adição da água, pois períodos de espera mais longos resultam em tempos de DATION reduzidos e inconsistentes. Em seguida, prepare várias combinações de tampões, polímeros salans e vias orgânicas conforme indicado no protocolo de texto acompanhante, a fim de identificar quais combinações podem ser usadas como material imprimível com tempos de dilatação superiores a 2,5 horas.Uma vez identificadas diversas combinações, ajuste a umidade dentro da câmara de impressão para entre 80 e 90%. Uma umidade inferior a 80% pode resultar em evaporação da amostra e inconsistências na impressão, devido aos pequenos volumes de deposição com a impressora. Agora, com tudo preparado, organize os padrões de matriz a serem impressos utilizando o programa Chip Writer Pro. Defina a velocidade de deslocamento nas direções XY para 10 milímetros por segundo e a velocidade de aproximação da amostra na direção Z para dois milímetros por segundo, com um tempo de carregamento da amostra de 2,5 segundos, usando as combinações de gel de serra identificadas anteriormente.Prepare 25 microlitros dos materiais básicos combinando os polímeros correspondentes, organossilanos e aditivos de molécula pequena identificados por meio do processo de pré-seleção. Utilize tampões de 50 milimolares com pH de 8,0 em poços individuais de uma placa de microtitulação de 384 poços. Em seguida, sonique até quatro pinos de bainha ranhurados de diâmetro de 100 mícrons em água bidestilada.Após 15 minutos, teste-os sob um fluxo de nitrogênio. Em seguida, utilize um limpador de tubos para remover a umidade residual do interior do suporte do pino e coloque cuidadosamente o pino na cabeça de impressão do robô de impressão por contato com pinos. A falha em remover a umidade residual pode impedir que o pino se mova livremente com o suporte, resultando em pontos não impressos.Em seguida, adicione 25 microlitros do respectivo SA ao poço imediatamente antes da impressão. Misture a solução utilizando um movimento de pipetagem para cima e para baixo, repetido 50 vezes durante a mistura com pipeta. Minimize a quantidade de ar incorporada à solução.As bolhas de ar impedem o carregamento completo da amostra dentro do pino. Em seguida, carregue o pino abaixando-o na amostra. Uma vez carregados os pinos, inicie o processo de impressão e imprima a amostra sobre uma superfície de lâmina.Pare o processo de impressão antes de adicionar sal à placa fonte subsequente. Bem, com o processo pausado, remova o pino de impressão usando um ímã e coloque um limpa-tubos na cabeça de impressão para evitar o acúmulo de umidade na mesma. Em seguida, enxágue o pino de impressão com água duplamente destilada e submeta-o à ultrassonicação em água duplamente destilada limpa por 30 segundos.Em seguida, seque o pino de impressão sob um fluxo de nitrogênio e, depois, recoloque o pino na cabeça de impressão. Continue misturando, imprimindo e limpando todos os amostras restantes na placa de origem; até 12.000 pontos, com 100 micrômetros de diâmetro, podem ser depositados em um único lâmina. Após a conclusão da impressão, envelheça o arranjo por um mínimo de 30 minutos e até 24 horas dentro da câmara de impressão, a uma umidade de 80 a 90%.Prepare 50 microlitros do controle positivo logo antes do uso, combinando 25 microlitros de iodeto de acetilcolina a um milimolar, 0,14 microlitros de bodi pi, cisteína FIL, e tris a 25 milimolar em pH 7,0 com 4% de glicerol no poço de uma placa de microtitulação de 384 poços; pipete a solução lentamente para cima e para baixo para misturar, sem criar bolhas. Em seguida, prepare os controles negativos logo antes do uso, combinando 0,14 microlitros de boai PI FIL cisteína a cinco milimolar com 49,86 microlitros de triss a 25 milimolar em pH 7,0 com 4% de glicerol em outro poço de uma placa de microtitulação de 384 poços e misture suavemente. Imprima os controles nos microarranjos envelhecidos utilizando os mesmos procedimentos descritos na seção anterior. No entanto, em vez de pinos com diâmetro de 100 micrômetros, utilize pinos ranhurados com diâmetro de 235 micrômetros.Isso garante que as soluções cubram completamente os pontos previamente depositados. Incube as matrizes em umidade de 80 a 90% por uma hora à temperatura ambiente devido à auto-hidrólise da acetilcolina. Tempos de incubação mais longos podem resultar em falsos positivos devido ao aumento da atividade enzimática.Certifique-se de que o leitor de microarranjos Alpha Innotech Novo está ligado e equipado com um filtro de excitação de 478 mais ou menos 17 nanômetros e um filtro de emissão de 538 mais ou menos 21 nanômetros para a medição dos microarranjos de acetilcolinesterase. Em seguida, coloque a lâmina no porta-lâminas com as manchas voltadas para cima. Defina o número de seções de pré-visualização de modo que pelo menos uma em cada lado da lâmina do microscópio seja pré-visualizada com uma resolução mínima de quatro micrômetros utilizando exposição automática.Uma vez que os parâmetros sejam considerados aceitáveis, adquira uma imagem do lâmina e salve-a como um arquivo TIFF. Em seguida, abra a imagem da lâmina adquirida no ImageJ 64. Clique na Ferramenta de Seleção Oval e selecione cada ponto.Selecione uma região ligeiramente maior que o ponto observado e certifique-se de usar um tamanho consistente entre os pontos para reduzir a subjetividade do ImageJ. Em seguida, meça a intensidade do sinal de cada ponto utilizando a opção de medição, na guia Analyze. Calcule a média da intensidade de 25 pontos de controle positivo semelhantes e divida pelo valor médio da intensidade de 25 pontos de controle negativo semelhantes para obter as razões entre controle positivo e controle negativo para as composições individuais dos materiais.É apresentado aqui um exemplo da faixa dinâmica dos microarranjos resultantes preparados utilizando estes métodos. Os controles altos resultaram em regiões verde brilhante, enquanto os controles baixos resultaram em pontos muito menos intensos. A intensidade medida pelo Image J 64 mostra que os controles altos apresentam uma média de cerca de 22.000 unidades fluorescentes relativas, e os controles baixos apresentam uma média próxima de 8.000.As linhas tracejadas representam três desvios padrão da média. Abaixo estão exemplos de microarranjos para uma triagem em array de honor de análogos sintéticos de alcaloides ameral sier identificados como composto um e composto dois. Ambos os eixos representam a porcentagem de enzima determinada pelo sinal fluorescente.Em duplicata, a proximidade dos pontos em relação à diagonal representa alta reprodutibilidade do ensaio. São apresentados aqui os gráficos de IC50 de dois inibidores potenciais diferentes. O composto um resultou em um valor de IC50 de 16 micromolar, enquanto o IC50 do composto dois foi de 21 micromolar. Manchas representativas são exibidas acima para ilustrar as diferenças no sinal proporcionais às concentrações dos inibidores.A matriz mostrada aqui foi impressa com quatro quinases diferentes: quinase p38 MAP, EGFR e GSK, e foi sobreimpressa com tampão apenas, tampão contendo ATP e tampão contendo ATP e staurosporina, um inibidor da atividade enzimática. Os resultados mostram um efeito significativo do inibidor de quinase staurosporina, com base nas intensidades de fluorescência resultantes, conforme descrito aqui. A maior diferença observada na concentração de staurosporina utilizada aqui foi nos pontos correspondentes à p38.Aqui, são mostrados pontos representativos de um microarranjo BP P 30 8:00 AM, que foram sobrepostos com concentrações variadas de storporina. Conforme indicado, a CI 50 dessa molécula foi determinada como sendo um micromolar e é apresentada no gráfico à direita. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas horas, se for executada corretamente seguindo este procedimento.Outros métodos, como ensaios imunológicos ou ensaios de interação proteica, também podem ser realizados para responder perguntas adicionais relacionadas ao diagnóstico ou à descoberta de moléculas pequenas.

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Research

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