Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este artigo em vídeo descreve um procedimento para obter perfis de glicosilação de 20 glicoproteínas diferentes em uma amostra de soro de paciente com carcinoma hepatocelular usando uma primeira glicoproteína de microarray de anticorpos bloqueados quimicamente Anticorpos específicos são impressos diretamente em lâminas de microarray e glicanos de anticorpos são bloqueados para evitar a ligação à lectina. Quando as amostras de soro do paciente são aplicadas, as glicoproteínas da amostra são capturadas pelos anticorpos. Proteínas de ligação de glicanos biotiniladas são então adicionadas para detectar os glicanos e a neu travain di conjugada é adicionada para marcar as lectinas biotiniladas.

A lâmina de microarray é então escaneada para detectar a análise de fluorescência dos dados resultantes revela os perfis de glicosilação das proteínas da amostra. Esta técnica tem várias vantagens sobre o método existente, como a HPLC. Este método permite a detecção de glicoproteínas individuais em seu status nativo.

É mais rápido e fácil rastrear a alteração da glicosilação para várias proteínas simultaneamente. Tudo bem, descobrimos que os biomarcadores de doenças, particularmente de câncer e câncer de fígado, que analisamos com mais cuidado, são frequentemente glicosilados. E a capacidade de detectar formas específicas de glico que encontramos aumenta muito o desempenho dos biomarcadores em sua sensibilidade e especificidade.

Portanto, essa medida pode fornecer informações sobre alterações de glicosilação em várias proteínas séricas no CHC. Também pode ser aplicado ao estudo de patologia e descoberta de biomarcadores em outros cânceres e doenças, como câncer de pâncreas, diabetes e doença de Alzheimer. Demonstrando o procedimento estará Chen Lu, um técnico do meu laboratório.

Comece este protocolo preparando o microarray de anticorpos primeiro em tubos de microcentrífuga de 0,8 mililitro em gelo diluir todos os anticorpos que serão usados para impressão de microarray a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro em um mínimo de 40 mililitros de PBS aqui, 26 anticorpos diferentes serão usados como controle positivo. Prepare também a mesma quantidade de 0,5 miligramas por mililitro de BSA biotinilada em PBS. Use um pipetador para alíquota de 40 mililitros de cada anticorpo na placa de origem de 384 poços no gelo.

Em seguida, no software de controle de microarray, designe cada localização de anticorpo. Em seguida, carregue a placa no microarray como fonte. Em seguida, carregue 20 caminhos microarray slides no microarray como alvo.

Configure o microarray para imprimir 48 arrays subar idênticos nos quais 27 anticorpos e proteínas de controle são detectados em triplicado em um padrão de nove por nove. Inicie o microarray para imprimir as lâminas do microarray de anticorpos. Colete as lâminas de microarray de anticorpos e armazene-as em um de lâminas com dessecante.

Sele o em um saco plástico para evitar a desnaturação de proteínas e umidade nas lâminas durante o armazenamento. Armazene as lâminas seladas do microarray a quatro graus Celsius até que sejam usadas. O aspecto mais difícil e importante deste procedimento é a etapa de bloqueio químico.

Para garantir o sucesso, é fundamental que uma quantidade suficiente de anticorpos seja impressa na luz do micro array. Sempre prepare IDE de sódio fresco e hidrócito de agroácidos imediatamente antes do experimento. E certifique-se de realizar o procedimento de oxidação a quatro graus evitando a luz.

Retire as lâminas de microarray da geladeira e equilibre-as em temperatura ambiente por 30 minutos. Remova um slide da caixa de armazenamento. Mergulhe brevemente a lâmina em uma bacia contendo PBS com 0,1% tween 20.

Em seguida, mergulhe a lâmina em tampão acetato de sódio a 15 milimolares com 0,1% de interpolação por 10 minutos. Em seguida, prepare 150 milimolares de sódio fresco por iodato em tampão de acetato de sódio 15 milimolar e transfira-o para uma bacia de lavagem de lâminas Guarde na geladeira, evitando a luz até o uso. Remova a lâmina do tampão de acetato de sódio e coloque-a na bacia contendo purificação de sódio fresco com o lado do anticorpo voltado para cima.

Cubra a bacia com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, coloque a bacia deslizante a quatro graus Celsius com agitação suave por duas horas. Remova a lâmina da bacia e lave-a brevemente em tampão de acetato de sódio três vezes por cinco minutos.

Incube a lâmina em 300 mililitros de solução de bloqueio de ácido hidroglutâmico de 10 milimolares recém-preparada em uma câmara de incubação por duas horas em temperatura ambiente com agitação suave. Remova as lâminas da câmara e lave-as com PBS com 0,1% de interpolação por três minutos. Em seguida, em uma bacia de lavagem de lâminas, incube a lâmina de microarray em 300 mililitros de 1% BSA em PBS com 0,5% tween por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave.

Enxágue as lâminas em PBS com 0,1% de interpolação três vezes por três minutos. Coloque a corrediça em um rack de slides e gire a 1.200 vezes G por dois minutos para secar a lâmina de microarray em seguida. Para separar cada matriz subar, uma grade de cera é impressa no slide.

Depois de pré-aquecer a impressora de cera a 70 graus Celsius por cinco minutos, carregue a lâmina de microarray bloqueada na impressora de cera com o lado do anticorpo voltado para a cera. Puxe suavemente a alça para imprimir a cera uniformemente na lâmina. Este método pode ser usado para realizar ensaios de perfil de glico para uma única amostra ou para medir um único epítopo de glico em várias amostras.

Aqui demonstraremos ensaios de perfil de glico. Comece diluindo 40 microlitros de soro em 360 microlitros de PBS contendo 0,1% entre 0,1% e 100 microgramas por mililitro, cada um de IgG de camundongo, rato, coelho, cabra e burro. Este volume é suficiente para aplicar seis microlitros de solução de soro diluída em cada sub-matriz.

Aplique cuidadosamente seis microlitros da amostra diluída ou controle em cada submatriz da lâmina. Incube a lâmina em um umidificado com toalhas de papel úmidas em temperatura ambiente por uma hora. Enxágue a lâmina com PBS com 0,1% de interpolação três vezes por três minutos.

Em seguida, seque a lâmina girando-a a 1200 vezes G por dois minutos. Prepare 20 microlitros das proteínas de ligação ao glicano biotiniladas a 10 miligramas por mililitro em PBS tween em um tubo de microfuga de 0,8 mililitro no gelo. Aplique seis microlitros de lectinas biotiniladas diluídas em cada submatriz da lâmina e incube na caixa de lâminas umidificada com toalhas de papel molhadas em temperatura ambiente por uma hora.

Depois de enxaguar as lâminas com PBS com 0,1% tween três vezes como antes, seque a lâmina girando-a a 1200 vezes G em uma centrífuga por dois minutos. Prepare 400 microlitros de 10 miligramas por mililitro DITE 5 49 rotulado com travura em PBS 0,1% tween em um tubo de micro fuga de 0,8 mililitro no gelo. Use um pipetador repetido para aplicar seis microlitros de NEUT travain rotulado com DITE 5 49 em cada submatriz e incube a lâmina no de lâminas umidificado em temperatura ambiente por uma hora após a incubação.

Enxágue a lâmina com PBS 0,1% entre três vezes por três minutos. Seque a lâmina girando-a a 1200 vezes G em uma centrífuga por dois minutos. Digitalize a lâmina usando um scanner de microarray de fluorescência com resolução de 10 milímetros.

As configurações de laser e PMT devem ser o mais fortes possível, garantindo que nenhuma saturação seja observada. Abra a imagem na matriz Pro 3.2. Configure o modelo de matriz de acordo com o mapa de matriz que mostra os locais dos pontos de anticorpos.

Alinhe cuidadosamente cada círculo de modelo no ponto correspondente na imagem, extraia a intensidade de cada ponto em um arquivo Excel para análise posterior. Microarray de anticorpos contendo 48 arrays subar idênticos com 26 anticorpos contra 20 glicoproteínas séricas e biotina. O BSA foi projetado e fabricado conforme descrito neste vídeo para examinar a importância do procedimento de bloqueio.

Na análise do perfil de glicoproteínas, duas lâminas de microarray idênticas foram geradas. Um não foi bloqueado quimicamente, enquanto o outro foi a amostra de controle foi aplicada em matrizes subares nas colunas um e três e uma amostra de soro de HCC agrupada foi aplicada nas matrizes subar. Nas colunas dois e 4 22.

Lectinas biotiniladas específicas para diferentes glicanos foram então aplicadas em cada subarray, conforme mostrado nessas imagens dos subarrays. As lectinas se ligam para capturar anticorpos nas colunas de controle, dando um fundo alto que era indistinguível das colunas carregadas de soro nos microarrays não bloqueados. No entanto, quando o mesmo experimento foi feito em uma lâmina de microarray de anticorpos quimicamente bloqueada, não houve ou houve ligação muito baixa para capturar anticorpos nas colunas de controle e alta ligação de antígeno nas colunas carregadas de soro.

Esses resultados demonstram que o procedimento de bloqueio químico é uma etapa crítica para a medição de glicanos em glicoproteínas capturadas por anticorpos Seguindo o protocolo, os perfis de glicosilação de 22 glicoproteínas no soro do CHC podem ser obtidos Uma vez dominados. Essa técnica pode ser feita em oito horas se for executada corretamente. Os anticorpos, quando modificados, podem perder suas afinidades por seus antígenos e outras propriedades.

Portanto, é importante ter isso em mente e usar vários anticorpos diferentes em diferentes fontes de anticorpos após este procedimento. Outras medidas, como a detecção de cada concentração de proteína usando a mesma lâmina de microray, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como se a alteração da glicosilação é devido à mudança nos níveis de expressão da proteína ou apenas devido à alteração da glicosilação em cada proteína individual. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de soro contendo patógenos pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.