Name: Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a realizar perfil de glicosilação em amostras complexas usando microarray de anticorpos quimicamente bloqueada. Este método multiplexado de alta capacidade reduz tempo e custos na análise de glicoproteínas.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa de Vírus Hepatite e.

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<li>Porter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+motif-based+analysis+of+glycan+array+data+to+determine+the+specificities+of+glycan-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins.</a> Glycobiology. 20, 369-380 (2010).</li>
<li>Maupin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogene+Expression+Alterations+Associated+with+Pancreatic+Cancer+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Complementary+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysate+Microarrays+Enable+High-throughput%2C+Quantitative+Investigations+of+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

1. Proteína alvo e seleção anticorpo de captura Antes do ensaio microarray anticorpo, alguns reagentes e materiais são necessários para ser considerado e preparado. Para conceber um microarray anticorpo para glicano perfil ou rastreio de glicano biomarcador, um painel de anticorpos específicos para os candidatos de glicoproteína deve ser determinada de acordo com a literatura ou a partir dos resultados anteriores. Esses anticorpos foram normalmente compradas de fornecedores diferentes, tais com...

<table border="1"><tbody><tr><td> ID </td><td> Nome do reagente </td><td> Abreviatura </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> L1 </td><td> Concanavalina A biotinilado </td><td> ConA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L2 </td><td> Biotinilado Sambucus Nigra Lectina </td><td> SNA </td><td> Vector Laboratories </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> L3 </td><td> Biotinilado Lens culinaris aglutinina </td><td> LCA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L4 </td><td> Biotinilado Ricinus communis aglutinina eu </td><td> RCA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L5 </td><td> Biotinilado Aleuria Lectina Aurantia </td><td> AAL </td><td> Vector Laboratories </td><td> B-1395 </td></tr><tr><td> L6 </td><td> Biotinilado Erythrina Lectina Cristagalli </td><td> ECL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L7 </td><td> Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Lectina Simplicifolia II </td><td> GSL II </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L8 </td><td> Biotinilado Gérmen de Trigo aglutinina </td><td> WGA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L9 </td><td> Erythroagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus </td><td> PHA-E </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L10 </td><td> Leucoagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus </td><td> PHA-L </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L11 </td><td> Aglutinina de amendoim biotinilado </td><td> PNA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L12 </td><td> Biotinilado Pisum sativum aglutinina </td><td> PSA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L13 </td><td> Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina </td><td> DBA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L14 </td><td> Lectina Stramonium biotinilado Datura </td><td> DSL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Aglutinina Sophora Japonica biotinilado </td><td> SJA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L16 </td><td> Aglutinina de soja biotinilado </td><td> SBA </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L17 </td><td> Biotinilado Solanum tuberosum (Batata) Lectina </td><td> STL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L18 </td><td> Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I </td><td> Eu GSL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L19 </td><td> Biotinilado Vicia Lectina Villosa </td><td> VVL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-2000 </td></tr><tr><td> L20 </td><td> Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) Lectina </td><td> LEL </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> L21 </td><td> Ulex biotinilado Europaeus aglutinina eu </td><td> UEA I </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-1000 </td></tr><tr><td> L22 </td><td> Jacalina biotinilado </td><td> Jacalina </td><td> Vector Laboratories </td><td> BK-3000 </td></tr><tr><td> A1 </td><td> F cabra (ab &#39;) 2 Fragmento IgM anti-humana, o anticorpo Fc5μ </td><td> IgM </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 109-006-129 </td></tr><tr><td> A2 </td><td> Burro F (ab &#39;) 2 Frag anti-IgG humana (H + L) umtibody </td><td> AB1 </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 709-006-149 </td></tr><tr><td> A3 </td><td> De ratinho anti-IgG humana F (ab &#39;) 2 de anticorpo monoclonal </td><td> AB3 </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 209-005-097 </td></tr><tr><td> A4 </td><td> Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonal </td><td> A2M </td><td> GeneTex </td><td> GTX62924 </td></tr><tr><td> A5 </td><td> De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal </td><td> A1AT </td><td> Lee Biosiences </td><td> CA1T-80A </td></tr><tr><td> A6 </td><td> De ratinho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina monoclonal </td><td> A1AT </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SAB4200198 </td></tr><tr><td> A7 </td><td> De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal </td><td> ACT </td><td> Neomarkers </td><td> RB-367-A1 </td></tr><tr><td> A8 </td><td> De coelho anti-humanoalfa-1-antiquimotripsina anticorpo policlonal </td><td> ACT </td><td> Fisher Scientific </td><td> RB9213R7 </td></tr><tr><td> A9 </td><td> Rato anti-humana de anticorpo monoclonal de transferrina </td><td> Transferrina </td><td> GeneTex </td><td> GTX101035 </td></tr><tr><td> A10 </td><td> De coelho anti-anticorpo humano policlonal de transferrina </td><td> Transferrina </td><td> GeneTex </td><td> GTX77130 </td></tr><tr><td> A11 </td><td> Cabra anti-humano apolipoproteína anticorpo policlonal J </td><td> ApoJ </td><td> Abcam </td><td> ab7610 </td></tr><tr><td> A12 </td><td> Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal </td><td> GP73 </td><td> Abbott </td><td> 14H4-23 </td></tr><tr><td> A13 </td><td> Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal </td><td> GP73 </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc. </td><td> sc-101.275 </td></tr><tr><td> A14 </td><td> De coelho anti-humano de alfa-1 fetoprotein anticorpo policlonal </td><td> AFP </td><td> Genway </td><td> GWB-41C966 </td></tr><tr><td> A15 </td><td> De ratinho anti-anticorpo humano de alfa-1 fetoproteína monoclonal </td><td> AFP </td><td> Fitzgerald </td><td> 10-A05A </td></tr><tr><td> A16 </td><td> Rato anti-humana de anticorpo monoclonal hemopexina </td><td> Hemopexina </td><td> Assaypro </td><td> 60190-05011 </td></tr><tr><td> A17 </td><td> Rato anti-humano glypican-3 (1G12) anticorpo monoclonal </td><td> GPL3 </td><td> Santa Cruz Bio </td><td> sc-65.443 </td></tr><tr><td> A18 </td><td> Rato anti-humano Cininogênio anticorpo (LMW) monoclonal </td><td> Cininogênio </td><td> Assaypro </td><td> 20333-05011 </td></tr><tr><td> A19 </td><td> De coelho anti-anticorpo humano MMP-21 monoclonal </td><td> MMP21 </td><td> Epitomic </td><td> 1955-1 </td></tr><tr><td> A20 </td><td> Rato anti-humano CEACAM-1 anticorpos monoclonaisy </td><td> CEACAM </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB1180 </td></tr><tr><td> A21 </td><td> Rat anti-humano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonal </td><td> DPPIV </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB22441 </td></tr><tr><td> A22 </td><td> Rato anti-humano PIVKA anticorpo monoclonal II </td><td> PIVICA </td><td> Cristal chem </td><td> 8040 </td></tr><tr><td> A23 </td><td> Antigénio de ratinho anti-carcinoembriónico </td><td> CEA </td><td> EUA biológica </td><td> C1300 </td></tr><tr><td> A24 </td><td> Antigen de ratinho anti-CA125 Câncer </td><td> CA125 </td><td> EUA biológica </td><td> C0050-01D </td></tr><tr><td> A25 </td><td> Antigénio de ratinho anti-CA19-9 Câncer </td><td> CA19-9 </td><td> EUA biológica </td><td> C0075-18 </td></tr><tr><td> A26 </td><td> De ratinho anti-Lewis anticorpo monoclonal x </td><td> Lewis X </td><td> Calbiochem </td><td> 434631 </td></tr><tr><td> bio </td><td> Biotinilado BSA (controle positivo) </td><td> Bio </td><td> Home-made </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Lista Tabela 1. De lectinas e anticorpos utilizados neste protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente s / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Microarrayer sem contato </td><td> BioDot Inc </td><td> sciFLEXARRAYER </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Pescador </td><td> 14-230-243 </td></tr><tr><td> FoodSaver </td><td> FoodSaver </td><td> V3835 </td></tr><tr><td> Nitrocelulose Ultrathin Coate microarray desliza </td><td> Gentel </td><td> PATH </td></tr><tr><td> Deslize Imprinter (opcional) </td><td> A Companhia Gel </td><td> WSP60-1 </td></tr><tr><td> Sacudidor </td><td> Pescador </td><td> 15-453-211 </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5804 000.013 </td></tr><tr><td> Deslize prato de coloração de lavagem bacia / Slide com rack removível </td><td> Pescador </td><td> 08-812 </td></tr><tr><td> Deslize incubação caixa de lâminas câmara / microscópio </td><td> Pescador </td><td> 03-448-5 </td></tr><tr><td> Brij 35, 30% de solução w / v em água </td><td> Acros Organics </td><td> AC32958-0025 </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Pescador </td><td> P337-100 </td></tr><tr><td> Periodato de sódio (NaIO4) </td><td> Sigma </td><td> 311448 </td></tr><tr><td> Ácido L-glutâmico γ-hidrazida </td><td> Sigma </td><td> G-7257 </td></tr><tr><td> De acetato de sódio anidro (CH 3 COONa) </td><td> Sigma </td><td> S2889 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Lampire Biológica Labs </td> &lt;td&gt; 7500804 </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) (10X) </td><td> Denville Científico </td><td> CP4390-48 </td></tr><tr><td> Dylight NeutrAvidin 549 conjugado </td><td> Thermo </td><td> 22837 </td></tr><tr><td> Protease Comprimidos Coquetel Inibidor </td><td> Roche </td><td> 4693159001 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG humana, fragmento Fc </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 009-000-008 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG humana, molécula inteira </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 009-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG de rato, molécula inteira </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG de rato, fragmento Fe </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 015-000-008 </td></tr><tr><td> ChromPure IgG de coelho, molécula inteira </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 011-000-003 </td></tr><tr><td> ChromPure Donkey IgG, molécula inteira </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 017-000-003 </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> Tecan </td><td> LS Reloaded </td></tr></tbody></table> Lista Tabela 2. De equipamentos e reagentes utilizados neste protocolo.

microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Neste estudo, descrevemos um protocolo eficaz para uso em um microarranjo de anticorpos multiplexado e de alto rendimento com detecção por proteínas ligadoras de glicanos, que permite o perfilhamento da glicosilação de proteínas específicas. A glicosilação de proteínas é a modificação pós-traducional mais prevalente encontrada em proteínas e resulta em modificações diversificadas das propriedades físicas, químicas e biológicas das proteínas. Como a maquinaria de glicosilação é particularmente suscetível ao progresso da doença e à transformação maligna, a glicosilação aberrante tem sido reconhecida como biomarcador de detecção precoce para câncer e outras doenças. No entanto, os métodos atuais para estudar a glicosilação de proteínas normalmente são muito complicados ou caros para uso na maioria dos laboratórios comuns ou em ambientes clínicos, sendo necessário um método mais prático para investigar a glicosilação proteica. O novo protocolo descrito neste estudo utiliza um microarranjo de anticorpos quimicamente bloqueado com detecção por proteínas ligadoras de glicanos (PLG) e reduz significativamente o tempo, o custo e os requisitos de equipamentos laboratoriais necessários para estudar a glicosilação de proteínas. Neste método, múltiplos anticorpos específicos para glicoproteínas imobilizados são impressos diretamente sobre lâminas de microarranjo e os N-glicanos nos anticorpos são bloqueados. Os anticorpos específicos para glicoproteínas bloqueados e imobilizados são capazes de capturar e isolar glicoproteínas a partir de uma amostra complexa aplicada diretamente sobre as lâminas de microarranjo. A detecção de glicanos então pode ser realizada pela aplicação de lectinas biotiniladas e outras PLGs sobre a lâmina de microarranjo, enquanto os níveis de ligação podem ser determinados utilizando Dylight 549-Estrepavidina. Por meio do uso de um painel de anticorpos e sondagem com múltiplas lectinas biotiniladas, este método permite o desenvolvimento de um perfil eficaz de glicosilação das diferentes proteínas encontradas em uma determinada amostra humana ou animal.
Introdução
Glicosilação de proteínas, que é a modificação pós-traducional mais ubíqua em proteínas, altera as propriedades físicas, químicas e biológicas de uma proteína e desempenha um papel fundamental em diversos processos biológicos1-6. Como a maquinaria de glicosilação é particularmente suscetível à progressão da doença e à transformação maligna, a glicosilação aberrante tem sido reconhecida como biomarcador de detecção precoce para câncer e outras doenças 7-12. Na verdade, a maioria dos biomarcadores de câncer atuais, como a fração L3 de &alpha;-1 alfafetoproteína (AFP) para carcinoma hepatocelular 13-15e CA199 para câncer de pâncreas 16, 17 são todos os moieties de glicanos aberrantes em glicoproteínas. No entanto, os métodos para estudar a glicosilação proteica têm sido complicados e não adequados para ambientes laboratoriais e clínicos de rotina. Chen et al. inventou recentemente um microarranjo de anticorpos quimicamente bloqueado com um método de detecção por proteína ligadora de glicanos (GBP) para perfis de glicosilação de alta produtividade e multiplexados de glicoproteínas nativas em uma amostra complexa 18. Neste método de microarranjo baseado em afinidade, múltiplos anticorpos específicos para glicoproteínas imobilizados capturam e isolam glicoproteínas diretamente da mistura complexa sobre a lâmina de microarranjo, e os glicanos em cada proteína capturada individualmente são medidos por GBP (proteínas ligadoras de glicanos). Como todos os anticorpos normais contêm N-glicanos que podem ser reconhecidos pela maioria dos GBPs, a etapa crítica deste método é bloquear quimicamente os glicanos nos anticorpos para impedir sua ligação ao GBP. No procedimento, o cisOs grupos -diol das glicanas nos anticorpos foram inicialmente oxidados a grupos aldeído utilizando NaIO₄4 em tampão de acetato de sódio, evitando a luz. Os grupos aldeído foram então conjugados ao grupo hidrazida de um ligante cruzado, cloreto de 4-(4-N-maleimidofenil)butírico hidrazida (MPBH), seguido pela conjugação de um dipeptídeo, Cys-Gly, ao grupo maleimida do MPBH. Assim, os grupos cis-diol dos glicanos dos anticorpos foram convertidos em grupos volumosos não hidroxilados, os quais impediram a ligação de lectinas e outras GBPs aos anticorpos de captura. Este procedimento de bloqueio faz com que as GBPs e lectinas se liguem apenas aos glicanos das proteínas capturadas. Após este bloqueio químico, amostras de soro foram incubadas com o microarranjo de anticorpos, seguido pela detecção dos glicanos utilizando diferentes lectinas e GBPs biotiniladas, e visualizadas com estreptavidina-Cy3. O uso paralelo de um painel de anticorpos e sondagem com múltiplas lectinas fornece perfis glicosilação discretos de múltiplas proteínas em uma determinada amostra 18-20. Este método tem sido usado com sucesso em diversos laboratórios diferentes 1, 7, 13, 19-31No entanto, a estabilidade do MPBH e da Cys-Gly, juntamente com o procedimento complicado e prolongado deste método, afetam a reprodutibilidade, eficácia e eficiência do mesmo. Neste novo protocolo, substituímos tanto o MPBH quanto a Cys-Gly por um reagente muito mais estável, a hidrazida do ácido glutâmico (Glu-hidrazida), o que melhorou significativamente a reprodutibilidade do método, além de simplificar e encurtar todo o procedimento, permitindo que seja concluído dentro de um único dia de trabalho. Neste novo protocolo, descrevemos o procedimento detalhado, que pode ser facilmente adotado por laboratórios comuns para estudos rotineiros de glicosilação proteica, bem como as técnicas necessárias para obter resultados reprodutíveis e repetíveis.

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Neste estudo, descrevemos um protocolo eficaz para uso em um microarray de anticorpos de alto rendimento multiplexado com detecção de proteínas de ligação a glicanos que ...

Este artigo em vídeo descreve um procedimento para obtenção de perfis de glicosilação de 20 glicoproteínas diferentes em uma amostra de soro de paciente com carcinoma hepatocelular, utilizando um microarranjo de anticorpos previamente bloqueado quimicamente. Primeiramente, anticorpos específicos para glicoproteínas são impressos diretamente em lâminas de microarranjo e os glicanos dos anticorpos são bloqueados para impedir a ligação de lectinas. Quando as amostras de soro do paciente são aplicadas, as glicoproteínas da amostra são capturadas pelos anticorpos. Em seguida, são adicionadas proteínas ligadoras de glicanos biotiniladas para detectar os glicanos, e estreptavidina conjugada é adicionada para marcar as lectinas biotiniladas.O lâmina de microarranjo é então escaneada para detectar a fluorescência, e a análise dos dados resultantes revela os perfis de glicosilação das proteínas da amostra. Esta técnica apresenta diversas vantagens em comparação com métodos existentes, como a CLAE. Este método permite a detecção de glicoproteínas individuais em seu estado nativo.É mais rápido e fácil realizar a triagem de alterações na glicosilação para múltiplas proteínas simultaneamente. De

chemically-blocked-antibody-microarray-for-multiplexed-high

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Biologia

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

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Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

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Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas (Vídeo) | JoVE Journal

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

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