Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microarray usando um aparelho misturador automatizado. Isso é feito analisando primeiro a qualidade das amostras de RNA com o bioanalisador após a amplificação e marcação do RNA. As amostras de RNA são hibridizadas com os microarrays.

Finalmente, os microarrays hibridizados são lavados e digitalizados. Em última análise, são obtidos resultados que mostram a expressão diferencial de transcritos de RNA por meio da análise de imagens de microarray de fluorescência de duas cores. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de hibridização de microarray são difíceis de aprender devido ao equipamento especializado.

A análise do controle de qualidade começa com a preparação do instrumento bioanalisador 2, 100 e da estação de escorva de chips, conforme indicado no procedimento escrito. A matriz de gel é então filtrada pipetando 550 microlitros em um filtro de rotação fornecido com centrífuga de kit nano RNA 6.000. O filtro a 1.500 RCF por 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, alíquota do gel filtrado em alíquotas de 65 microlitros, que podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até um mês. Vortex o concentrado de corante por 10 segundos e adicione um microlitro a uma alíquota de 65 microlitros. Um gel filtrado após o vórtice da mistura centrifuga a 13.000 RCF por 10 minutos à temperatura ambiente para escoar as amostras.

Primeiro posicione um chip na estação de escorva. Nesta demonstração, RNA 6.000 nano chips são usados. Coloque nove microlitros da mistura de corante em gel no poço marcado com um G branco contra o fundo preto.

Com a ponta da pipeta posicionada no fundo do poço. Posicione o êmbolo da seringa em um mililitro e feche a estação de escorva. Pressione o êmbolo para baixo lentamente, mas com firmeza, até que seja segurado pelo clipe.

Após 30 segundos, solte o clipe e deixe o êmbolo subir alguns segundos. Depois que o êmbolo parar, puxe o êmbolo de volta para a posição de um mililitro e abra a estação de escorva. Carregue nove microlitros da matriz de gel.

Misture em cada um dos dois poços. Mark G. Em seguida, coloque cinco microlitros do marcador no poço da escada e em cada um dos 12 poços de amostra. Próxima carga, um microlitro da escada desnaturada no poço da escada e um microlitro de cada amostra desnaturada nos poços de amostra.

Por fim, adicione um microlitro do marcador em cada amostra não utilizada. Bem, uma vez carregado, vórtice o chip por um minuto a 2.400 RPM. Depois de iniciar o software especialista 2, 100, posicione o chip e feche a tampa.

Certifique-se de que a porta correta esteja selecionada e execute o ensaio dentro de cinco minutos após o carregamento das amostras para evitar a evaporação. Métodos para realizar amplificação e marcação de RNA podem ser encontrados no protocolo escrito. Uma vez marcado, purifique o CRNA para remover quaisquer nucleotídeos não incorporados Usando cogens r an easy mini columns, o CRNA marcado pode então ser quantificado com um fotômetro de espectro NanoDrop 2000.

No modo de medição de microarray, registre, concentração da amostra, rendimento e atividade específica. Para hibridização de microarray, é necessário atingir um rendimento de pelo menos 825 nanogramas e uma atividade específica de pelo menos oito picomoles por micrograma pelo menos duas horas antes da hibridização de microarray. Ligue a estação de hibridização e ajuste para 65 graus Celsius.

Este protocolo descreve o uso de matrizes Agilent quatro por 40 4K com o sistema de hibridização de geração ágil da Roche e quatro câmaras misturadoras após a fragmentação do CRNA realizada conforme descrito no protocolo escrito, prepare a câmara de hibridização. Coloque uma corrediça do microarray no lado do código de barras da ferramenta da desmontagem do conjunto. Primeiro abra um misturador A four e exponha o adesivo que segura a matriz e a ferramenta de desmontagem do conjunto para evitar qualquer movimento.

Coloque o misturador A quatro no slide começando na extremidade. Certifique-se de que está alinhado corretamente com a ferramenta e cole o misturador ao longo da matriz. Deslize o puxão da extremidade do misturador para remover o conjunto do misturador deslizante.

Usando a ferramenta de zurrar, pressione ao longo da junta adesiva para garantir que ela esteja bem colada à lâmina. Pequenas bolhas de ar presas entre o adesivo e a lâmina podem ser vistas contra o fundo escuro. Reserve um tempo extra para remover essas bolhas com a ferramenta de zurrar.

A matriz agora está pronta para ser carregada. Use um perpet de deslocamento positivo para carregar 100 microlitros da amostra de hibridização. Empurre a ponta firmemente dentro da vigia e dispense lenta e suavemente para que o ar não fique preso na área da matriz.

Quando a amostra cobrir toda a matriz e o líquido começar a sair pela porta de ventilação, remova rapidamente a pipeta, libere apenas o êmbolo. Assim que a ponta estiver longe da lâmina, aplique suavemente o excesso de líquido em ambas as portas, tomando cuidado para não retirar a amostra da própria câmara. Em seguida, cubra as vigias com adesivos usando uma pinça.

Coloque a corrediça na estação de hibridização e verifique se os orifícios da bexiga estão posicionados corretamente sobre os anéis de vedação. Isso garantirá a mistura adequada durante a hibridização. Feche a tampa deslizante e a tampa da estação.

Defina a estação para o modo de mistura B e hibridize a matriz a 65 graus Celsius por 17 horas. Uma vez terminado o prato de vidro de enchimento rotulado como A com tampão de lavagem um, o prato deve ser grande o suficiente para segurar a ferramenta de desmontagem do conjunto e permitir algumas manobras também. Todas as lavagens devem ser feitas em vidraria, pois o plástico tende a lixiviar compostos, resultando em alto fundo na matriz.

Coloque uma grade deslizante e uma barra de agitação em um prato de coloração. Rotulado B, encha o prato com tampão de lavagem um cobrindo a grelha e coloque o prato em uma placa de agitação em temperatura ambiente. Além disso, adicione uma barra de agitação em uma mancha vazia rotulada como C e coloque em uma placa de agitação.

Remova a matriz da estação de hibridização e coloque-a na ferramenta de desmontagem da montagem. Mergulhe todo o conjunto no prato enquanto segura a ferramenta de desmontagem do conjunto e a corrediça dos lados opostos com uma mão. Retire cuidadosamente o misturador A four, tomando cuidado para não arranhar a área da matriz.

Coloque rapidamente a corrediça na grelha e na placa de coloração B.A exposição ao ar deve ser minimizada, pois o corante SCI five é sensível ao ozônio. Lave a borracha por um minuto, mexendo em velocidade média. Encha o prato de coloração C com tampão de lavagem pré-aquecido dois.

Transfira as lâminas e lave por um minuto. Após a lavagem muito lentamente, remova a grade deslizante da mancha C para minimizar as gotículas deixadas para trás na lâmina. Seque a lâmina girando por dois minutos.

Em seguida, coloque a lâmina em um tubo cônico de 50 mililitros e encha com varredura de gás argônio imediatamente usando o scanner de 4.000 B de dispositivos moleculares para evitar a perda de sinal mostrada. Aqui estão exemplos de quatro amostras de RNA isoladas do cérebro humano. A qualidade da amostra de tecido tumoral foi avaliada usando o bioanalisador 2.100 em um chip de RNA 6.000.

Pontas de seta sólidas e abertas indicam a posição das espécies 18 s e 28 S-R-R-N-A, respectivamente. O número de integridade do RNA ou RIN é uma medida quantitativa da qualidade do RNA boa qualidade Total. As amostras de RNA devem produzir apenas dois picos principais quando executadas em um bioanalisador para controle de qualidade correspondente às duas principais espécies de RNA ribossômico.

Alguma degradação de RNA aparecerá como um esfregaço antes do primeiro pico de RNA ribossômico e um pico significativamente mais baixo para 28 S-R-R-N-A severamente degradado. O RNA de baixa qualidade mostrará um pico amplo ou uma série de picos em tempos de baixa retenção. Enquanto os dois picos de RNA ribossômico serão de intensidade muito baixa ou não identificáveis.

Matrizes de boa qualidade devem produzir sinal alto em valores de PMT relativamente baixos. Espera-se que a maioria dos transcritos esteja presente em níveis semelhantes na amostra experimental e de referência. Mudanças massivas e generalizadas na expressão gênica provavelmente não terão qualquer significado biológico.

Portanto, a maior parte da matriz deve parecer amarela em vez de verde ou vermelha. Os sinais de boa qualidade também devem estar em uma faixa dinâmica de modo que os histogramas de sinal se sobreponham totalmente, conforme visto no gráfico de dispersão da imagem da matriz. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um experimento de microarray usando um aparelho de hibridização automatizado.